不同類型稻田亞硝酸型CH4厭氧氧化潛力的比較研究

薛夢(mèng)琪 周聰 饒旭東 謝晴 張耀鴻

0 引言

濱海濕地處于海陸交錯(cuò)帶,具有海洋性和陸地性雙重特征,當(dāng)前受人類活動(dòng)的影響日益嚴(yán)重．隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口的增長(zhǎng),人類對(duì)土地的需求日趨迫切,濱海灘涂圍墾造田成為解決土地問題的有效途徑．圍墾后的濕地自然條件相對(duì)穩(wěn)定，不再受海水潮汐的影響,形成與自然灘涂濕地明顯不同的獨(dú)特生境．在此基礎(chǔ)上,人工灌溉、耕作、施肥、水稻種植等農(nóng)業(yè)措施加速了圍墾稻田的熟土化進(jìn)程，即由海洋性灘涂逐漸向陸地性農(nóng)田演替,土壤的物理、化學(xué)和生物特征發(fā)生了顯著改變,但與內(nèi)陸性稻田存在著明顯差別．這種圍墾植稻驅(qū)動(dòng)的熟土化作用對(duì)土壤甲烷氧化過程可能會(huì)產(chǎn)生重要影響．那么,處于熟土化進(jìn)程中的圍墾稻田,其甲烷厭氧氧化潛力有何特征?與典型內(nèi)陸性稻田相比,其甲烷厭氧氧化速率變化的主控因素是什么?是否與功能微生物群落結(jié)構(gòu)及數(shù)量特征之間存在內(nèi)在關(guān)系?

鑒于此,本試驗(yàn)選取兩個(gè)不同類型的稻田:微堿性N貧瘠的長(zhǎng)江口崇明圍墾稻田和微酸性N豐富的南京稻田,研究其表層和深層土壤的CH4厭氧氧化速率及nDAMO細(xì)菌的豐度,探明在土壤母質(zhì)、pH值、N水平以及鹽分等差異較大的稻田土壤環(huán)境中,n-DAMO反應(yīng)速率及其微生物學(xué)機(jī)理,進(jìn)一步闡明其分異規(guī)律,為稻田CH4減排提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

本研究選取上海市崇明島東灘濕地(121.92°E,31.50°N)圍墾16年稻田(WK)與南京信息工程大學(xué)農(nóng)業(yè)氣象試驗(yàn)站(118.86°E,32.16°N)荒地改種稻15年稻田(NJ)．在每個(gè)稻田內(nèi)以S形設(shè)置6個(gè)采樣點(diǎn),各采樣點(diǎn)間距15 m．用土鉆取0～60 cm深度的土柱,取出0～10 cm和50～60 cm的土層樣品,并將相同深度的土樣充分混合,放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤全氮(TN)含量采用半微量凱氏定量法測(cè)定．土壤總有機(jī)碳(TOC)含量采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法測(cè)定．土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量用2 mol/L KCl 溶液浸提后,采用AA3 流動(dòng)分析儀測(cè)定．土壤pH 值和EC值分別采用數(shù)字酸度計(jì)和電導(dǎo)儀測(cè)定．

1.3 厭氧CH4氧化速率測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后,用氣相色譜儀-質(zhì)譜儀連用法測(cè)定瓶中13CO2的產(chǎn)生量．處理1)為對(duì)照組,如果瓶中13CO2的相對(duì)豐度處于自然豐度水平(1.1%),說明試驗(yàn)結(jié)果可信度高;用處理3)減去處理2)中13CO2產(chǎn)生量,進(jìn)一步計(jì)算亞硝酸型厭氧甲烷氧化(n-DAMO)速率．

1.4 熒光定量PCR分析

用Fast DNA Spin Kit for Soil提取試劑盒 (MP Biomedicals,USA)提取土壤樣品中的總DNA．取部分DNA提取液用分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000 UV-Vis)測(cè)定DNA濃度和純度．土壤DNA保存于-80 ℃ 冰箱待用．

在CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad 公司)擴(kuò)增儀上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增．測(cè)定土壤樣品中總細(xì)菌和M.oxyfera菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)．總細(xì)菌基因擴(kuò)增所用引物為細(xì)菌V4+V5高變區(qū)通用引物515F/907R;M.oxyfera菌擴(kuò)增所用引物為qP1F/qP1R．反應(yīng)體系為20.0 μL,包括DNA樣品1.0 μL,Premix TaqTM10 μL,前后引物各1.0 μL,超純無菌水7.0 μL．?dāng)U增條件為:預(yù)變性95 ℃,10 min;變性95 ℃,30 s;退火55 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40個(gè)循環(huán)．根據(jù)質(zhì)粒梯度濃度制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)．

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,通過單因素方差分析及多重比較、相關(guān)性分析(Pearson)進(jìn)行土壤理化性質(zhì)、氧化速率、微生物豐度的差異性以及相關(guān)性檢驗(yàn),顯著水平α=0.05．

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型稻田土壤的理化性質(zhì)

表1 不同類型稻田土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of different paddy soils

2.2 稻田土壤的13CO2豐度變化和CH4厭氧速率

圖1 南京稻田和圍墾稻田土壤厭氧培養(yǎng)后的13CO2豐度變化Fig.1 13CO2 abundance in soils of Nanjing paddy and the reclaimed paddy

圖2 不同類型稻田土壤的亞硝酸鹽型厭氧CH4氧化速率Fig.2 Potential n-DAMO rate of different paddy soils

2.3 稻田土壤中M.oxyfera菌和總細(xì)菌的16S rRNA基因豐度

圖3 南京稻田和圍墾稻田中M.oxyfera菌和總細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)Fig.3 16S rRNA gene abundance of M.oxyfera-like bacteria and total bacteria in Nanjing paddy soil and the reclaimed paddy soil

