玉米間作大豆對根際微生物群落功能和結(jié)構(gòu)的影響*

常換換，蘇友波，范茂攀，趙吉霞，王自林，李永梅

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201)

作為快速獲取樣品內(nèi)全部微生物群落特征信息的可靠手段，宏基因組測序可以實(shí)現(xiàn)對基因功能以及代謝通路的分析。盡管這一方法為代謝功能的分析提供了可能，卻不能決定特定代謝過程發(fā)生的實(shí)際狀況。因此，尋找微生物群落系統(tǒng)潛能與直接測定代謝過程的關(guān)聯(lián)證據(jù)非常重要[1]。BIOLOG 平板法早在20 世紀(jì)90 年代初就應(yīng)用于微生物代謝功能研究，由最初的種屬鑒定逐步擴(kuò)展到環(huán)境樣品中微生物群落功能考察。盡管該方法本身存在一定的局限性，但可以簡單而快速地獲取環(huán)境樣品中微生物群落的代謝功能信息，通過與高通量測序技術(shù)的聯(lián)合，建立功能和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，故仍被應(yīng)用于不同研究領(lǐng)域[1-3]。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)化學(xué)品的過量使用以及單作等均一化種植方式導(dǎo)致生物多樣性下降以及生態(tài)服務(wù)功能削弱[4]。國內(nèi)外一系列的實(shí)例研究[5-10]證明：間作不僅具有產(chǎn)量優(yōu)勢，還可以降低病蟲害發(fā)生率，減少農(nóng)業(yè)化學(xué)品的投入，提高土壤肥力，增強(qiáng)水土保持功能，在增產(chǎn)和其他生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能之間實(shí)現(xiàn)共贏。間作效應(yīng)產(chǎn)生的基礎(chǔ)在于種間互作，種間互作可以改變根際微生物的結(jié)構(gòu)和功能，這也是間作效應(yīng)產(chǎn)生的重要微生物機(jī)制。對根際微生物結(jié)構(gòu)和功能的同步解析有助于理解間作系統(tǒng)中種間互作的根際微生物機(jī)制。董宇飛等[11]基于3 年田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與連作相比，輪、間作處理可明顯改變辣椒根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)；董艷等[12]發(fā)現(xiàn)：有抗病效果的小麥蠶豆間作體系中，蠶豆根際微生物群落的碳源利用能力顯著高于單作，而無抗病效果的小麥蠶豆間作體系則與蠶豆單作無顯著差異。這些研究都只從根際微生物結(jié)構(gòu)或功能等單一層面進(jìn)行考察，限制了對根際微生物機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識。馬琨等[13]結(jié)合磷脂脂肪酸和BIOLOG 研究發(fā)現(xiàn)：間作玉米顯著影響馬鈴薯根際土壤微生物群落功能多樣性，而間作蠶豆顯著改變微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，即根際土壤微生物群落功能與結(jié)構(gòu)的變化存在不同步的現(xiàn)象。然而，在間作效應(yīng)的根際微生物機(jī)制研究方面，鮮有結(jié)合BIOLOG 和高通量測序技術(shù)的嘗試。

玉米間作大豆是禾本科與豆科間作的典范，盡管研究非常廣泛，但對該間作體系中根際微生物群落功能與結(jié)構(gòu)的信息仍知之甚少。本研究以玉米大豆間作體系為研究對象，聯(lián)合BIOLOG 和高通量測序技術(shù)對根際效應(yīng)最為明顯的玉米抽雄期(大豆花莢期)[14]的根際微生物群落功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以期深入認(rèn)識間作體系中種間互作的根際微生物機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于云南省昆明市盤龍區(qū)松華壩水源保護(hù)區(qū)大擺社區(qū)附近農(nóng)田 (N25°15′58″，E102°46′39″)，該區(qū)海拔2 210 m，年均降雨量950 mm，年均氣溫 16 ℃。土壤為第四紀(jì)黏土母質(zhì)發(fā)育紅壤山原紅壤亞類。

1.2 供試材料

供試土壤質(zhì)地為粘土，pH 5.28，有機(jī)質(zhì)含量42.03 g/kg，堿解氮含量95.20 mg/kg，速效磷含量32.77 mg/kg，速效鉀含量192.85 mg/kg。供試玉米品種為云瑞88，大豆品種為滇豆7 號。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

