太子參RAPD 反應(yīng)體系的優(yōu)化

史 輝，董曉菲，葉祖云

（1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建寧德 352100;2.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心,福建寧德 352100）

太子參為石竹科（Caryophyllaceae）假繁縷屬（PseudostellariaPax）植物孩兒參[Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm]的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺之功效[1].福建省柘榮縣被譽(yù)為中國太子參之鄉(xiāng)，90%農(nóng)戶種植太子參，太子參產(chǎn)量占全國產(chǎn)量的50%以上[2].目前太子參選育工作嚴(yán)重滯后，缺乏科學(xué)規(guī)范的品種選育與種源管理.長期以來，由于不同產(chǎn)地的太子參互引互種頻繁，且引種交流缺乏系統(tǒng)性，從而導(dǎo)致現(xiàn)有栽培群體間種源混雜，內(nèi)在質(zhì)量和藥材產(chǎn)量參差不齊.因此,對(duì)太子參種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定和品種改良的研究勢在必行.

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是Williams 等[3]和Welsh 等[4]于1990年建立的檢測基因組DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù).該技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)，且不需要提前獲知被研究材料的基因組序列，就可以較全面地展示個(gè)體間的變異情況[5].目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、基因定位和品系鑒定等領(lǐng)域[6].但RAPD 標(biāo)記技術(shù)也存在著一些缺點(diǎn)，如：引物序列較短，退火溫度較低，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的變化非常敏感，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性一般[7].因此，針對(duì)不同的研究材料，優(yōu)化建立其RAPD 反應(yīng)體系對(duì)獲得穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要.

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為柘參1號(hào)，2018年3月采自柘榮縣太子參良種繁育基地，取完好的幼嫩葉片提取基因組DNA.

試劑植物基因組DNA 提取試劑盒、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、Marker（DM2000）均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成；瓊脂糖為西班牙Biowest進(jìn)口分裝；其他試劑均為國藥分析純.

儀器超微量核酸蛋白測定儀（美國ACTGene Nanodrop 2000）、梯度PCR 擴(kuò)增儀（美國Biometra C-412）、全自動(dòng)凝膠電泳成像儀（美國伯樂Gel DocTM EZ）、電泳儀（北京六一DYY-10C）、超純水機(jī)（美國Milipor）、高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma 3K-30）、微量移液器（法國吉爾森Ppetman系列）.

1.2 試驗(yàn)方法

RAPD-PCR 反應(yīng)體系單因子優(yōu)化選用S10 RAPD 引物，模板為柘參1 號(hào)DNA，分別對(duì)影響RAPD-PCR 擴(kuò)增的模板DNA 用量、TaqDNA 聚合酶濃度、dNTPs 濃度、引物濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)和延伸時(shí)間7 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)優(yōu)化設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)條件的優(yōu)化結(jié)果作為下一個(gè)實(shí)驗(yàn)的條件.分別設(shè)置9 個(gè)模板量：7、14、21、28、35、42、49、56、63 ng；9 個(gè)TaqDNA 聚合酶濃度：0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 U；8 個(gè)dNTPs 用量：0.10、0.13、0.16、0.19、0.22、0.25、0.28、0.31mmol·L-1；9 個(gè)引物用量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μmol·L-1；8 個(gè)退火溫度：28、30、32、34、36、38、40、42 ℃；4個(gè)循環(huán)數(shù)：30、35、40、45 次；4 個(gè)延伸時(shí)間：60、80、100、120 s.初始擴(kuò)增體系（20 μL）含10×buffer 2μL、50 ng·μL-1模板DNA 2 μL、4 μmol·L-1引物2 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs1.6 μL、Taq酶0.9 U.初始擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，36 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)[8].擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄.比較PCR 體系中各因子的不同水平對(duì)擴(kuò)增效果的影響，前一個(gè)因子的最適條件確定后，作為下一個(gè)因子優(yōu)化的反應(yīng)條件.以優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行RAPD-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測，用S1 引物對(duì)10 個(gè)太子參樣品進(jìn)行擴(kuò)增.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 退火溫度對(duì)RAPD-PCR 的影響 退火溫度對(duì)擴(kuò)增影響較大（圖1），當(dāng)退火溫度低于38 ℃時(shí)，500～750 和250～500 bp 之間的一些片段條帶不清晰，或者沒有擴(kuò)增；當(dāng)退火溫度高于38 ℃時(shí)，一些大片段（1 000～2 000 bp）的擴(kuò)增條帶亮度降低，甚至數(shù)量減少.因此，選擇38 ℃為最適的退火溫度，作為優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行下一步優(yōu)化.

