體外模擬胃腸消化過(guò)程中四種茶葉活性成分及抗氧化性變化規(guī)律

劉靜敏,史靜蘭,魯 江,徐 歆,李 倩,陳小強(qiáng)

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430068)

紫娟是云南大葉群體茶樹(shù)品種中的一個(gè)變異品種,其芽、葉、莖都為紫色[8]。有研究表明,紫鵑茶的原花青素含量很高,具有極強(qiáng)的抗氧化能力[9-10]。中黃一號(hào)在春季發(fā)芽時(shí)新梢嫩葉葉色有可逆性黃化現(xiàn)象,相較于一般綠茶具有更高含量的氨基酸[11],且由于其形態(tài)特征的特異性、制茶品質(zhì)的優(yōu)異性和較強(qiáng)的適應(yīng)性,產(chǎn)品供不應(yīng)求,經(jīng)濟(jì)效應(yīng)顯著。白葉一號(hào)是安吉白茶的一個(gè)茶樹(shù)品種,其特異性主要表現(xiàn)在春季發(fā)芽時(shí)新梢嫩葉葉色的可逆性白化現(xiàn)象,在白化過(guò)程中新梢的葉綠素含量急劇下降,氨基酸含量明顯上升[12]。福鼎大白茶作為傳統(tǒng)茶葉的一個(gè)代表,同時(shí)也是全國(guó)茶葉區(qū)試標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照種,種植面積最廣[13]。

Green等[14]對(duì)綠茶進(jìn)行體外模擬胃腸消化,采用高效液相色譜法對(duì)消化前后的兒茶素進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果發(fā)現(xiàn),飲茶習(xí)慣可能影響兒茶素的消化,并可能導(dǎo)致不同的生理特征。Tenore等[15]將同一茶樹(shù)品種采用不同加工方式生產(chǎn)的白茶、綠茶與紅茶,通過(guò)模擬胃腸消化、腸道滲透和血漿蛋白相互作用對(duì)比三種茶葉中兒茶素的變化發(fā)現(xiàn),白茶中兒茶素在口服條件下具有良好的穩(wěn)定性,具有最好的腸道生物可接受性和生物利用度,并可能在調(diào)節(jié)血糖和血漿膽固醇方面發(fā)揮重要作用。目前對(duì)茶葉活性成分多酚類(lèi)物質(zhì)在消化過(guò)程中的含量及抗氧化性變化規(guī)律的研究主要集中在兒茶素,而尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)茶葉中黃酮、原花青素類(lèi)物質(zhì)的相關(guān)報(bào)道。

為總結(jié)茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)及其抗氧化活性變化規(guī)律，本文采用紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)和福鼎大白作為研究對(duì)象,用體外模擬胃腸消化的方法,測(cè)定四種茶葉的多酚、黃酮、原花青素的含量和總結(jié)變化規(guī)律,以及分析消化過(guò)程對(duì)抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)、福鼎大白 江蘇省茶葉研究所玉山基地提供(江蘇宜興),于2018年4月份手工采摘,采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉,并通過(guò)在120 ℃下烘干半小時(shí)處理獲得成品,粉碎(過(guò)60 目)于4 ℃保存;香草醛、濃鹽酸、乙醇 百靈威科技有限公司;兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品 南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司;氯化鈉、甲醇、膽鹽3號(hào)、碳酸鈉、Folin-酚試劑、硝酸鋁、乙酸鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胃蛋白酶(456 U/mg)、胰蛋白酶(100～500 U/mg)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

T6型新世紀(jì)紫外光分光光度計(jì) 尤尼科儀器有限公司;DK-S22型恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;RJ-TLT-16G離心機(jī) 無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司;GZX-9140 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;ME104E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;KQ-300E超聲波清洗機(jī) 上海之信儀器有限公司;JYL-CO2OE九陽(yáng)料理機(jī) 九陽(yáng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶湯提取 根據(jù)傳統(tǒng)飲茶習(xí)慣,分別稱取4種茶粉(紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)和福鼎大白)10 g,置于500 mL 90 ℃水中,持續(xù)攪拌5 min,然后將茶湯過(guò)濾并冷卻,各茶湯定容至500 mL。

1.2.2 模擬體外消化 為了研究茶湯中活性成分及抗氧化變化規(guī)律,將1.2.1方法提取得到的茶湯溶液300 mL置于500 mL的錐形瓶中,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0,加入0.6 g NaCl,然后加入0.378 g胃蛋白酶,用保鮮膜封口后,再將錐形瓶置于37 ℃水浴中振蕩2 h。模擬胃部消化結(jié)束后,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)消化液pH至7.0,然后加入20 mg的胰蛋白酶和125 mg的膽鹽,然后在相同水浴條件下反應(yīng)2 h。胃腸消化期間每隔30 min取一次樣,將取出的各消化液于90 ℃條件下加熱1 min,使消化酶失活,6000 r/min,離心6.5 min后,取上清液在4 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆肹6,16]。

