組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥治療腰椎間盤突出癥中應(yīng)用的研究進(jìn)展*

李華南，張 瑋，馬 菲，包 安，陳英英，王海騰，王建伍，王金貴**

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局推拿手法生物效應(yīng)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120)

腰痛是臨床常見病、高發(fā)病，主要以患者出現(xiàn)腰痛伴一側(cè)下肢放射性疼痛為主要特征的系列綜合征。有研究報(bào)道，本病常發(fā)生于中青年，且男性高于女性[1]。相關(guān)調(diào)查顯示：據(jù)報(bào)道其發(fā)病率約為80 %，幾乎每個(gè)人的一生中都會(huì)遇到腰痛。加之近年來(lái)人們工作節(jié)奏的加快，工作方式、環(huán)境的不斷變化，本病發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2]。

伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，本病的診療水平也在不斷提高。目前，針對(duì)LDH的治療手段多樣，臨床可口服藥物來(lái)緩解疼痛，改善身體狀態(tài)、促進(jìn)功能恢復(fù)。其中，非甾體抗炎藥是最常用的對(duì)癥藥物。同時(shí)，結(jié)合患者的癥狀，常用的還有肌松劑、抗抑郁藥、維生素等藥物[3]。另外，各種微創(chuàng)治療和開放性手術(shù)方法也不斷被發(fā)現(xiàn)以及應(yīng)用。但是，上述治療手段需要嚴(yán)格限定其適應(yīng)證，且有一定的藥物副作用。而且對(duì)于病程較短、腰痛程度較輕的LDH，采用非手術(shù)治療后大部分患者病情可好轉(zhuǎn)[4]。因此，學(xué)界一直在爭(zhēng)論針對(duì)LDH的最佳治療手段到底是什么？近年來(lái)，特別是以針灸、推拿、中藥等為代表的中醫(yī)藥療法在治療LDH方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，被廣大患者接受[5]。但是限于研究手段的局限，其作用機(jī)制尚未被充分揭示，這也極大地阻礙了中醫(yī)藥的發(fā)展。

組學(xué)技術(shù)作為系統(tǒng)生物學(xué)中的一部分，在中醫(yī)藥研究中應(yīng)用備受關(guān)注[6]。其從人體的有機(jī)整體角度出發(fā),通過(guò)對(duì)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，可以了解目標(biāo)樣本內(nèi)基因、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的基本狀態(tài)，從而對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行全面解讀[7]。本文結(jié)合組學(xué)技術(shù)的基本知識(shí)，對(duì)中藥、針灸、推拿等療法對(duì)LDH的影響進(jìn)行綜述。

1 蛋白組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥治療LDH中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)是近年快速發(fā)展的一門技術(shù)，其在質(zhì)譜技術(shù)基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)研究的目標(biāo)樣品進(jìn)行處理，從細(xì)胞、組織、體液等提取、采集蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的技術(shù)[8]。其中最主要的分支是定量蛋白質(zhì)組學(xué)，該技術(shù)廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等的基礎(chǔ)、機(jī)制研究中。目前雙向電泳技術(shù)和基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量技術(shù)在蛋白質(zhì)定量技術(shù)研究中應(yīng)用比較成熟[9]。而且，從蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路來(lái)看，該技術(shù)與中醫(yī)藥一直強(qiáng)調(diào)的整體觀念、機(jī)體統(tǒng)一理論是十分相近的，研究者可以利用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)研究樣品的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，篩選中醫(yī)藥干預(yù)的關(guān)鍵蛋白通路，從分子水平解釋中醫(yī)藥的干預(yù)作用提供新途徑和理論依據(jù)[10]。

蛋白質(zhì)是生物生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，生物體細(xì)胞增殖、分化、衰老與凋亡的發(fā)生、調(diào)控過(guò)程和大多數(shù)藥物靶標(biāo)均處于蛋白質(zhì)水平。因此，尋找中醫(yī)藥療法干預(yù)LDH的相關(guān)差異表達(dá)蛋白，對(duì)研究中醫(yī)藥的作用機(jī)制有著重要的意義。桂裕昌等[11]應(yīng)用絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)觀察LDH患者中西醫(yī)保守療法治療4周后其差異表達(dá)蛋白。結(jié)果：該團(tuán)隊(duì)共篩出209個(gè)差異蛋白，上調(diào)蛋白13個(gè)、下調(diào)8個(gè)。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的14個(gè)蛋白富集在25條KEGG通路。特別是纖維連接蛋白1、補(bǔ)體C3、載脂蛋白A-IV、載脂蛋白A-I及載脂蛋白B可能是潛在血清分子靶標(biāo)。