圖1 退火溫度對(duì)RAPD-PCR的影響

2.1.2 模板量對(duì)RAPD-PCR 的影響 模板量對(duì)結(jié)果影響不明顯，對(duì)擴(kuò)增條帶的亮度有輕微的影響（圖2），而對(duì)譜帶數(shù)量幾乎沒有影響.隨著模板用量的增加，條帶亮度也隨之增加，當(dāng)模板量達(dá)到28 ng時(shí)，條帶清晰且亮度較高，繼續(xù)增加模板量對(duì)譜帶亮度和數(shù)量沒有影響.因此，在20μL 的反應(yīng)體系中，28 ng是最適的模板DNA量.

圖2 模板量對(duì)RAPD-PCR的影響

2.1.3TaqDNA 聚合酶濃度對(duì)RAPD-PCR 的影響Taq酶濃度對(duì)擴(kuò)增影響較顯著，主要影響譜帶的亮度和種類（圖3）.隨著Taq酶濃度的增加，擴(kuò)增條帶亮度和種類都逐漸增加，當(dāng)Taq酶濃度達(dá)到0.7 U 時(shí)，基本不再增加.因此，為節(jié)約起見，20μL的反應(yīng)體系中，0.7 U的Taq酶是比較合適的濃度.

圖3 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)RAPD-PCR的影響

2.1.4 dNTPs濃度對(duì)RAPD-PCR的影響 在一定范圍（0.10～0.22 mmol·L-1）內(nèi)，隨著dNTPs用量的增加，條帶的清晰度增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.22 mmol·L-1時(shí)，條帶清晰度最高，容易分辨和統(tǒng)計(jì).當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，條帶的清晰度有下降趨勢，且大片段的擴(kuò)增效果變差（圖4），具體原因有待于進(jìn)一步驗(yàn)證.因此，0.22 mmol·L-1是最適宜的dNTPs濃度.

圖4 dNTPs濃度對(duì)RAPD-PCR的影響

2.1.5 引物濃度對(duì)RAPD-PCR 的影響 在一定范圍內(nèi)，隨著引物濃度的增加，條帶的數(shù)量和清晰度隨之增加（圖5）.但當(dāng)引物濃度超過0.8μmol·L-1時(shí)，1 000～2 000 bp 之間的大片段模糊并消失，背景亮度也增加，呈現(xiàn)非特異性擴(kuò)增.因此，引物最適濃度為0.8μmol·L-1.

圖5 引物濃度對(duì)RAPD-PCR的影響

2.1.6 循環(huán)次數(shù)對(duì)RAPD-PCR 的影響 循環(huán)數(shù)決定PCR 產(chǎn)物量，隨著循環(huán)數(shù)的增加，條帶的亮度有增加趨勢，1 000～2 000 bp的大片段亮度增加明顯，因?yàn)榇笃蔚臄U(kuò)增效率較小片段低，所以需要較多的循環(huán)才能擴(kuò)增出較為明亮的條帶（圖6）.40次循環(huán)時(shí)所有條帶基本明亮清晰，再增加循環(huán)數(shù)基本沒有影響，因此，40個(gè)循環(huán)是最適宜的循環(huán)數(shù).

圖6 循環(huán)次數(shù)對(duì)RAPD-PCR的影響

2.1.7 延伸時(shí)間對(duì)RAPD-PCR 的影響 延伸時(shí)間主要根據(jù)欲擴(kuò)增片段的長度來確定.本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了4種延伸時(shí)間60、80、100和120 s.結(jié)果顯示隨著延伸時(shí)間的增加，條帶的亮度有增加趨勢（圖7），100 s的延伸時(shí)間已經(jīng)達(dá)到較好的擴(kuò)增效果，因此，100 s是最適宜的延伸時(shí)間.

圖7 延伸時(shí)間對(duì)RAPD-PCR的影響

2.2 RAPD-PCR 反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測

以優(yōu)化確定的太子參RAPD-PCR反應(yīng)體系，用S1 引物對(duì)10 個(gè)太子參樣品進(jìn)行擴(kuò)增.10個(gè)太子參樣本均能擴(kuò)增出明亮清晰的條帶，擴(kuò)增條帶大小介于250～2 000 bp 之間，且在不同太子參品種間表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性（圖8）.這表明由一個(gè)RAPD 引物優(yōu)化的PCR 反應(yīng)體系可用于其他引物，重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明優(yōu)化確立的太子參RAPD-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)研究.

