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    隱丹參酮對(duì)肺鱗癌KAL△LU細(xì)胞增殖和周期以及干細(xì)胞抗原1的影響

    2022-04-07 10:32:32李錚侯煒
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年4期
    關(guān)鍵詞:干性丹參酮鱗癌

    李錚 侯煒

    目前,肺癌仍然是全球范圍內(nèi)引起癌癥相關(guān)死亡的主要病因,其中非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的85%[1],肺鱗癌是非小細(xì)胞肺癌常見的病理類型之一。大多數(shù)患者確診肺鱗癌時(shí)已為中晚期,5年生存率低于15%[2]。對(duì)于晚期肺鱗癌,含鉑雙藥化療仍然是首選方案[3]。盡管靶向治療和免疫治療迅速發(fā)展,只有少部分肺鱗癌患者從治療中獲益[4]。因此積極尋找有效且毒副作用小的藥物及療法仍是研究方向之一。隱丹參酮(cryptotanshinone,CPT)是從中藥丹參根及根莖部位提取的脂溶性化合物,在體外能抑制肺、肝、乳腺、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖[5-8]。但關(guān)于隱丹參酮干預(yù)肺鱗癌的報(bào)道并不多見。本研究用隱丹參酮干預(yù)肺鱗癌KAL△LU細(xì)胞,觀察其對(duì)增殖、凋亡、周期以及干性標(biāo)志物干細(xì)胞抗原1(stem cell antigen,Sca-1)的影響,探討隱丹參酮對(duì)肺鱗癌KAL△LU細(xì)胞的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞

    KAL△LU細(xì)胞株由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所Dr.Yinling Hu實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2 主要試劑和儀器

    隱丹參酮(貨號(hào):S2285)購(gòu)自于selleck公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(貨號(hào):D2650)、四甲基偶氮唑藍(lán)(measurement of trititaed thymidine incorporation,MTT)(貨號(hào):M2128)購(gòu)自于Sigma公司;流式凋亡試劑盒(貨號(hào):559763)、PI/RNase染色緩沖液(貨號(hào):550825)、Sca-1-FITC抗體(貨號(hào):562058)購(gòu)自BD公司。CO2培養(yǎng)箱、多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自于Thermo公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自于BD公司。以上試劑和儀器由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所Dr.Yinling Hu實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

    復(fù)蘇KAL△LU細(xì)胞,以1×106接種于100 mm培養(yǎng)皿中,加含10%胎牛血清、1%青霉素(1萬單位/mL)、鏈霉素(10000 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基10 mL,5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),2~3天換液1次,用含0.25% 乙二胺四乙酸的胰酶消化后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4 細(xì)胞MTT檢測(cè)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KAL△LU細(xì)胞,消化計(jì)數(shù)后分成對(duì)照組(DMSO組)與隱丹參酮組(DMSO+隱丹參酮組),同時(shí)設(shè)空白組。兩組設(shè)不同濃度,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每孔接種5×103KAL△LU細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后,分別加入DMSO與DMSO+隱丹參酮并調(diào)整隱丹參酮終濃度為6.25、12.5、25、50 μM。加藥24、48、72小時(shí)后,每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液,培養(yǎng)箱孵育4小時(shí),加入150 μL的DMSO,1000 r/min震蕩10分鐘,使用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)讀取OD值。細(xì)胞存活率(%)=[(隱丹參酮組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。

    1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、周期和Sca-1

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以1×106接種于100 mm培養(yǎng)皿,待細(xì)胞貼壁后,分別加DMSO與DMSO+隱丹參酮,根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,CPT干預(yù)KAL△LU細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為25 μM,因此調(diào)整隱丹參酮終濃度為25 μM,培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞上清液至15 mL離心管,培養(yǎng)皿內(nèi)加胰酶消化細(xì)胞,加入適量培養(yǎng)基終止消化,收集細(xì)胞及培養(yǎng)基至相同離心管,300 g離心5分鐘,棄上清,用冷的PBS洗兩遍。細(xì)胞凋亡:用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞(>1×106/mL),取100 μL至流式管,加5 μL的Annexin V 和 2 μL的7-AAD,室溫避光孵育15分鐘,加400 μL的1×結(jié)合緩沖液,1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞周期:用1 mL的PI/RNase 染色緩沖液重懸細(xì)胞,室溫孵育30分鐘,轉(zhuǎn)移至流式管,上機(jī)檢測(cè)。Sca-1:加入1 mL 流式緩沖液,調(diào)整濃度為1×106/mL,取100 μL,加入 1 μL的Sca-1-FITC,室溫避光孵育30分鐘,300 g離心5分鐘,重懸于100 μL流式緩沖液中,加200 μL多聚甲醛固定,上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度隱丹參酮對(duì)KAL△LU細(xì)胞增殖的影響

    隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞后,在12.5、25、50 μM濃度時(shí)可以抑制細(xì)胞增殖,且隨時(shí)間與濃度增加,抑制作用增強(qiáng)。12.5 μM 隱丹參酮干預(yù)24、48、72小時(shí)后細(xì)胞存活率降低(P<0.05),25 μM、50 μM隱丹參酮干預(yù)24、48、72小時(shí)后細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01),而6.25 μM隱丹參酮干預(yù)后細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05)。見表1。

    表1 不同濃度隱丹參酮24、48、72小時(shí)KAL△LU細(xì)胞存活率比較

    2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

    25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞24、48、72小時(shí)后, 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KAL△LU細(xì)胞凋亡情況, 結(jié)果顯示,對(duì)照組與隱丹參酮組早期凋亡率比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖1。