1.2.3 總多酚含量的測(cè)定 Folin-酚試劑比色法[17]測(cè)定總多酚,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。分別移取四種茶葉樣品各階段消化液1 mL于試管中,在每個(gè)試管中分別加入5 mL 10%的Folin-酚試劑,混合后在3～8 min內(nèi)再加入4 mL 7.5%的Na2CO3溶液。搖勻后在室溫條件下避光放置1 h后,于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo),沒(méi)食子酸工作液的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為y=0.0097x+0.0043,R2=0.9999。

鰻魚(yú)帶肉骨→預(yù)處理→凈鰻魚(yú)帶肉骨→烘干→干鰻魚(yú)帶肉骨→粉碎、均質(zhì)→鰻魚(yú)肉骨粉→水提→鰻魚(yú)肉骨粉料液→酶解→酶解液→均質(zhì)→噴霧干燥→成品。

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定 根據(jù)Zielinski等[18]Al(NO3)3-CH3COOK顯色法測(cè)定總黃酮,分別移取四種茶葉樣品各階段消化液1 mL于試管中,先加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液,再加1 mL 0.98%的醋酸鉀溶液。搖勻后在室溫條件下避光放置1 h,于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以兒茶素濃度為橫坐標(biāo),兒茶素工作液的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為y=0.527x+0.0082,R2=1。

1.2.5 原花青素含量的測(cè)定 香草醛-甲醇-鹽酸顯色法測(cè)定原花青素[19],分別移取四種茶葉樣品各階段消化液0.5 mL于試管中,先加入2.5 mL 1%的香草醛-甲醇溶液,再加入2.5 mL 30%的鹽酸溶液,用上述方法蒸餾水代替樣品制備空白試樣,搖勻后在室溫條件下避光放置1 h,于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以兒茶素濃度為橫坐標(biāo),兒茶素工作液的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為y=1.0284x+0.0073，R2=1。

1.2.6 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 根據(jù)Ksouri等[20]、Chang等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定,稍作改動(dòng)。取4 mL 7 mmol/L ABTS原液,加入88 μL 140 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液,混合均勻后暗處?kù)o置12～16 h,0 ℃保存?zhèn)溆?。將ABTS溶液用無(wú)水乙醇稀釋,使其在734 nm處吸光值為0.70±0.02,得到ABTS工作液。準(zhǔn)確移取3 μL不同質(zhì)量濃度(100～400 μg/mL)的樣品液與237 μL ABTS工作液混合,于室溫下避光反應(yīng)30 min,測(cè)定反應(yīng)液在734 nm處的吸光值,以無(wú)水乙醇作為空白,平行測(cè)定3次,取其平均值,并用0.5 mg VC/mL溶液作對(duì)照。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 測(cè)定方法參考Gorjanovic等[22]的方法,稍作改動(dòng)。將10 μL不同質(zhì)量濃度(100～400 μg/mL)的樣品液與100 μL 0.1 mmol/L甲醇-DPPH自由基充分混勻后,置于避光處反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光值,以甲醇作為空白,平行測(cè)定3次,取其平均值,并用0.5 mg VC/mL溶液作對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3次,得到的數(shù)據(jù)經(jīng)OriginPro-9軟件處理,采用Dunnett’st檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析,以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分含量分析

4種茶葉提取液中多酚、黃酮及原花青素含量見(jiàn)表1。消化前茶葉提取液中酚類(lèi)物質(zhì)含量范圍為2.03(白葉一號(hào))～2.32 mg GAE/mL(福鼎大白)。總黃酮含量范圍為2.41(紫娟)～3.41 mg GA/mL(福鼎大白),其中多酚及總黃酮含量福鼎大白茶最高。原花青素含量范圍為0.16(中黃一號(hào))～0.78 mg GA/mL(紫鵑),其中紫娟茶葉提取液中原花青素含量顯著高于其他茶葉提取液含量(P<0.05)。金孝芳等[23]研究認(rèn)為中黃一號(hào)原花青素含量略低于其他茶葉品種,與本次實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)相似。呂海鵬等[24]推測(cè)紫娟茶中原花青素含量豐富,也與本研究變化一致。然而紫娟多酚含量較其他文獻(xiàn)所述含量偏低可能是由于地區(qū)差異所導(dǎo)致[25]。

表1 4種茶葉提取液抗氧化活性成分含量Table 1 Antioxidant active ingredients content in 4 kinds of tea soup

注:同列小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 模擬體外消化過(guò)程中活性物質(zhì)含量及抗氧化能力變化分析