圖8 引物S24對(duì)10個(gè)太子參品種的擴(kuò)增效果

3 討論

RAPD 分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果易受很多因素的影響，而RAPD-PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性是利用RAPD標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析的前提[9].因此，為獲得準(zhǔn)確而穩(wěn)定的RAPD譜帶，提高分析準(zhǔn)確性，對(duì)擴(kuò)增條件中各因子進(jìn)行優(yōu)化非常有必要.前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)退火溫度對(duì)擴(kuò)增影響最大，故先對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化.在一定的退火溫度范圍內(nèi)，高的退火溫度更有利于擴(kuò)增，可能是由于高的退火溫度可以消除引物分子內(nèi)的部分二級(jí)結(jié)構(gòu)、消除誤配片段、增加互補(bǔ)片段碰撞的機(jī)會(huì)，有利于引物與模板的復(fù)性，故其擴(kuò)增效率高[10].但退火溫度過高時(shí)，引物與模板結(jié)合不牢，易從模板上脫落下來，減少有效的擴(kuò)增條帶.Williams等[3]指出，高于40 ℃的復(fù)性溫度會(huì)使RAPD-PCR反應(yīng)受到抑制，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持這一觀點(diǎn).

模板量在一定范圍內(nèi)對(duì)擴(kuò)增條帶的種類無影響，對(duì)條帶產(chǎn)量有輕微的影響，表現(xiàn)為初始模板用越多，擴(kuò)增產(chǎn)物越多，條帶越亮[11].太子參模板用量對(duì)RAPD-PCR 擴(kuò)增結(jié)果的影響不明顯，其適宜的范圍較寬.本研究結(jié)果與其他植物的研究結(jié)果基本一致[9].

RAPD擴(kuò)增條帶的產(chǎn)量和清晰度與TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物濃度密切相關(guān).其濃度的高低直接影響擴(kuò)增終產(chǎn)物量，濃度過低擴(kuò)增不完全，產(chǎn)物少，條帶弱；引物濃度過高容易錯(cuò)配，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，并增加形成引物二聚體的機(jī)會(huì)，擴(kuò)增產(chǎn)物量下降[12].本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度的引物不利于1 000～2 000 bp的大片段的擴(kuò)增，但有利于1 000 bp以下的小片段的擴(kuò)增，這與前期用ISSR標(biāo)記擴(kuò)增太子參的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[8].循環(huán)數(shù)直接決定PCR 產(chǎn)物量，對(duì)結(jié)果影響較為顯著.循環(huán)數(shù)少，產(chǎn)量少，條帶暗，達(dá)到平臺(tái)期后，繼續(xù)增加循環(huán)數(shù)，產(chǎn)物量不再增加.循環(huán)數(shù)過多，可能會(huì)導(dǎo)致一些非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)，且發(fā)生錯(cuò)配的比例也會(huì)增加[13].延伸時(shí)間對(duì)RAPD-PCR 的影響主要體現(xiàn)在時(shí)間過短，長片段得不到有效擴(kuò)增，對(duì)短片段影響較??；時(shí)間過長，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增[14].在本研究中，延伸時(shí)間對(duì)大片段擴(kuò)增的影響較大，主要是因?yàn)镻CR 擴(kuò)增的效率并不是理想的100%，大片段需要更多的延伸時(shí)間，當(dāng)延伸時(shí)間較短時(shí)，有些循環(huán)中的擴(kuò)增反應(yīng)并沒有延伸到末端，這些擴(kuò)增產(chǎn)物不可以作為下一輪擴(kuò)增的模板，因此達(dá)不到理想的指數(shù)型擴(kuò)增.如果增加延伸時(shí)間，可以使更多的片段（尤其是大片段）延伸到末端，這些擴(kuò)增產(chǎn)物就可以作為下一輪擴(kuò)增的模板，因此擴(kuò)增效率較高，條帶亮度增加.這與陳宏等[15]和Bielawski 等[16]的擴(kuò)增產(chǎn)物最大片段的大小和強(qiáng)度隨延伸時(shí)間的增長而增加的結(jié)果相一致.

4 結(jié)論

本研究通過單因子試驗(yàn)優(yōu)化建立了可用于太子參RAPD-PCR 分析的最適反應(yīng)體系.20μL 的PCR反應(yīng)體系中，模板DNA用量為28 ng，TaqDNA聚合酶濃度為0.7 U，引物濃度為0.8μmol·L-1，dNTPs濃度為0.22 mmol·L-1.PCR 擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間為100 s，循環(huán)數(shù)為40.本研究結(jié)果可為后續(xù)應(yīng)用RAPD 標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行太子參種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、品種鑒定和輔助育種等工作奠定研究基礎(chǔ).