    圖1 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU 24、48、72小時(shí)細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

    表2 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU24、48、72小時(shí)細(xì)胞凋亡率比較

    2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)

    25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示,干預(yù)24小時(shí)后,對(duì)照組與隱丹參酮組細(xì)胞周期各期均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);干預(yù)48小時(shí)后,與對(duì)照組相比,隱丹參酮組G0/G1期比例降低,S期比例增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05); 干預(yù)72小時(shí)后,與對(duì)照組相比,隱丹參酮組G0/G1期比例降低,S期比例增加,具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表3、圖2。

    圖2 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU 24、48、72 小時(shí)細(xì)胞周期圖

    表3 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU24、48、72小時(shí)細(xì)胞周期比較

    2.4 細(xì)胞干性標(biāo)志物 Sca-1檢測(cè)

    25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU細(xì)胞24、48、72 h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Sca-1表達(dá)比例,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,隱丹參酮組在各時(shí)間點(diǎn)Sca-1表達(dá)比例均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖3。

    表4 25μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU24、48、72小時(shí)細(xì)胞干性標(biāo)志物 Sca-1比較

    圖3 25 μM隱丹參酮干預(yù)KAL△LU 24、48、72小時(shí)細(xì)胞Sca-1直方圖

    3 討論

    KAL△LU細(xì)胞株由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所Dr. Yinling Hu實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立,是從L-IKKαKA/KA自發(fā)性肺鱗癌小鼠將肺部鱗癌組織取出,經(jīng)胰蛋白酶消化處理及分離培養(yǎng)建立而成[9]。KAL△LU細(xì)胞除具有鱗癌細(xì)胞特性外,還表達(dá)Sca-1等細(xì)胞干性標(biāo)志物,與常見的肺鱗癌細(xì)胞株如H520有所不同,因此本研究以KAL△LU細(xì)胞株為研究對(duì)象,觀察隱丹參酮對(duì)KAL△LU細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及干性標(biāo)志物Sca-1的影響。

    隱丹參酮是傳統(tǒng)中藥唇形科植物丹參的活性成分之一。本研究結(jié)果顯示,12.5、25、50 μM隱丹參酮在24、48、72小時(shí)均能抑制KAL△LU細(xì)胞增殖,具有濃度和時(shí)間依賴性,體現(xiàn)隱丹參酮有抗肺鱗癌細(xì)胞增殖潛力。已有多項(xiàng)研究[5-6,8,10]表明隱丹參酮在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖。

    細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序死亡,細(xì)胞凋亡過程失控與腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系。隱丹參酮可通過阻滯細(xì)胞周期、線粒體途徑、其他途徑等多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[11-12]。但在本研究中,以濃度為25 μM隱丹參酮作用于細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn),均未能顯示隱丹參酮對(duì)KAL△LU細(xì)胞有明顯促進(jìn)凋亡作用,說明25 μM隱丹參酮并不能誘導(dǎo)KAL△LU細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    細(xì)胞正常的分裂、增殖、分化維持著機(jī)體的穩(wěn)定,細(xì)胞周期調(diào)控紊亂會(huì)引起腫瘤等疾病,因此 “腫瘤可能是一類細(xì)胞周期性疾病”[13],針對(duì)細(xì)胞周期素依賴性激酶、檢查點(diǎn)激酶等已成為研究熱點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中,隱丹參酮干預(yù)48、72小時(shí)后可阻滯KAL△LU細(xì)胞于S期,從而阻斷細(xì)胞周期向G2/M進(jìn)行。許多研究證實(shí)隱丹參酮可調(diào)控細(xì)胞周期。葉歡等[14]研究表明,40 μM隱丹參酮可將A549細(xì)胞周期阻滯于G1期。Chen等[15]也發(fā)現(xiàn)隱丹參酮干預(yù)乳腺癌和前列腺癌可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

    Sca-1是小鼠造血干細(xì)胞的標(biāo)志物之一[16],在多種組織器官如心臟、肝臟、乳腺等的干/祖細(xì)胞表面都有表達(dá)[17]。越來越多研究認(rèn)為,Sca-1并非僅是干/祖細(xì)胞表面分子標(biāo)志物,在其自我更新與分化以及促進(jìn)腫瘤形成方面也起到重要作用[18-19]。有研究表明,在小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung carcinoma,LLC)中,Sca-1+LLC比Sca-1-LLC成瘤性強(qiáng),僅2 ×104即可成瘤,并且Sca-1+LLC耐藥性較 Sca-1-LLC更強(qiáng)[20-21],提示Sca-1與腫瘤形成與腫瘤耐藥具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果表明,隱丹參酮干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)均可降低Sca-1比例,降低KAL△LU細(xì)胞干性。因此推測(cè),隱丹參酮可能通過降低干性標(biāo)志物Sca-1影響腫瘤形成、減少腫瘤耐藥。

    綜上,隱丹參酮能抑制KAL△LU細(xì)胞增殖,具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性,阻滯KAL△LU細(xì)胞周期于S期,降低KAL△LU細(xì)胞干性,在抑制肺鱗癌方面具有一定的潛力,為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供一定參考。但隱丹參酮對(duì)KAL△LU細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及Sca-1的直接作用機(jī)制尚不清楚,仍需進(jìn)一步探索。

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