太子參葉斑病病原菌的分離與初步鑒定

王澤榕，李萍萍，彭成彬，阮文元，阮少江,3，葉祖云,3，陳美霞*

（1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,福建寧德 352100;2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院,福建福州 350002;3.福建省特色藥用植物工程技術(shù)研究中心,福建寧德 352100）

太子參（Pseudostellaria heterophylla）為石竹科孩兒參屬植物，分布于全國多個省份，福建、貴州和安徽是主要的種植區(qū)[1].太子參富含多糖、環(huán)肽等多種有益成分，有良好的保護(hù)心肌組織、免疫等作用.由于食用和藥用效果良好，太子參需求量逐年增加.2011年8月31日，福建柘榮太子參被國家質(zhì)監(jiān)總局正式批準(zhǔn)為原產(chǎn)地域保護(hù)產(chǎn)品.目前，柘榮當(dāng)?shù)孛媾R著由長期單一面積栽培太子參導(dǎo)致的土壤退化板結(jié)、有機(jī)質(zhì)含量降低、有益微生物破壞、土壤肥力下降、土傳病害尤其是葉斑病日益嚴(yán)重等問題，太子參的品質(zhì)及產(chǎn)量嚴(yán)重下降.

桑維鈞等[2]研究發(fā)現(xiàn)，葉斑病、黑斑病、白娟病、根腐病導(dǎo)致貴州太子參大量植株死亡，其中斑點(diǎn)葉點(diǎn)霉是引起葉斑病的主要病原菌.李恩濤等[3]對貴州甕安縣太子參基地病蟲害進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有8 種病害和3 種蟲害，葉斑病是其中一種主要真菌病害，在4 月中下旬開始發(fā)病，5 月上旬田間達(dá)到高峰期.這與柘榮太子參基地4 月中下旬發(fā)病，6 月上旬達(dá)到高峰期的發(fā)病時間不同，推斷是由于柘榮6、7 月份臺風(fēng)較多，葉片造傷，分生孢子容易侵染造成病害爆發(fā).徐宏輝[4]從2001年起，連續(xù)6年對福建省壽寧縣太子參葉斑病的病害進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)半知菌亞門球殼孢目殼針孢屬（Septoriasp.）為主要病原菌，多在5 月下旬發(fā)病，雨季會加重病害.李樹江等[5]結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子手段鑒定主要病原真菌為同目不同屬的殼二孢屬（Ascomycotasp.）.綜上所述，引起太子參葉斑病病原菌主要有葉點(diǎn)霉、殼針孢屬和殼二孢屬3 種，但因不同地區(qū)太子參發(fā)病規(guī)律不同，只有準(zhǔn)確鑒定病原菌，才可有針對性地進(jìn)行防治.

本研究結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法和分子方法內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列對太子參的病原菌進(jìn)行分離和初步鑒定，明確病原菌種類，以期為病害綜合防治和抗性種質(zhì)資源篩選提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

以福建省寧德市柘榮縣鳳洋基地的太子參葉斑病病葉作為研究材料.

1.2 太子參葉斑病病源菌的分離純化

參照方中達(dá)[6]的方法進(jìn)行病原菌的分離純化.病葉在流動自來水下沖洗30 min，75%酒精浸泡30 s，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液浸泡1 min，用二次蒸餾水(ddH2O)沖洗3 次，置于無菌培養(yǎng)皿晾干.無菌刀片在病健交界處剪成小塊（約2 mm2）接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng).待組織塊在培養(yǎng)基上長出菌絲后，從中挑取不同形態(tài)菌落的菌絲進(jìn)行單獨(dú)分離培養(yǎng)，將純化4代后的純培養(yǎng)物保存.