設(shè)置單作玉米、單作大豆和玉米間作大豆3個處理，每個處理3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。小區(qū)規(guī)格為4 m×9.6 m=38.4 m2。

玉米單作采用寬窄行種植，寬行行距80 cm，窄行行距40 cm，株距25 cm；大豆單作采用等行距，行株距為60 cm×25 cm；玉米大豆間作帶型配置為2∶2，玉米間行距為40 cm，大豆間行距為40 cm，玉米與大豆間行距為50 cm，株距均為30 cm。地塊機(jī)械翻耕后人工打塘播種。玉米和大豆于2018 年4 月29 日播種，玉米覆膜，大豆不覆膜。播種當(dāng)天玉米施純氮72.5 kg/hm2(以N 計)、磷19.2 kg/hm2(以P2O5計)、鉀61.2 kg/hm2(以K2O 計)，大豆施純氮55.2 kg/hm2(以N 計)、磷38.4 kg/hm2(以P2O5計)、鉀91.8 kg/hm2(以K2O 計)，玉米喇叭口期追施純氮72.5 kg/hm2(以N 計)。單、間作施肥相同，各小區(qū)農(nóng)田管理方式相同。

1.4 根際土壤樣品采集

于玉米抽雄期 (大豆花莢期) 采集根際土壤樣品。每小區(qū)除邊3 行外隨機(jī)選擇長勢均勻的植株，單作小區(qū)選取3 株，間作小區(qū)玉米和大豆也各選取3 株。取土?xí)r，先用鐵鍬和長柄刀在距根部13 cm 處挖深20 cm，將根連土拔起后，用力抖動除去松散的土，將仍附著在根上的土刷下作為根際土。小區(qū)內(nèi)土樣混合作為1個待檢測樣品，裝入潔凈自封袋。土壤樣品當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，分成2 份。1 份4 ℃保存用于微生物群落功能多樣性分析，1 份-80 ℃保存用于DNA 提取和高通量測序分析。

1.5 根際微生物群落碳源代謝功能分析

稱取 10.0 g 土壤放入盛有 90 mL 0.85% NaCl無菌溶液的三角瓶中，180 r/min 振蕩 30 min，于超凈工作臺靜置 30 min 后將懸浮液稀釋100 倍，然后將其接種于 BIOLOG ECO 板中，每孔接種量為150 μL。接種完畢后，將BIOLOG ECO 板置于 25 ℃恒溫避光培養(yǎng)，從放入培養(yǎng)箱開始計時，分 別于24、48、72、96、120 和144 h 在BIOLOG Reader 分析儀上讀取590 nm 下的光密度值。

1.6 根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

提取土壤總DNA，針對細(xì)菌16S rDNA 擴(kuò)增子序列V3～V4 區(qū)域，基于Illumina MiSeq PE300測序平臺，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測序(2×300 bp)。通過對reads 拼接過濾、操作分類單元 (operational taxonomic units，OTUs) 聚類、物種注釋及豐度分析，對OTUs 進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)等分析，對不同樣品在97%一致性閾值水平下的α 多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，比較樣品間的差異。樣品測序與分析委托上海微分基因科技有限公司完成。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2007 和PASW Statistics 18，作圖使用Origin Pro 9.1。采用144 h 讀板數(shù)據(jù)進(jìn)行微生物群落碳源代謝功能比較；碳源整體代謝活性(average well color development，AWCD)、Shannon 指 數(shù)(S)、Mclntosh 指 數(shù)(M)和Simpson 指數(shù)(D)的計算參照楊永華等[15]的方法，Gini 系數(shù)(G)的計算參照HARCH 等[16]的方法；利用QIIME 軟件計算根際細(xì)菌群落的α 多樣性指數(shù)；利用R 語言stats 包的kruskal.test 函數(shù)找到組間有顯著差異的物種，基于總OTU 和差異OTU 分別進(jìn)行主成分分析；利用R 語言“Perl SVG”包繪制Venn 圖，分析處理間OTU 的共有和特有關(guān)系；對前20 優(yōu)勢門和屬進(jìn)行單因素方差分析。所有指標(biāo)在單間作之間的差異采用oneway ANOVA 和 Duncan 最小顯著性差異法比較。各指標(biāo)的計算公式為：

式中：Ci和Cj分別為ECO 板第i種和第j種碳源對應(yīng)微孔的吸光值；R為空白微孔的吸光值；n=31；Pi為第i種碳源對應(yīng)微孔的相對吸光值(Ci-R)與所有碳源相對吸光值總和的比值；N為相對吸光值總和；C為所有種類碳源對應(yīng)微孔的吸光值的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米間作大豆對根際微生物群落碳源代謝功能的影響

