壽寧長(zhǎng)葉1號(hào) 等茶樹(shù)新品系兒茶素和氨基酸組分分析

徐夢(mèng)婷，魏明秀，陳瀟敏，盧明基，吳文晞，陳曉嵐，高水練，葉乃興*

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3. 壽寧縣茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，福建 壽寧 355500；4. 福建恒正檢測(cè)技術(shù)有限公司，福建 福州 350100）

茶樹(shù)［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］屬山茶科山茶屬植物，起源于中國(guó)的西南地區(qū)，茶葉作為世界三大飲料之一，有著巨大的研究?jī)r(jià)值與開(kāi)發(fā)潛力［1］。茶葉中的兒茶素、氨基酸等主要品質(zhì)成分是茶類(lèi)適制性與品質(zhì)形成的重要基礎(chǔ)，是鑒定評(píng)價(jià)茶樹(shù)新品系的重要指標(biāo)。優(yōu)異茶樹(shù)種質(zhì)資源的發(fā)掘是開(kāi)展品種改良的基礎(chǔ)，對(duì)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。對(duì)地方茶樹(shù)品系品質(zhì)成分含量的測(cè)定與分析，可為當(dāng)?shù)貎?yōu)異茶樹(shù)品系的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考依據(jù)［2］。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)優(yōu)異茶樹(shù)品系的農(nóng)藝性狀、生化成分、抗逆性等方面開(kāi)展了大量的研究［3－6］。江新鳳等［3］對(duì)江西特色茶樹(shù)資源“黃金菊”中兒茶素和氨基酸組分含量進(jìn)行測(cè)定，總結(jié)其特征成分變化趨勢(shì)，從而指導(dǎo)當(dāng)?shù)夭铇?shù)資源的創(chuàng)新與利用；Jin等［4］在福建省發(fā)現(xiàn)了同時(shí)富含甲基化EGCG和苦茶堿的特異茶樹(shù)種質(zhì)資源；陳瀟敏等［5］對(duì)福建野生茶樹(shù)資源嘌呤生物堿的組分構(gòu)成進(jìn)行測(cè)定，篩選出一批嘌呤生物堿特異的茶樹(shù)種質(zhì)資源。

福建省壽寧縣位于福建省東北部，地處閩浙兩省的交界，屬于中亞熱帶山地氣候，夏無(wú)酷暑，冬無(wú)嚴(yán)寒，氣候溫暖濕潤(rùn)，得天獨(dú)厚的原生態(tài)環(huán)境十分適合茶樹(shù)生長(zhǎng)。壽寧縣是“中國(guó)名茶之鄉(xiāng)”“全國(guó)重點(diǎn)產(chǎn)茶縣”，產(chǎn)茶歷史悠久，茶樹(shù)種質(zhì)資源豐富，為茶樹(shù)新品種的選育與開(kāi)發(fā)利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［7－8］。近年來(lái)，本課題組開(kāi)展了壽寧茶樹(shù)新品系生物學(xué)性狀、農(nóng)藝性狀的鑒定與利用研究［7－8］，在此基礎(chǔ)上，本研究以國(guó)家級(jí)茶樹(shù)優(yōu)良品種‘福鼎大白茶’為對(duì)照，利用HPLC和UPLC-MS/MS法測(cè)定壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)等5個(gè)茶樹(shù)新品系中兒茶素和游離氨基酸組分含量，初步明確供試茶樹(shù)品系的主要品質(zhì)成分含量，挖掘地方優(yōu)異茶樹(shù)品系，為茶樹(shù)品種的創(chuàng)新利用與有效成分的綜合開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑儀器

供試材料：壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)、壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)、芎坑大白1號(hào)、芎坑大白2號(hào)、伏際大茶樹(shù)等5個(gè)茶樹(shù)新品系，以福鼎大白茶為對(duì)照材料，實(shí)驗(yàn)樣品由壽寧縣茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心提供。

主要試劑：兒茶素、氨基酸組分標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于98%（上海生物科技有限公司）；甲醇，色譜純（安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙腈，色譜純（上海默克化工技術(shù)有限公司）；甲酸，色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸銨（安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

主要儀器：UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；C18反相色譜柱（5 μm，4.6×250 mm，廣州菲羅門(mén)公司）；Nexera X2 LC-30A高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；串聯(lián)Sciex 4500 Q-Trap質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）；C18反相色譜柱（2.6 μm，2.1×100 mm，廣州菲羅門(mén)公司）；3K15離心機(jī)［曦瑪（揚(yáng)州）離心機(jī)有限公司］；KQ-800E型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