1.3 致病性鑒定

將純化后的菌株分別接種至PDA 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d 后，用無菌5 mm 的打孔器取病原菌菌餅和空白瓊脂塊，貼在經(jīng)過無菌水清洗和針刺法十字劃傷雙處理的離體太子參葉片和太子參幼苗進(jìn)行回接侵染.每片葉片均劃傷三至四個傷口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，7 d后觀察葉片的發(fā)病情況.然后再次對太子參葉片發(fā)病部位的病原菌進(jìn)行分離純化，與原接種菌株比較.

1.4 致病菌形態(tài)學(xué)鑒定

將純化后的菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基、燕麥粉瓊脂（oatmeal agar，OA）培養(yǎng)基、馬鈴薯胡蘿卜葡萄糖瓊脂（potato carrot dextrose agar，PCDA）培養(yǎng)基和查氏瓊脂（czapek dox agar，CDA）培養(yǎng)基平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察菌落培養(yǎng)特征.水瓊脂（water agar，WA）培養(yǎng)基接種病原菌檢測分生孢子，顯微鏡觀察分生孢子形態(tài)特征，并測量分生孢子大小.

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

將純化的A 菌株接種到新的PDA 培養(yǎng)基中，待菌絲長滿培養(yǎng)基，刮取適量菌絲體，采用液氮研磨法磨碎樣本.按照真菌基因組DNA 試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取病原菌基因組DNA，-20 ℃保存.1%瓊脂糖檢測合格后進(jìn)行內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（internally transcribed spacerpolymerase chain reaction，ITS-PCR）擴(kuò)增，引物序列為ITS1/ ITS4（TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC），委托福州鉑尚生物技術(shù)有限公司合成.內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系為10μL2xTaq PCR Master Mix 溶液，1μL 上游引物，1μL 下游引物，2μL DNA，12μL ddH2O.擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃總延伸7 min，16 ℃保存.取5μLPCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，15 min），產(chǎn)物送至福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測序.測序結(jié)果提交到國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫使用生物大分子序列比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，參照Weir 等[7]選取相似菌株序列作為參考序列，利用軟件MEGA 7.0 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用自展法進(jìn)行檢測，循環(huán)1 000次[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參葉斑病病害田間癥狀

太子參葉斑病發(fā)病葉片呈褐色病斑，略凹陷，葉正、背面均受害.病斑多呈圓形或不規(guī)則形，病斑部位有黑色顆粒，病健界限明顯呈現(xiàn)黑褐色，發(fā)病后期葉片脫落（圖1）.一旦發(fā)現(xiàn)少量葉片出現(xiàn)葉斑病病斑，在短時間內(nèi)會以該病原點(diǎn)為中心迅速擴(kuò)散爆發(fā)大面積病害，導(dǎo)致太子參減產(chǎn).

圖1 太子參葉斑病病害圖

2.2 病原菌形態(tài)

利用組織分離法從病葉中分離到5株純化病原菌，分別命名為A、B、C、D、E，培養(yǎng)形態(tài)特征見圖2.A菌株菌落顏色均是黑褐色，菌落中央有放射狀裂痕.B 菌株菌落正面及背面顏色均是白色，絨毛狀.C 菌株菌落正面白色，背面米黃色.D 菌株菌落正面白色，菌落背面橙色，邊緣白色，有少量黑色素沉淀.E 菌株菌落顏色均是灰白色，菌落正面有絨狀物，菌落背面有黑色素沉淀.

圖2 太子參病葉組織真菌分離純化圖

2.3 致病性測定

將5 株病原菌分別侵染太子參離體葉片及小苗，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d 后取下菌塊，觀察太子參發(fā)病情況.發(fā)現(xiàn)B.C.D.E 4 株菌株接種后與對照組相比，太子參葉片及小苗均不發(fā)病.而A 菌株侵染后離體葉片及活體小苗葉片均發(fā)病且病癥與田間典型發(fā)病特征相似（圖3）.對葉片發(fā)病部位的病原菌再次進(jìn)行分離純化，獲得的菌株形態(tài)及分生孢子形態(tài)與接種A 菌株無明顯差異.經(jīng)柯赫法則驗證，A菌株為太子參葉斑病的致病菌.