由表1 可知：玉米大豆不同單、間作處理之間的根際微生物群落AWCD 值無顯著差異，但大豆無論單作還是間作均高于玉米；與各自單作相比，間作體系中大豆根際微生物群落AWCD值減小，而玉米根際微生物群落AWCD 值增大。單作下，大豆根際微生物群落Shannon 指數(shù)和Mclntosh 指數(shù)分別顯著高于玉米5.2%和89.8%，Simpson 指數(shù)顯著低于玉米16.4%，Gini 系數(shù)無顯著差異。與各自單作相比，間作玉米Shannon指數(shù)顯著提高3.5%，Simpson 指數(shù)顯著降低13.1%，Mclntosh 指數(shù)和Gini 系數(shù)無顯著差異；間作大豆Simpson 指數(shù)顯著提高7.8%，Shannon指數(shù)和Mclntosh 指數(shù)均表現(xiàn)為降低趨勢，Gini 系數(shù)無顯著差異。

表1 玉米間作大豆對根際土壤微生物群落碳源代謝功能的影響Tab.1 Effects of maize and soybean intercropping on carbon source metabolism of rhizosphere soil microbial community

2.2 玉米間作大豆對根際細(xì)菌種群多樣性的影響

由表2 可知：樣品測序得到有效序列45 386～50 509 條，玉米單作顯著低于玉米間作和大豆單、間作。將序列抽平至35 754 條后計算菌群多樣性。各處理Simpson 指數(shù)保持一致，說明不同處理間根際細(xì)菌群落種群優(yōu)勢度處于相同水平。大豆單作的Chao 指數(shù)、實(shí)際觀測物種數(shù)、PD 全樹和Shannon 指數(shù)均大于玉米單作，但這4 項(xiàng)指標(biāo)在大豆單作、玉米單作和玉米間作大豆之間均無顯著差異。Shannon 指數(shù)在玉米、大豆單作之間無顯著差異，但間作玉米顯著低于間作大豆。可見，大豆根際的可檢測細(xì)菌總量顯著高于玉米，種群多樣性無顯著差異。與單作相比，間作玉米根際可檢測細(xì)菌總量明顯增加，大豆則出現(xiàn)降低趨勢；而根際細(xì)菌群落物種多樣性和遺傳多樣性無顯著變化。受種間互作的影響，玉米大豆間作下兩者根際細(xì)菌總量趨同，而種群豐富度趨異。

表2 玉米間作大豆根際細(xì)菌群落的α 多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity index of rhizosphere bacterial community of maize and soybean intercropping

2.3 玉米間作大豆對根際細(xì)菌物種組成的影響

由圖1 可知：12個根際土壤樣品共產(chǎn)生2 436 種OTU。所有處理共有OTU 1 613 種，這可能代表了山原紅壤坡耕地玉米和大豆根際土壤中穩(wěn)定存在的菌種。玉米根際獨(dú)有OTU 133 種，大豆根際獨(dú)有OTU 211 種。玉米間作大豆根際土壤獨(dú)有OTU 101 種，其中間作玉米與間作大豆根際所共有32 種，間作玉米根際獨(dú)有34 種，間作大豆根際獨(dú)有35 種。間作玉米根際有146 種OTU存在于大豆單作根際，而并未存在于玉米單作根際；間作大豆根際有97 種OTU 存在于單作玉米根際，而并未存在于單作大豆根際。因此，受種間互作的影響，玉米大豆間作下兩者的根際細(xì)菌群落均出現(xiàn)新種屬，單從菌種種類來看，趨同與變異共存，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生復(fù)雜而微妙的變化?；诳侽TU 的主成分分析結(jié)果顯示：玉米大豆單、間作種植模式之間的根際微生物群落差異在玉米大豆之間較為明顯，而在單間作之間差異不明顯(圖2a)，只有從差異OTU 的主成分分析結(jié)果才能看出單間作之間明顯的差異(圖2b)。

圖1 玉米大豆單間作根際土壤OTU Venn 圖Fig.1 OTU’s Venn diagrams of rhizosphere bacterial community between maize and soybean intercropping and monoculture

圖2 基于總OTU (a)和差異OTU (b)的主成分分析Fig.2 PCA analysis based on all OTU (a) and different OTU (b)