采摘2021年春季第一輪茶樹(shù)新梢一芽二葉，采用液氮固樣，冷凍干燥后粉碎過(guò)60目篩后待測(cè)，測(cè)定茶葉中兒茶素及氨基酸等指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3 組分測(cè)定

1.3.1 兒茶素組分測(cè)定

參照王麗麗［9］的方法并略作修改，采用HPLC法。樣品的前處理：稱(chēng)取茶樣0.20 g，分別加入30 mL甲醇，超聲浸提30 min，在溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為10000 g條件下離心5 min,取離心后的上清液過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，上機(jī)待測(cè)。

色譜條件：C18反相色譜柱（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相A為0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；柱溫40 ℃；流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10.0 μL。梯度洗脫程序（A）：0～2 min，88%；2～10 min，88%～75%；10～15 min，75%～73%；15～25 min，73% ～ 68%；25～ 30 min，68%；30～ 32 min，68%～88%。

1.3.2 氨基酸組分的測(cè)定

參考 zhou［10］和陳思彤［11］的方法測(cè)定，采用UPLC-MS/MS法。樣品提取及AQC衍生：稱(chēng)取粉碎茶樣0.05 g，加入5 mL超純水并混合渦旋，室溫下45 KHZ超聲浸提30 min,在溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為10000 g條件下離心5 min，取20.0 μL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾的上清液，稀釋定容至1 mL，取稀釋液10.0 μL，加70.0 μL硼酸鈉緩沖液（pH 9.0）混合，再與 20.0 μL AccQ-Fluor試劑（3000 mg·L-1）混合并渦旋，置于烘箱（55℃）10 min，待冷卻至室溫上機(jī)測(cè)試。

色譜條件：C18反相色譜柱（2.6 μm，2.1×100 mm）；流動(dòng)相A為甲酸銨溶液（10 mmol·L-1，pH 6.0），流動(dòng)相B為乙腈溶液；流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL。梯度洗脫程序（B）：0～12 min，5%～20%；12～16 min，20%～35%；16～18 min，35% ～ 90%；18～ 19 min，90% ～ 5%；19～ 23 min，5%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù),測(cè)定結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與圖表制作；使用SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05）；使用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)壽寧茶樹(shù)新品系兒茶素組分含量分析

兒茶素類(lèi)化合物可分為酯型兒茶素和非酯型兒茶素,前者主要包括：ECG、EGCG、GCG和CG；后者主要包括C、EC、EGC和GC［12］。本研究共測(cè)定了包含EGCG3"Me在內(nèi)的9種兒茶素，其中GCG、CG和GC在供試茶樣中均未被檢測(cè)出。HPLC法測(cè)定的供試茶樹(shù)品系與對(duì)照福鼎大白茶的兒茶素、嘌呤生物堿組分色譜圖見(jiàn)圖1-A。從表1可以看出，5份供試茶樹(shù)品系中,兒茶素總量為83.12～150.87 mg·g-1，平均含量較低，僅為113.29 mg·g-1。供試茶樹(shù)品系中兒茶素組分和總含量差異較為顯著，在兒茶素組分中，均以EGCG含量最高，其中含量最高的是芎坑大白2號(hào)（84.45 mg·g-1），最低的為壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)（43.43 mg·g-1）。EGCG3" Me在壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)、芎坑大白1號(hào)、伏際大茶樹(shù)中均有檢測(cè)出，其中伏際大茶樹(shù)含量最高為6.49 mg·g-1，其次為芎坑大白1號(hào)為5.88 mg·g-1；供試茶樹(shù)資源中酯型兒茶素的總量均高于非酯型兒茶素，酯型兒茶素含量為55.80～108.41 mg·g-1，平均含量為80.72 mg·g-1；非酯型兒茶素含量為20.87～42.46 mg·g-1，平均含量為 30.58 mg·g-1。

表1 供試茶樹(shù)品系兒茶素組分含量Table 1 Catechins content of tested tea varieties （單位：mg·g-1）

圖1 供試茶樹(shù)品系主要品質(zhì)成分色譜圖（A為兒茶素及嘌呤生物堿組分色譜圖，B為氨基酸組分總離子流圖）Fig. 1 Key quality constituents in tested tea varieties （A: chromatogram on catechins and purine alkaloids;B: total ion flow diagram on amino acids）

