植酸酶體外降解米糠粕中植酸的工藝研究

楊 華 ， 梁麗萍 ， 陳雪嬌 ， 張媛媛 ， 馬金鵬 ， 權(quán)志中 ， 楊 寧 ， 宣 麗

（1.沈陽市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)服務(wù)中心＜沈陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院＞，遼寧沈陽 110025；2.遼寧康普利德生物科技有限公司，遼寧鐵嶺 112600；3.遼寧省飼料預(yù)消化專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧鐵嶺 112600）

為適應(yīng)大宗飼料原料供需趨緊的形勢， 提升原料利用效率，立足國情構(gòu)建新型日糧配方結(jié)構(gòu)，加快推進玉米、豆粕減量替代，開發(fā)非常規(guī)性飼料資源已成為當(dāng)前研究的熱點。 米糠粕是大米加工的副產(chǎn)品，資源豐富，價格低廉，含有較高的營養(yǎng)成分，可以作為玉米豆粕減量替代的原料之一（曹康寧，2019）。但是由于米糠粕中非淀粉多糖（賈素巧等，2019）和植酸（張抒愛等，2021）等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較高， 用量過高往往會影響飼糧整體養(yǎng)分消化， 導(dǎo)致畜禽生產(chǎn)性能下降 （韓萍萍等，2020；Sanchez 等，2019；孫偉武等，2017；葉永青和羅小溪，2017；錢利純和尹兆正，2005），在應(yīng)用時比例受到限制。

植酸是米糠粕中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子， 比例高達 8%（馬澤林，2017；Casas 和 Stein，2016）。 由于植酸化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定， 難以通過加熱等物理處理方法破壞， 在動物體內(nèi)也沒有相應(yīng)的酶系能消化降解。目前主要是通過在飼料中添加植酸酶，在動物體內(nèi)對植酸進行降解， 而且得到了極廣泛的應(yīng)用 （Ranjan 等，2021；Neto 等 ，2021；Maas 等 ，2020； 紀(jì)婷婷等，2017； 周定勇，2015；Kumar 等，2012）。 然而，酶制劑在體內(nèi)的作用效果只能通過飼養(yǎng)試驗生產(chǎn)性能的表現(xiàn)來反向評估。 Rosenfelder-Kuon 等（2020a）研究表明，隨著植酸酶的添加，雖然在豬的糞便中，植酸的回收率很低，但豬的平均磷消化率穩(wěn)定在65%，并且在高水平添加植酸酶的情況下， 豬全腸道磷消化率也不超過60%。因此，有必要尋求獲得更高磷消化率的處理技術(shù)（Rosenfelder-Kuon 等，2020b）。

飼料預(yù)消化技術(shù)是為了提高飼料原料的消化吸收率，在動物體外，根據(jù)不同原料的具體特性，模擬動物的消化過程， 進行的特定化處理的生物飼料加工技術(shù)。 酶解預(yù)消化是將原料、酶制劑、水混合，在一定的作用條件下，對目的物進行處理的一種飼料預(yù)消化手段，過程可控制，結(jié)果更明確，在原料預(yù)處理方面受到普遍關(guān)注。 本試驗采用酶解的手段，用植酸酶體外酶解米糠粕，通過單因素和正交試驗觀察植酸的降解程度， 以期為后續(xù)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 供試材料：米糠粕由遼寧康普利德生物科技有限公司提供， 含粗蛋白質(zhì)16.9%、 粗脂肪 1.38%、 粗灰分 11.9%、 總磷1.55%、粗纖維8.0%、中性洗滌纖維33.3%、酸性洗滌纖維10.4%、酸性洗滌木質(zhì)素3.3%。 植酸酶1、植酸酶 2、植酸酶 3（活力均為 1.0×104U/g）來自遼寧省飼料預(yù)消化專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心實驗室。

供試試劑：濃鹽酸、硫酸鈉、磺基水楊酸、三氯化鐵、氫氧化鈉，分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；植酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，純度98%（北京譜析科技有限公司）。

