液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法用于鮮桑葉中31種農(nóng)藥殘留分析＊

張國平，湯逸飛，孫海燕，黃 芳，屠雨晨，陳文海，戴建忠，陳欣慰

（1. 嘉興市農(nóng)業(yè)綜合檢驗(yàn)檢測中心，浙江 嘉興 314050； 2. 海寧市經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)服務(wù)站，浙江 海寧 314400）

桑樹在我國較為常見，桑園成片綜合開發(fā)，其葉片可養(yǎng)蠶繅絲和食藥兩用[1]，因此桑園中的桑樹盡量不用一般殺蟲劑農(nóng)藥，而多使用安全間隔期短[2]的備案農(nóng)藥如甲基硫菌靈等殺菌劑農(nóng)藥，因此其他農(nóng)藥在桑葉中如有檢出殘留則多為農(nóng)藥污染。鮮桑葉是指桑樹長出的新鮮葉片，此時(shí)的桑葉含水量較多，農(nóng)藥殘留檢測中有利于消除基質(zhì)干擾；更重要的是，春季的鮮桑葉采摘時(shí)其他農(nóng)作物農(nóng)藥使用還未達(dá)到高峰，空氣和灌溉用水中污染還未完全擴(kuò)散，桑葉養(yǎng)蠶中毒事件較少。以春季鮮桑葉為基質(zhì)，對鮮桑葉中31種農(nóng)藥污染進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證并通過校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，技術(shù)上可提供對特定的農(nóng)藥污染的檢出，進(jìn)而可能導(dǎo)致蠶中毒進(jìn)行提前預(yù)警，對蠶桑生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

鮮桑葉采集設(shè)定在2021年4月～5月，選取嘉興地區(qū)前期已飼養(yǎng)過家蠶而未發(fā)生家蠶中毒事件的蠶?；?家共2批次樣品，隨機(jī)摘取葉片，每份樣品不少于1 kg，每次采樣后將樣品切碎后進(jìn)行勻漿并貯存于低溫冰箱中以待處理。

1.2 試劑和儀器

樣品前處理中，提取試劑為4.0 g 硫酸鎂、1.0 g氯化鎂、1.0 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉；凈化試劑為150 mg 乙二胺-N-丙基硅烷、15 mg 石墨化炭黑和885 mg 硫酸鎂。其他材料包括：超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）、乙腈（色譜級，美國TEDIA 公司）、甲酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、1 mol·L-1乙酸銨溶液（上海麥克林生化科技有限公司）和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京曼哈格生物科技有限公司）。

樣品檢測流程中，超高效液相色譜/四級三重桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-20AD/QTRAP4500，日本島津公司/美國AB Sciex公司）為分析儀器；垂直振蕩器（HVS-10M，天津恒奧科技發(fā)展有限公司）、多管旋渦混合儀（BTV-100，上海一恒科技有限公司）、離心機(jī)（ROTINA 420R，德國Hettich 公司）、電子天平（Scout SE-SE202F，美國OHAUS 公司）和旋渦混合器（XW-80A，上海精密科學(xué)儀器有限公司）為其他重要儀器。

1.3 檢測流程和方法

檢測流程中樣品前處理步驟：量取樣品10.0 g，加入10 mL 乙腈溶液，加入提取鹽試劑包和1 枚陶瓷均質(zhì)子，振搖1 min，4200 r·min-1離心5 min；分別取上清提取液和乙腈各3.0 mL 轉(zhuǎn)移到凈化離心管中，渦旋1 min，4200 r·min-1離心5 min；取上清凈化液，0.22 μm水膜過濾待測液，等待分析儀器進(jìn)樣。

檢測方法中，液相色譜柱采用Kinetex Biphenyl柱（2.6 μm，2.1 mm×100 mm），流動相A 為（0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液），B 為乙腈，流速0.5 mL·min-1，柱溫35℃，進(jìn)待測液1 μL。檢測過程流動相初始條件為A∶B=95∶5，保持4 min；A∶B=95∶5→80∶20，運(yùn)行0.5 min；A∶B=80∶20，保持3.5 min；A∶B=80∶20→60∶40，運(yùn)行0.5 min；A∶B=60∶40，保持2.5 min；A∶B=60∶40→36∶64，運(yùn)行0.5 min；A∶B=36∶64，保持3.5 min；A∶B=36∶64→5∶95，運(yùn)行1 min；A∶B=5∶95，保持4 min；A∶B=5∶95→95∶5，運(yùn)行0.1 min；A∶B=95∶5，保持15 min。MRM模式下，正離子電噴霧離子源（ESI+）設(shè)定源參數(shù)為噴霧電壓（IonSpray Voltage）、輔助氣1（GS1）、輔助氣2（GS2）、輔助氣加熱溫度（TEM）和氣簾氣（CUR）均為默認(rèn)設(shè)置[3]。檢測儀器獲得的數(shù)據(jù)通過工作站MultiQuant進(jìn)行圖像處理和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮桑葉基質(zhì)對數(shù)據(jù)分析的影響