岳容兆等[12]應(yīng)用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)分析刮痧干預(yù)后腰椎間盤突出癥模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)的蛋白質(zhì)變化，探究刮痧治療作用的生物學(xué)基礎(chǔ)。共鑒定差異蛋白106個(gè)，41上調(diào)，65個(gè)下調(diào)。分析獲得富集度最高的是：上皮粘著連接信號(hào)通路、重塑上皮粘著連接信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路、西地那非細(xì)胞作用通路、基于Rho肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)通路5個(gè)典型信號(hào)通路和ERK1/2信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，刮痧可以通過(guò)減少氧化及炎癥損傷、保護(hù)神經(jīng)組織、抑制椎間盤退化等環(huán)節(jié)治療腰椎間盤突出癥。張明順等[13]應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩選出6個(gè)差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到AGPα1-酸性糖蛋白、免疫球蛋白α-1鏈C區(qū)、未知蛋白3種蛋白質(zhì)，其中酸性糖蛋白最相關(guān)。在推拿干預(yù)后該蛋白表達(dá)量減少。說(shuō)明推拿手法可能是改善腰椎間盤突出癥患者突出的神經(jīng)根局部病變的微環(huán)境，減輕了機(jī)體的炎癥反應(yīng)。邰志洪等[14]應(yīng)用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)篩選腰椎間盤突出癥兩種不同保守治療前后患者血清差異表達(dá)蛋白，進(jìn)一步明確LDH活血化瘀治療的血清標(biāo)志蛋白。共鑒定到蛋白質(zhì)組300個(gè)，對(duì)應(yīng)209個(gè)非冗余蛋白，中醫(yī)活血化瘀法治療組符合條件的差異蛋白20個(gè)，其中上調(diào)及下調(diào)表達(dá)的蛋白各占10個(gè)，涉及27條KEGG生物代謝途徑。結(jié)果顯示：代表性差異表達(dá)蛋白碳酸酐酶1與轉(zhuǎn)鐵蛋白變體在觀察組LDH患者血清中表達(dá)量明顯下調(diào)，可能是中藥活血化瘀法治療LDH血瘀證的目標(biāo)蛋白質(zhì)。這為揭示中藥活血化瘀療法治療的效應(yīng)機(jī)制提供客觀依據(jù)，為臨床合理應(yīng)用中藥活血化瘀療法治療LDH提供依據(jù)。

2 代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥治療LDH中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分之一，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)逐漸形成的新興研究方法[15～16]。代謝組學(xué)可以針對(duì)細(xì)胞、生物流體、組織或生物體內(nèi)的小分子進(jìn)行大規(guī)模的觀測(cè)，研究生物體受到刺激、干預(yù)后其代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及變化規(guī)律，并進(jìn)行定量分析，以此分析研究對(duì)象的病生理狀態(tài)[17]。目前，行業(yè)內(nèi)被廣泛應(yīng)用的代謝組學(xué)分析技術(shù)主要有：核磁共振技術(shù)(NMR)、氣相色譜與質(zhì)譜共用技術(shù)(GC-MS)、液相色譜與質(zhì)譜共用技術(shù)(LC-MS)技術(shù)[18]。

丁歡等[19]應(yīng)用GC-MS技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)LDH模型大鼠刮痧后其機(jī)械痛閾值下降，結(jié)果顯示：大鼠尿液內(nèi)源性代謝物，如3-(3-羥基苯基)丙酸、天冬氨酸和谷氨酰出現(xiàn)了降低，而甘氨酸、檸檬酸、環(huán)腺苷酸這三種代謝產(chǎn)物的含量出現(xiàn)了明顯的上升，提示刮痧療法可能激活了模型體內(nèi)的鎮(zhèn)痛與抗炎通路從而發(fā)揮作用機(jī)制。劉勝等[20]應(yīng)用LC-MS技術(shù)觀察獨(dú)活續(xù)斷湯對(duì)肝腎陰虛型LDH患者的作用機(jī)制。結(jié)果顯示：獨(dú)活續(xù)斷湯干預(yù)后患者存在檸檬酸、賴氨酸、丙酮酸及β-隱黃素4種代謝差異物。提示獨(dú)活續(xù)斷湯可能是通過(guò)增強(qiáng)患者三羧酸循環(huán)率以增強(qiáng)能量代謝，促進(jìn)軟骨細(xì)胞再生。同時(shí)，進(jìn)一步激活機(jī)體抗氧化、抗炎作用從而發(fā)揮對(duì)LDH患者的治療作用。劉晶晶等[21]也開展同樣研究，結(jié)果證實(shí)，LDH患者血清中檸檬酸、賴氨酸、丙酮酸、β-隱黃素的水平與對(duì)照組比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方磊等[22]學(xué)者探討了基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)未來(lái)推拿手法研究的意義，他們認(rèn)為，在現(xiàn)代推拿手法的臨床研究中，可以借助基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)手段來(lái)闡釋與表達(dá)手法的量效問(wèn)題，從研究中進(jìn)一步篩選出差異蛋白，進(jìn)而能夠準(zhǔn)確找到推拿從業(yè)者中初級(jí)與專家的手法區(qū)別。為提供推拿手法教學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化提供新的研究思路與內(nèi)容。