2.2.1 體外模擬消化過(guò)程中多酚變化規(guī)律 4種茶葉提取液在模擬胃、腸消化過(guò)程中多酚變化如圖1所示。經(jīng)過(guò)胃消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)多酚含量分別下降7.27%、6.36%、16.95%、16.76%。再經(jīng)過(guò)腸消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)多酚含量較原始茶葉提取液分別下降12.59%、13.44%、14.73%、13.30%。

圖1 4種茶葉提取液在模擬胃、 腸消化過(guò)程中多酚含量變化Fig.1 Changes of polyphenols in four kinds of tea soup during simulated gastric and intestinal digestion

通過(guò)對(duì)胃消化階段和腸消化階段的比較,發(fā)現(xiàn)在胃消化階段(0～2 h),福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)提取液中多酚含量下降趨勢(shì)較為明顯,原因可能是多酚類(lèi)物質(zhì)在胃部消化過(guò)程中發(fā)生降解,導(dǎo)致多酚含量下降。劉翼翔等[26]采用體外消化模型模擬人體胃腸對(duì)藍(lán)莓多酚的消化,發(fā)現(xiàn)胃消化后藍(lán)莓多酚的總酚含量與總花色苷含量都沒(méi)有發(fā)生明顯變化,這與本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同,需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。而在腸消化階段(2～4 h),福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)多酚含量存在一定的回升趨勢(shì)。原因可能是茶湯中多酚大分子受腸道環(huán)境影響分解為多酚小分子,其含量下降,但整體酚羥基含量上升,后當(dāng)小分子被完全釋放,受腸道環(huán)境影響,多酚含量再次下降。劉翼翔等[26]通過(guò)對(duì)藍(lán)莓多酚在胃腸消化過(guò)程中總酚及總花色苷含量變化發(fā)現(xiàn),經(jīng)小腸消化后,總酚含量發(fā)生了明顯降低,說(shuō)明小腸pH7.4的弱堿性環(huán)境能夠造成藍(lán)莓多酚分解,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,但多酚含量降低是否與胰蛋白酶發(fā)生了結(jié)合,隨不溶解的蛋白酶一起丟失,還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2.2 體外模擬消化過(guò)程中黃酮變化規(guī)律 4 種茶葉提取液在模擬胃、腸消化過(guò)程中黃酮變化如圖2所示,經(jīng)過(guò)胃消化2 h后,福鼎大白、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)黃酮含量分別下降16.52%、15.40%、19.88%,紫娟上升12.02%。再經(jīng)過(guò)腸消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)黃酮含量分別上升43.26%、30.30%、9.29%、5.77%。

圖2 4種茶葉提取液在模擬胃、 腸消化過(guò)程中黃酮含量變化趨勢(shì)Fig.2 Changes of flavonoids content in four kinds of tea soup during simulated gastric and intestinal digestion

在胃消化階段(0～2 h),福鼎大白、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)黃酮含量下降趨勢(shì)較為明顯,原因可能是黃酮化合物在胃消化過(guò)程中穩(wěn)定性較差。李俶等[27]人選取七種不同種類(lèi)的酚類(lèi)化合物,研究模擬體外胃腸道消化對(duì)其穩(wěn)定性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),類(lèi)黃酮化合物在胃消化過(guò)程中穩(wěn)定性較差,兒茶素下降17%、表兒茶素下降6%,這與本實(shí)驗(yàn)研究相符。而在紫娟提取液中某些黃酮大分子受環(huán)境影響分解為黃酮小分子,黃酮含量存在一定的上升,。在腸消化階段(2～4 h),福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)黃酮含量明顯提升,推測(cè)可能是在堿性環(huán)境下茶葉提取液中某些黃酮大分子受環(huán)境影響分解為黃酮小分子致使吸光值提高。唐琦等[28]通過(guò)體外模擬消化測(cè)定紅小豆萌發(fā)前后總多酚、總黃酮含量的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)堿性環(huán)境條件下,總黃酮含量增加,原因可能是酚酸類(lèi)、花青素類(lèi)在腸液偏堿性條件下發(fā)生降解,總多酚結(jié)構(gòu)變化向更穩(wěn)定的黃酮類(lèi)轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致總黃酮含量增加。這與本文所述相同。

2.2.3 體外模擬消化過(guò)程中原花青素變化規(guī)律 4種茶葉提取液在模擬胃、腸消化過(guò)程中原花青素變化如圖3所示,經(jīng)過(guò)胃消化2 h后,福鼎大白、紫娟、白葉一號(hào)原花青素含量分別下降3.09%、2.24%、17.78%。再經(jīng)過(guò)腸消化2 h后,福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)原花青素含量分別下降22.87%、46.95%、10.89%、23.70%。