圖3 太子參葉斑病病原菌A的致病性鑒定

2.4 A菌株形態(tài)特征

病原菌株A 菌分別在PDA 培養(yǎng)基、OA 培養(yǎng)基、PCDA 培養(yǎng)基和CDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后觀察（圖4）.PDA培養(yǎng)基中，菌落正面同背面均是黑褐色毯狀.OA培養(yǎng)基中，菌落邊緣整齊圓形，菌落正面灰色，邊緣呈白色，菌落背面黑色絨毛狀，邊緣呈白色.PCDA培養(yǎng)基中菌落邊緣整齊圓形，菌絲致密，菌落正面顏色為黑白相間，菌落背面中間呈黑色.邊緣呈米白色.CDA培養(yǎng)基中菌落正面及背面中間呈米黃色，邊緣呈白色.

圖4 A菌株在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)圖

分生孢子在WA 培養(yǎng)基上加上低溫處理的條件下產(chǎn)孢，OA 培養(yǎng)基少量產(chǎn)孢，其他培養(yǎng)基培養(yǎng)下均不產(chǎn)孢子.顯微鏡下觀察，分生孢子器呈黑色有孔口大小不等，菌絲有分枝，具隔膜，淡褐色.分生孢子多數(shù)為橢圓形，具有2 個油球，大小為（4.7～6.1）μm×（1.4～2.3）μm，表面光滑（圖5）.初步判斷A 菌為殼二孢屬真菌.

圖5 太子參葉斑病病原菌形態(tài)的顯微觀察

2.5 太子參葉斑病病原菌A的ITS序列克隆及測序

提取菌株A 的DNA 進(jìn)行ITS-PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌株A 的DNA 電泳圖清晰明亮（圖6），PCR擴(kuò)增的ITS條帶單一，分子量在500～750 bp，與預(yù)期大小一致（圖7）.

圖6 DNA電泳檢測

圖7 ITS-PCR擴(kuò)增電泳檢測

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測序分析結(jié)果經(jīng)NCBI Blast 比對，下載同源性高的10 個基因序列用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.由圖8 可知，A 菌株的ITS 序列與已登錄的Ascomycotasp.KP899427.1:29-565 聚為一個分支，支持率為97%.結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，A菌株鑒定為殼二孢屬.

圖8 基于ITS基因序列構(gòu)建的太子參葉斑病病原菌A系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

從柘榮太子參葉斑病病葉中分離純化到5株菌株，依據(jù)科赫法則對離體葉片和小苗進(jìn)行侵染實(shí)驗，證明A菌是主要病原菌.在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)不產(chǎn)生分生孢子，李樹江等[5]的研究結(jié)果也表明PDA培養(yǎng)基不產(chǎn)生分生孢子，特定培養(yǎng)條件下才會導(dǎo)致大量分生孢子釋放.分生孢子器為球狀具孔口，內(nèi)含大量分生孢子.在WA培養(yǎng)基上A菌可以產(chǎn)生大量孢子，便于今后研究孢子的萌發(fā)條件和致病機(jī)理.

引起太子參葉斑病的主要病原菌分斑點(diǎn)葉點(diǎn)霉、殼針孢屬和殼二孢屬三種，這可能是因為不同地區(qū)不同時間點(diǎn)主要致病菌不同，本實(shí)驗分離得到的病原菌是殼二孢屬真菌，顯微鏡下觀察菌落、孢子形態(tài)與前人分離鑒定的殼二孢屬相似，為了更加準(zhǔn)確鑒定病原菌，結(jié)合ITS-PCR 擴(kuò)增來鑒定.測序后的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫KP899427.1:29-565相似度達(dá)97%，鑒定為殼二孢屬真菌，病原菌的準(zhǔn)確鑒定為今后的防治提供理論依據(jù).