2.4 玉米間作大豆對不同生物分類水平下根際差異細(xì)菌相對豐度的影響

所有OTU 注釋到古菌5 種，涉及2 門1 綱2 科2 目2 屬；細(xì)菌2 431 種，涉及21 門47 綱46 科118 目234 屬。未注釋到門、屬的OTU 分別占總OTU 的20.2%和54.4%。

從門水平來看，放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門和裝甲菌門的相對豐度在玉米大豆單、間作種植模式之間有顯著差異 (表3)。與單作相比，間作玉米和間作大豆根際裝甲菌門的相對豐度分別顯著升高7%和5%。裝甲菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度在大豆根際顯著高于玉米根際，是大豆根際的絕對優(yōu)勢菌門。擬桿菌門的相對豐度在玉米根際顯著高于大豆根際，是玉米根際的絕對優(yōu)勢菌門。單作下，酸桿菌門的相對豐度在玉米根際和大豆根際無顯著差異，但在間作玉米根際出現(xiàn)升高趨勢，且顯著高于大豆單作，出現(xiàn)趨異性；芽單胞菌門則相反，出現(xiàn)趨同性。

表3 玉米、大豆種植模式響應(yīng)明顯的根際微生物門類(前20 優(yōu)勢門)Tab.3 Rhizosphere microorganism at phylum level with obvious response to monoculture and intercropping of maize and soybean (top 20)

從屬水平來看，Gp1、芽單胞菌屬、Gaiella、Gp6、纖線桿菌屬、Gp16、羅河桿菌屬和other的相對豐度在玉米大豆單、間作種植模式之間有顯著差異 (表4)。Gp1的相對豐度無論單、間作均表現(xiàn)為玉米顯著高于大豆，是玉米根際的絕對優(yōu)勢菌屬；而Gp6和Gp16是大豆根際的絕對優(yōu)勢菌屬。芽單胞菌屬的相對豐度在玉米單作和大豆單作之間差異顯著，在間作玉米根際出現(xiàn)升高趨勢，在大豆根際出現(xiàn)降低趨勢，驅(qū)使兩者之間無顯著差異。Gaiella的相對豐度在單作下玉米根際顯著低于大豆根際，間作下大豆根際顯著降低，與玉米無顯著差異。纖線桿菌屬和羅河桿菌屬的相對豐度在單作下玉米根際顯著高于大豆，間作中玉米根際顯著降低，與大豆無顯著差異?？梢?，芽單胞菌屬、Gaiella、纖線桿菌屬和羅河桿菌屬是種間互作下玉米和大豆根際細(xì)菌群落趨同變化的代表。前20 優(yōu)勢屬外的微生物屬相對豐度在單作間無顯著差異，而在間作下玉米根際顯著低于大豆根際。說明非優(yōu)勢種屬中存在種間互作下玉米和大豆根際細(xì)菌群落趨異變化的類群。

表4 玉米、大豆種植模式響應(yīng)明顯的根際微生物種屬(前20 優(yōu)勢屬)Tab.4 Rhizosphere microorganism at genus level with obvious response to monoculture and intercropping of maize and soybean (top 20)

3 討論

土壤微生物直接參與土壤養(yǎng)分的活化、轉(zhuǎn)化、吸收和運(yùn)輸?shù)冗^程，是地上植物生產(chǎn)力的重要驅(qū)動者。間作下根際土壤微生物群落碳源代謝功能增強(qiáng)的研究很多，如覃瀟敏等[17]發(fā)現(xiàn)：間作同時增強(qiáng)玉米和馬鈴薯根際微生物的碳源利用強(qiáng)度，功能多樣性有提高的趨勢但差異不顯著；董艷等[18]發(fā)現(xiàn)：小麥蠶豆間作可增加蠶豆根際微生物群落整體碳源利用強(qiáng)度，以提高微生物群落功能多樣性；甘蔗玉米間作種植可提高甘蔗根際土壤微生物的多樣性及對碳源的利用率[19]。但也有研究顯示：間作下根際微生物群落碳源利用功能變化的復(fù)雜性，如間作紫云英會降低油菜根際土壤微生物群落的功能代謝活性以及功能多樣性[20]；桑樹苜蓿間作系統(tǒng)中，苜蓿根際微生物群落AWCD 值和功能多樣性較單作顯著降低，而桑樹則顯著升高[21]。本研究顯示：大豆根際微生物群落碳源整體代謝活性有高于玉米的趨勢，而多樣性顯著高于玉米；與各自單作相比，間作玉米根際微生物群落碳源整體代謝活性有提高趨勢，多樣性顯著提高，而大豆則相反。說明受種間互作影響，玉米大豆間作下兩者出現(xiàn)趨同性。玉米大豆間作系統(tǒng)中一般玉米處于優(yōu)勢地位，而大豆處于劣勢地位，根際微生物群落碳源代謝功能變化與兩者間作表現(xiàn)的整體效應(yīng)相一致。