鮮桑葉基質(zhì)在檢測中可能存在假陽性，因此本研究對鮮桑葉基質(zhì)進(jìn)行檢測。提取離子流圖（XIC）結(jié)果表明，鮮桑葉基質(zhì)采用QuEChERS 試劑包不會產(chǎn)生假陽性。鮮桑葉加標(biāo)基質(zhì)的峰形良好，沒有雜峰干擾并且響應(yīng)較大的離子對為定量離子對。鮮桑葉基質(zhì)中31 種農(nóng)藥的總離子流（TIC）如圖1 所示。

圖1 鮮桑葉基質(zhì)中31種農(nóng)藥（100 μg/L）的總離子流圖Fig. 1 Total Ion Graph of 31 Pesticides (100 μg/L) in Fresh Mulberry Leaves

2.2 農(nóng)藥質(zhì)量參數(shù)驗(yàn)證

分別精密吸取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用鮮桑葉基質(zhì)甲醇溶液配制成10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、150 μg·L-1和250 μg·L-1系列濃度，按照保留時(shí)間順序分段檢測，采用定量離子對的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果表明，31種農(nóng)藥在10 μg·L-1～250 μg·L-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表1），其線性回歸曲線的相關(guān)系數(shù)r在0.9901～0.9981之間。

表1 31種農(nóng)藥在鮮桑葉基質(zhì)中的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear Regression Equations and Correlation Coefficients of 31 Pesticides in Fresh Mulberry Leaves

2.3 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

3種加標(biāo)樣品為向空白鮮桑葉樣品中分別添加低濃度（0.01 mg·kg-1）、中濃度（0.10 mg·kg-1）和高濃度（0.25 mg·kg-1）3種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)過提取和凈化步驟處理后，液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜上樣，每個(gè)樣品連續(xù)測試3針，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，根據(jù)XIC 以獲得每種農(nóng)藥的峰面積用來計(jì)算回收率（P）和精密度（RSD），見圖2。

圖2 31種農(nóng)藥在鮮桑葉基質(zhì)中回收率和精密度的平均值（n=3）Fig. 2 Average Recoveries and Precision Rates of 31 Pesticides in Fresh Mulberry Leaves (n=3)

結(jié)果低濃度（0.01 mg·kg-1）p 范圍為69.14%～127.81%，RSD 為0.92%～29.75%；中濃度（0.1 mg·kg-1）p 范圍為75.59%～126.28%，RSD 為0.44%～20.57%；高濃度（0.25 mg·kg-1）p 范圍為70.43%～108.61%，RSD 為0.38%～16.51%。該檢測方法準(zhǔn)確度和精密度相對滿足要求。

3 討論和小結(jié)

雖然桑葉藥材產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留檢測分析有一定數(shù)量的報(bào)道[4，5]，但鮮桑葉含水量相對更多，因此兩者檢測方法特別是前處理方法并不能混用。目前，鮮桑葉的農(nóng)藥多殘留檢測研究報(bào)道多以定性為主的農(nóng)藥殘留快速檢測手段[6，7]，檢測項(xiàng)目有限。因此，本研究嘗試將鮮桑葉樣品經(jīng)乙腈提取，以QuEChERS 法為前處理技術(shù)，在質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下，進(jìn)行基質(zhì)外標(biāo)法定量，用液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定鮮桑葉中31 種農(nóng)藥殘留，檢測結(jié)果顯示：在10 μg·L-1～250 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對加標(biāo)量分別為0.01 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1和0.25 mg·kg-1的空白基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)回收率相對滿足準(zhǔn)確度和精密度要求。該方法可及時(shí)篩查桑葉中農(nóng)藥多殘留情況，為家蠶飼養(yǎng)用桑葉安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

實(shí)地走訪兩家成片桑園也發(fā)現(xiàn)，首先，桑園遠(yuǎn)離其他農(nóng)作物種植基地，其他種類農(nóng)藥污染累積的來源較少；其次，桑園外圍的桑樹既可用于景觀，又可對所在及周邊的土壤、灌溉水和空氣中農(nóng)藥污染風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行必要的物理阻隔，桑園深處的桑葉用于蠶桑或果桑生產(chǎn)[8]；第三，桑園土壤和水環(huán)境中微生物對于稀釋農(nóng)藥污染也具有一定的自凈能力[9]。用于蠶桑生產(chǎn)的兩批次樣品中沒有檢測出31 種農(nóng)藥殘留，抽樣分析證明桑園農(nóng)藥污染風(fēng)險(xiǎn)較低[10]。

最后，鑒于成片桑園春季的鮮桑葉農(nóng)藥污染較少，因此可以將桑園前期已飼養(yǎng)過蠶而未發(fā)生蠶中毒事件的桑葉作為桑葉的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提前進(jìn)行制備冷凍保存，檢測時(shí)可作為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，減少定量檢測中基質(zhì)干擾，增加定量準(zhǔn)確度，從而達(dá)到快速定量篩查的目的。