對(duì)稻田土壤總細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行了測(cè)定．其變化范圍為(2.12～3.13)×108copies·g-1,比M.oxyfera細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)高出1個(gè)數(shù)量級(jí)．其中,南京稻田耕層土壤的總細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)顯著高于其他三個(gè)土樣．將M.oxyfera細(xì)菌與總細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)相比,可得出M.oxyfera細(xì)菌的相對(duì)豐度，發(fā)現(xiàn)南京稻田耕層和深層土壤M.oxyfera細(xì)菌相對(duì)豐度分別為1.5%和0.9%,圍墾稻田則分別為0.9%和0.4%．

2.4 厭氧CH4氧化速率與基因豐度和理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

對(duì)厭氧CH4氧化速率與M.oxyfera細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果表明,亞硝酸型厭氧CH4氧化速率與M.oxyfera細(xì)菌的16S rRNA基因豐度呈顯著正相關(guān)(圖4),說明功能微生物的數(shù)量很大程度上決定了土壤CH4厭氧氧化能力．

圖4 厭氧CH4氧化速率與功能微生物豐度的關(guān)系Fig.4 Relationship between n-DAMO rate and 16S rRNA gene abundance of M.oxyfera

表2 厭氧CH4氧化速率與土壤理化性質(zhì)的回歸方程Table 2 Regression relationship between n-DAMO rate (y)and soil characteristics (x)

3 討論

本試驗(yàn)采用13CH4同位素標(biāo)記法證實(shí)了在濱海圍墾稻田和內(nèi)陸南京稻田均發(fā)生了亞硝酸鹽型厭氧CH4氧化作用．本研究使用的13CH4的豐度為99%,而且起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)10%,這樣可以最大程度地降低厭氧培養(yǎng)過程中CH4產(chǎn)生過程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,具有較高的可信度．而且,本厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)置了只加Ar的對(duì)照處理,既可測(cè)試試驗(yàn)過程是否保持嚴(yán)格厭氧狀態(tài),又可測(cè)定厭氧過程CH4產(chǎn)生過程特征．結(jié)果顯示,所試兩個(gè)土樣在培養(yǎng)過程中CH4產(chǎn)生量極低,可以忽略不計(jì)．因此,本研究采用13CH4同位素標(biāo)記法測(cè)出的n-DAMO速率能客觀真實(shí)地反映出土壤的厭氧CH4氧化潛勢(shì)．其中,圍墾稻田土壤的n-DAMO 速率高于杭州灣濱海自然濕地的氧化速率(0.2～1.3 nmol ·g-1·d-1)[14],表明圍墾植稻熟土化過程會(huì)促進(jìn)亞硝酸鹽型厭氧CH4氧化作用．南京稻田土壤的n-DAMO速率與內(nèi)陸淡水濕地的氧化速率基本一致(1.8～3.6 nmol·g-1·d-1)[7],表明內(nèi)陸稻田與淡水濕地均表現(xiàn)出較高的n-DAMO速率．

本試驗(yàn)中,圍墾稻田土壤M.oxyfera-like細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)為(0.89～2.12)×107copies·g-1,其變化范圍與杭州灣濱海和長(zhǎng)江口灘涂濕地的數(shù)量級(jí)一致[10,14],且顯著低于南京稻田．不僅如此,M.oxyfera-like細(xì)菌的相對(duì)豐度也表現(xiàn)為圍墾稻田明顯低于南京稻田．相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),M.oxyfera-like細(xì)菌的基因拷貝數(shù)與n-DAMO速率、土壤總氮和礦質(zhì)態(tài)氮均呈顯著正相關(guān),說明M.oxyfera-like細(xì)菌的數(shù)量及其活性等生物學(xué)特性是導(dǎo)致n-DAMO速率產(chǎn)生空間變異的主控因素．然而,有報(bào)道發(fā)現(xiàn),內(nèi)陸湖泊沉積物中,M.oxyfera-like細(xì)菌的基因拷貝數(shù)與土壤TOC、總氮和礦質(zhì)態(tài)氮均呈顯著負(fù)相關(guān),暗示除了土壤理化性質(zhì)之外,可能還受到其他因素的重要影響,如厭氧氨氧化菌的競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)等．說明M.oxyfera-like細(xì)菌在不同類型土壤中分布規(guī)律不盡相同,受控因素較多,有待深入研究．

需要指出的是,稻田土壤CH4轉(zhuǎn)化過程及功能微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)受到諸多因素的影響,如水稻生育期、施肥量、農(nóng)田管理等．本研究選取了兩種不同類型的典型稻田進(jìn)行比較,僅能代表所試稻田土壤的厭氧CH4氧化潛勢(shì)．在此基礎(chǔ)上,需要從不同氣候帶采集更多不同類型的稻田土壤,深入研究典型稻田厭氧CH4氧化作用的本質(zhì)特征,為探索我國(guó)稻田溫室氣體減排措施提供科學(xué)依據(jù)．

4 結(jié)論

1)內(nèi)陸性稻田土壤厭氧CH4氧化速率顯著高于濱海圍墾稻田,其土壤C、N水平和功能微生物豐度是造成兩種類型稻田產(chǎn)生差異的主要原因．

2)兩種類型稻田中,耕層土壤的厭氧CH4氧化速率顯著高于深層土壤,其耕層土壤中功能微生物豐度高、活性氮豐富是CH4氧化潛力較高的重要原因．