本研究顯示：玉米間作大豆顯著增加玉米根際可檢測細(xì)菌總量，這與DOHRMANN 等[22]的研究結(jié)果一致，分析其原因是間作玉米會從大豆根際獲取更多的有效養(yǎng)分，促進(jìn)根際微生物增殖。盡管許多學(xué)者列出間作提高根際微生物多樣性的證據(jù)[23-25]，但本研究并未觀察到種群多樣性和遺傳多樣性的變化，而ZHANG 等[26]和ZHOU 等[27]在玉米//蠶豆和玉米//百合中也有相似的發(fā)現(xiàn)。本研究基于總OTU 的主成分分析結(jié)果顯示：根際細(xì)菌群落在作物間的差異大于單、間作種植模式。玉米大豆間作系統(tǒng)與玄參煙草間作系統(tǒng)具有相似的作物二元結(jié)構(gòu)[28]，而本研究從差異細(xì)菌類群可以發(fā)現(xiàn)玉米間作大豆對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。此外，維恩圖分析結(jié)果顯示：玉米大豆間作下兩者的根際細(xì)菌群落均出現(xiàn)新種屬，菌種種類趨同與變異共存。這進(jìn)一步反映了根際微生物—土壤—作物互作的復(fù)雜性。

作物種類是決定土壤微生物群落特性的關(guān)鍵因素之一[29]。本研究顯示：放線菌門和硝化螺旋菌門是大豆根際的絕對優(yōu)勢菌門，擬桿菌門是玉米根際的絕對優(yōu)勢菌門，幾乎不受間作的影響。JONES 等[30]基于覆蓋北美和南美區(qū)域的87個土壤樣品分析發(fā)現(xiàn)：酸桿菌亞群Gp1相對豐度與pH 值顯著負(fù)相關(guān)，而Gp6和Gp16相對豐度與pH 值顯著正相關(guān)。本研究中，Gp1是pH 較低的玉米根際的絕對優(yōu)勢菌屬，而Gp6和Gp16是pH 較高的大豆根際的絕對優(yōu)勢菌屬，符合上述規(guī)律。本研究發(fā)現(xiàn)：羅河桿菌屬的相對豐度在玉米根際顯著高于大豆根際，或許可以印證羅河桿菌屬作為玉米而非大豆專屬內(nèi)生菌[31]的結(jié)果。本研究還顯示：裝甲菌門也是大豆根際的絕對優(yōu)勢菌門，不過受間作影響，其在玉米大豆間作根際的相對豐度均顯著提高。趙衛(wèi)松等[32]發(fā)現(xiàn)：棉花黃萎病抗病品種耕層土壤中裝甲菌門的相對豐度高于感病品種。裝甲菌門是否與玉米間作大豆的抗病機(jī)制有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。抑病土壤中酸桿菌門增多的現(xiàn)象被不同學(xué)者所報道[33-34]。本研究顯示：酸桿菌門相對豐度在單作玉米和單作大豆根際無顯著差異，而在間作玉米根際顯著高于間作大豆根際，表現(xiàn)為趨異性，與玉米間作大豆表現(xiàn)的整體效應(yīng)相一致。芽單胞菌門、芽單胞菌屬、Gaiella、纖線桿菌屬和羅河桿菌屬是玉米大豆間作影響下趨同變化的菌群代表。因此，受種間互作影響，玉米和大豆的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨同與趨異共存，趨同性大于趨異性，趨異性與兩者間作表現(xiàn)的整體效應(yīng)相一致。

4 結(jié)論

玉米間作大豆模式下，受種間互作影響，玉米和大豆根際微生物群落碳源整體代謝功能和功能多樣性出現(xiàn)趨同性變化；根際細(xì)菌總量出現(xiàn)趨同性變化，菌種組成趨同與趨異共存，并以趨同性為主。