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥治療LDH中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是新近發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，其能夠從整體水平研究特定條件下細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄情況及其調(diào)整規(guī)律。這一研究思路和中醫(yī)用藥整體觀的指導(dǎo)思想不謀而合，能夠有效觀察中醫(yī)藥療法對(duì)于人體RNA的表觀表達(dá)影響。王奕利等[23]應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)探究電針深刺“腰突五穴”患側(cè)大腸俞、關(guān)元俞及L4、L5、S1夾脊穴后，采集外周血全血中的白細(xì)胞總核糖核酸觀察其干預(yù)LDH的分子效應(yīng)機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針深刺“腰突五穴”后，患者外周血全血中的白細(xì)胞中CCL2、IFI27基因表達(dá)下降。他們猜測(cè)電針深刺“腰突五穴”可能通過(guò)下調(diào)CCL2、IFI27基因表達(dá)，減輕LDH的免疫炎癥與疼痛反應(yīng)。其結(jié)果也為后續(xù)圍繞LDH的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究開辟了新的領(lǐng)域，值得后來(lái)人的進(jìn)一步挖掘與深入探索。

4 討 論

LDH作為一組臨床癥候群，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及生物力學(xué)改變、神經(jīng)卡壓、自身免疫、局部炎癥細(xì)胞因子聚集等多方面、多環(huán)節(jié)原因。中醫(yī)藥療法在治療過(guò)程中，發(fā)揮了療效確切、安全、不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)[24]。但是其作用機(jī)制存在廣泛性，多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，往往很難全面概述。因此，學(xué)界一直在尋求某種技術(shù)能夠解決這方面的問(wèn)題。組學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展，讓這種設(shè)想逐漸成了現(xiàn)實(shí)。組學(xué)技術(shù)的整體性、統(tǒng)一性，與中醫(yī)藥的作用特性高度契合，上述技術(shù)也可以及時(shí)觀測(cè)LDH整個(gè)發(fā)病過(guò)程及中藥、針灸、推拿、刮痧等中醫(yī)藥療法的干預(yù)過(guò)程，特別是針對(duì)LDH患者或者模型的機(jī)體代謝物、蛋白變化發(fā)現(xiàn)差異，進(jìn)一步明確LDH的特異性靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥治療LDH提供現(xiàn)代化、國(guó)際化依據(jù)。

但是，我們通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療LDH大部分研究?jī)H限于蛋白檢測(cè)和代謝產(chǎn)物的變化，特別缺乏從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等層面進(jìn)行更加深入的對(duì)機(jī)理的研究[25]。這值得學(xué)界研究者思考：一方面這些新技術(shù)是否對(duì)中醫(yī)藥治療LDH的基礎(chǔ)研究還有空白區(qū)域；另一方面，未來(lái)我們能否聯(lián)合上述技術(shù)，不僅強(qiáng)調(diào)一般水平或僅限于單一方面，而是多組學(xué)結(jié)合起來(lái)，合理整合、科學(xué)分析，進(jìn)一步系統(tǒng)深入地揭示中醫(yī)藥在治療LDH過(guò)程中的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。而且對(duì)于針灸、推拿的治療機(jī)制，仍然有巨大的研究空間可以探索，比如這些組學(xué)技術(shù)能否更廣泛地應(yīng)用于量效研究、處方配伍規(guī)律研究、“時(shí)間針灸”、表觀遺傳特征等，需要后來(lái)者的進(jìn)一步思考。當(dāng)然，也要考慮經(jīng)濟(jì)成本，特別是組學(xué)技術(shù)還不普及，檢測(cè)費(fèi)用昂貴，因此在應(yīng)用組學(xué)技術(shù)進(jìn)行中醫(yī)藥治療LDH的相關(guān)研究時(shí)，應(yīng)該參考以往經(jīng)驗(yàn)，特別是前人經(jīng)驗(yàn)，將代謝、蛋白、基因數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)有機(jī)結(jié)合，這樣才更有利于發(fā)現(xiàn)包含了不同數(shù)據(jù)內(nèi)容的復(fù)合生物標(biāo)記物，更有利于中醫(yī)藥研究結(jié)果的挖掘與闡釋。

未來(lái)，隨著學(xué)界對(duì)組學(xué)技術(shù)研究的不斷深入，相信其在中醫(yī)藥的作用機(jī)制研究方面應(yīng)用空間會(huì)越來(lái)越大，也會(huì)越來(lái)越發(fā)揮其全面、統(tǒng)一的優(yōu)勢(shì)。如何按照各組學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)分別進(jìn)行科學(xué)、合理的融合和恰當(dāng)?shù)膶?duì)接，共同為揭示中醫(yī)藥的科學(xué)含義服務(wù)，將是一項(xiàng)值得中醫(yī)藥學(xué)者們深入思考的課題。