1.2 主要儀器 UV-1700 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；HJ-M6 型水循環(huán)磁力攪拌水浴鍋 （金壇市城西春蘭實驗儀器廠）；STARTER 3100 型 pH 計、CP 214 型電子天平 （上海奧豪斯儀器有限公司）；SHA-B 型水浴恒溫振蕩器（金壇市精達儀器制造廠）；FW177 型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SC-3614 型低速離心機 （安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；101FA-0型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海樹立儀器儀表有限公司）。

1.3 植酸的測定 稱取1 g 米糠粕、酶解米糠粕樣品，精確至0.0001 g，置于100 mL 具塞三角瓶中， 加入 40 mL 的 1.2% HCl·10% Na2SO4溶液，于室溫下振蕩 2 h，4000 r/min 離心 20 min， 上清液于4 ℃冰箱中備用待測（傅啟高等，1997）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 精確吸取0.1 mg/mL 植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6 支 25 mL具塞試管中，用蒸餾水補足至5 mL，混勻后，加入4 mL 的 0.3%磺基水楊酸·0.03% FeCl36H2O 溶液，搖勻，放置15 min 后，于500 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，植酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

取稀釋到一定濃度的植酸提取液5 mL 于25 mL 具塞試管中，其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，測其吸光度， 并從回歸方程計算出試液中植酸含量。

式中：m1為酶解前米糠粕中植酸的百分含量；m0為酶解后米糠粕中植酸的百分含量。

1.4 試驗設(shè)計 能夠準(zhǔn)確測定米糠粕酶解pH的最低加水量為：料水比 1：3（g/mL），本試驗固定酶解反應(yīng)的料水比為1：3， 首先研究不同pH條件下3個植酸酶的酶解效果，在此基礎(chǔ)上探究不同酶解溫度、酶添加量、酶解時間對米糠粕中植酸的降解效果。 在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化酶解條件，從而確定植酸酶體外酶解的工藝條件。

1.5 單因素試驗

1.5.1 植酸酶在不同pH 條件對米糠粕中植酸降解率的影響 稱取30.00 g 米糠粕若干份于250 mL燒杯中，加蒸餾水90 mL，用1 mol/L 的HCl 調(diào)pH為 3.9、4.3、4.7、5.1、5.5， 植酸酶 1、2、3添加量均為1.2%（酶質(zhì)量/米糠粕質(zhì)量），50 ℃酶解 2.0 h。 反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶，樣品85 ℃烘干，粉碎后提取植酸，測定植酸含量并計算植酸降解率。

1.5.2 酶解溫度對米糠粕中植酸降解率的影響料水比1：3，酶解 pH 4.7，植酸酶3 添加量 1.2%，酶解時間 2.0 h，酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃，其余操作同1.5.1。

1.5.3 酶添加量對米糠粕中植酸降解率的影響料水比 1：3，酶解 pH 4.7，酶解溫度 50 ℃，酶解時間 2.0 h， 植酸酶 3 添加量 0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%、2.4%，其余操作同 1.5.1。

1.5.4 酶解時間對米糠粕中植酸降解率的影響料水比 1：3，酶解 pH 4.7，酶解溫度 50 ℃，植酸酶3 添加量 1.8%， 酶解時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，其余操作同 1.5.1。

1.6 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以植酸降解率為指標(biāo)，對植酸酶3 酶解pH、酶解溫度、酶添加量以及酶解時間設(shè)計四因素三水平L9（34）正交優(yōu)化試驗， 以確定植酸酶3 體外酶解米糠粕的工藝條件。