圖3 4種茶葉提取液在模擬胃、 腸消化過(guò)程中原花青素含量變化趨勢(shì)Fig.3 Changes of proanthocyanidins content in four kinds of tea soup during simulated gastric and intestinal digestion

在胃消化階段(0～2 h),福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)原花青素含量下降趨勢(shì)不明顯,這與原花青素在酸性環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定有關(guān)。在腸消化階段(2～2.5 h),福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)原花青素含量明顯下降,這與其在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定有關(guān)。在腸消化階段(2.5～4 h),福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)原花青素含量下降不明顯。李華等[29]用不同的方法檢測(cè)葡萄籽超微粉經(jīng)體外消化后的抗氧化能力,通過(guò)對(duì)總酚和原花青素含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)原花青素在人工胃液中比較穩(wěn)定,在人工腸液中呈緩慢分解趨勢(shì),這與本文結(jié)論一致。

2.2.4 體外模擬消化對(duì)抗氧化活性的影響 4種茶葉提取液在模擬體外消化過(guò)程的DPPH自由基清除能力變化如圖4所示,DPPH自由基清除能力IC50值為0.92～1.46 mg VC/mL;其中,福鼎大白自由基清除能力最高。陳金娥等[30]用DPPH法研究紅茶、綠茶、烏龍茶等八種茶葉活性成分的抗氧化性,得出茶葉中多酚含量順序與其對(duì)自由基的清除能力大小順序一致。福鼎大白茶多酚及總黃酮含量最高,與其DPPH自由基清除能力最高結(jié)果相符;在消化后,福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)DPPH自由基清除能力分別下降33.91%、41.78%、20.81%、31.55%,呈明顯下降趨勢(shì)。

圖4 4種茶葉提取液DPPH自由基清除能力消化前后比較Fig.4 DPPH free radical scavenging ability comparison of 4 kinds of tea soup before and after digestion

4種茶葉提取液在模擬體外消化過(guò)程的ABTS自由基清除能力變化如圖5所示,ABTS自由基清除能力IC50值在1.10～1.17 mg VC/mL之間,其紫娟ABTS+·抗氧化活性最高,其次為福鼎大白、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)。戴妙妙等[31]通過(guò)比較紫鵑茶中花青素提取物和兩種常用合成抗氧化劑BHA、BHT的抗氧化性及清除自由基能力,發(fā)現(xiàn)紫娟茶中花青素具有較強(qiáng)的抗氧化性活性及較強(qiáng)的清除自由基的能力。紫鵑茶原花青素含量最高,ABTS自由基清除能力最好,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。在消化后,福鼎大白、紫娟、中黃一號(hào)、白葉一號(hào)ABTS自由基清除能力下降23.48%、29.06%、23.68%、23.64%,呈明顯下降趨勢(shì)。

圖5 4茶葉提取液ABTS自由基清除能力消化前后比較Fig.5 ABTS free radical scavenging ability comparison of 4 kinds of tea soup before and after digestion

在體外模擬消化過(guò)程中,4種茶葉提取液的抗氧化活性(DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力)呈逐漸下降的趨勢(shì),這與尹世磊等[32]的研究結(jié)果相似。其中,DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力的下降率以紫娟最大,分別達(dá)到了41.78%、29.06%。4 種茶葉提取液在經(jīng)過(guò)胃、腸消化后抗氧化值明顯下降,不同方法測(cè)定抗氧化值的變化趨勢(shì)均與多酚和黃酮含量的變化趨勢(shì)相近。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外模擬消化法對(duì)4種茶葉提取液中的抗氧化成分及其活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,4種茶葉提取液未消化前的活性成分存在差異。酚類(lèi)物質(zhì)含量范圍為2.03(白葉一號(hào))～2.32 mg GAE/mL(福鼎大白),黃酮含量范圍為2.41(紫娟)～3.41 mg GA/mL(福鼎大白),原花青素的含量范圍為0.16(中黃一號(hào))～0.78 mg GA/mL(紫鵑)。4種茶葉提取液的抗氧化活性具有顯著性差異(P<0.05),DPPH自由基清除能力IC50值0.92(中黃一號(hào))～1.46 mg VC/mL(福鼎大白),ABTS自由基清除能力IC50值1.10(白葉一號(hào))～1.17 mg VC/mL(紫娟)。在模擬胃腸消化中,茶湯提取液多酚下降12.59%～14.73%,黃酮提升5.77%～43.26%,原花青素下降10.89%～46.95%。在模擬胃腸消化中,4種茶葉提取液抗氧化活性均成下降趨勢(shì)。DPPH自由基清除能力下降20.81%～41.78%,ABTS自由基清除能力下降23.48%～29.06%。體外模擬消化過(guò)程中多酚變化規(guī)律有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。