1.7 植酸降解驗證試驗 對正交試驗獲得的最佳酶解條件進行驗證試驗， 并參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品中肌醇的測定GB 5009.270-2016 檢測肌醇含量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 進行整理后， 采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析方法（one-way ANOVA），并利用 Duncan’s 法進行多重比較，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以吸光度為縱坐標(biāo)，植酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 植酸酶在不同pH 條件對米糠粕中植酸降解率的影響 本試驗首先研究了不同pH 條件下3 種植酸酶的酶解效果，結(jié)果如圖2 所示。 植酸酶1、植酸酶2、植酸酶3 對米糠粕中植酸的降解率均是隨著pH 的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH 為4.7 時， 米糠粕中植酸的降解率最高，分別為86.9%、89.4%、92.8%。 pH 3.9 時的植酸降解率均高于pH 5.5，表明只有當(dāng)酶解體系酸性降低到一定程度時， 植酸酶對米糠粕中植酸的降解效果才更優(yōu)。植酸酶3 不僅酶解效果最好，且對酸性環(huán)境的耐受力也最強， 因此選擇該酶進行后續(xù)試驗。

圖2 不同pH 條件下3 種植酸酶對米糠粕中植酸降解率的影響

2.2.2 酶解溫度對米糠粕中植酸降解率的影響由圖3 可知，隨著酶解溫度的升高，植酸降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在50 ℃時，植酸降解率最高， 低于50 ℃時的酶解效果優(yōu)于高于50 ℃的酶解效果，結(jié)合多重比較分析結(jié)果，選取40、45、50 ℃三個水平進行正交試驗。

圖3 酶解溫度對米糠粕中植酸降解率的影響

2.2.3 酶添加量對米糠粕中植酸降解率的影響由圖4 可知， 當(dāng)植酸酶3 添加量從0.3%增加到1.2%時，植酸降解率差異顯著，隨著酶量繼續(xù)增加到1.8%，植酸降解率沒有繼續(xù)升高，當(dāng)酶量增加到2.1%時， 植酸降解率開始出現(xiàn)下降趨勢，為了進一步考察最適酶添加量， 選取1.2%、1.5%、1.8%三個水平進行正交試驗。

圖4 酶添加量對米糠粕中植酸降解率的影響

2.2.4 酶解時間對米糠粕中植酸降解率的影響由圖5 可知， 當(dāng)酶解時間從0.5 h 增加到1.5 h時，植酸降解率差異顯著，隨著酶解時間繼續(xù)延長，植酸降解率開始有下降趨勢，當(dāng)酶解時間增加到3.5 h 時，植酸降解率達到最大值，之后又出現(xiàn)下降趨勢， 為了進一步考察最適酶解時間， 選取1.5、2.0、3.5 h 三個水平進行正交試驗。

圖5 酶解時間對米糠粕中植酸降解率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果分析 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗，試驗設(shè)計和結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。 由表1、表2 數(shù)據(jù)可知，酶解pH（P ＜ 0.001）、酶解溫度（P ＜ 0.001）、酶解時間（P ＜0.001）均是影響植酸降解率的極顯著因素，酶添加量（P ＜0.05）是影響植酸降解率的顯著因素。植酸酶3 體外降解米糠粕中植酸的最適條件是A2B3C3D3，即酶解 pH 4.7、酶解溫度 50 ℃、植酸酶添加量1.8%、酶解時間3.5 h。

表1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表2 正交試驗方差分析

2.4 酶解驗證試驗結(jié)果 將米糠粕與水按照1：3（g/mL） 的比例混合， 用 1 mol/L 的 HCl 調(diào) pH 為4.7， 加入1.8%（酶的質(zhì)量/米糠粕質(zhì)量） 的植酸酶3，50 ℃酶解 3.5 h，反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶，樣品85 ℃烘干，測定植酸降解率為94.2%，肌醇含量為1.9%。 表明米糠粕中85%以上的植酸均轉(zhuǎn)化為肌醇，本研究確定的酶解工藝在顯著降解米糠粕中植酸抗?fàn)I養(yǎng)因子的同時，提高了米糠粕的營養(yǎng)價值。

3 結(jié)論

本研究通過單因素和正交試驗， 確定了米糠粕中植酸體外降解的最優(yōu)酶解條件為： 植酸酶3添加量1.8%、酶解pH 4.7、酶解溫度50 ℃、酶解時間3.5 h。 該條件下， 米糠粕中植酸降解率為94.2%，肌醇生成量為1.9%。