兒茶素苦澀味指數(shù)＝（EGCG＋EGC＋ECG＋GC）/（EC＋C），根據(jù)苦澀味指數(shù)能較為準(zhǔn)確的估價(jià)出茶湯苦澀味強(qiáng)度，指數(shù)越大，說(shuō)明鮮葉的苦澀味愈重［13－14］。由表2結(jié)果可知，供試茶樹(shù)品系兒茶素苦澀味指數(shù)由高到低依次為芎坑大白1號(hào)（10.76）＞芎坑大白2號(hào)（10.30）＞伏際大茶樹(shù)（9.55）＞壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)（8.45）＞壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)（7.47）。兒茶素品質(zhì)指數(shù)是評(píng)價(jià)綠茶品質(zhì)的一個(gè)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，兒茶素品質(zhì)指數(shù)＝（EGCG＋ECG）/EGC，兒茶素品質(zhì)指數(shù)高，說(shuō)明兒茶素組分含量比例更適合人們飲用或用于食品生產(chǎn)加工可以獲得更好的品質(zhì)［15－16］。5個(gè)供試茶樹(shù)品系兒茶素品質(zhì)指數(shù)為222.37～842.38，平均值為454.71，其中芎坑大白1號(hào)（524.50）和伏際大茶樹(shù)（842.38）兒茶素品質(zhì)指數(shù)較高，高于福鼎大白茶（511.23），初步推測(cè)其加工成綠茶、白茶將有較好的品質(zhì)表現(xiàn)。

2.2 5個(gè)壽寧茶樹(shù)新品系游離氨基酸組分含量分析

供試的茶樹(shù)品系中共檢測(cè)出了19種游離氨基酸組分，氨基酸含量豐富，以UPLC-MS/MS方法測(cè)定的氨基酸色譜圖見(jiàn)圖1-B。由表2可知，供試的5個(gè)茶樹(shù)品系氨基酸總量為26.40～56.22 mg·g-1，其中壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)（56.22 mg·g-1）含量最高，其次是壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)（56.02 mg·g-1）和芎坑大白1號(hào)（54.92 mg·g-1），這3份茶樹(shù)品系的氨基酸總量都超過(guò)50 mg·g-1，顯著高于對(duì)照福鼎大白茶。游離氨基酸組分中茶氨酸含量最高，變幅為15.43～41.71 mg·g-1，除伏際大茶樹(shù)的茶氨酸含量（15.43 mg·g-1）低于對(duì)照福鼎大白茶（23.52 mg·g-1），其余均高于對(duì)照福鼎大白茶，其中壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)、芎坑大白1號(hào)和壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)的茶氨酸含量較高，分別為：41.71 mg·g-1、40.78 mg·g-1和 36.90 mg·g-1， 顯 著 高于對(duì)照福鼎大白茶。精氨酸含量在不同品系間差異達(dá)到顯著水平，其中壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)的精氨酸含量高達(dá)8.24 mg·g-1，顯著高于其他參試材料；壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)（5.51 mg·g-1）、芎坑大白1號(hào)（1.58 mg·g-1）的含量較高，顯著高于對(duì)照福鼎大白茶（0.45 mg·g-1）；鮮味氨基酸如天冬氨酸含量均高于對(duì)照種,谷氨酸含量除壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)、芎坑大白2號(hào)略低于對(duì)照,其余也均高于對(duì)照。

表2 供試茶樹(shù)品系氨基酸的組分含量Table 2 Amino acids content of tested tea varieties （單位：mg·g-1）

人體必需氨基酸（EAA）包含蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸和色氨酸，大量氨基酸（LAA）包含茶氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸和組氨酸［17］。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知（表3）：壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)等5個(gè)茶樹(shù)新品系，茶氨酸占茶葉游離氨基酸總量的58%～79%，變異系數(shù)為11.43%。其中變異系數(shù)最大的為EAA/TAA，為50.00%；其次為大量氨基酸（LAA）與氨基酸總量（TAA），變異系數(shù)分別為31.58%和33.64%；變異系數(shù)最小的為L(zhǎng)AA/TAA，為5.95%，這表明供試茶樹(shù)品系中LAA/TAA一致性較強(qiáng)，變異范圍不大；EAA/TAA、LAA、TAA變異范圍較大，遺傳資源豐富。

表3 部分氨基酸含量及其占氨基酸總含量的比例Table 3 Contents and percentages in total of some amino acids in tea varieties

2.3 5個(gè)壽寧茶樹(shù)新品系游離氨基酸主成分分析

主成分分析可以比較直觀地反應(yīng)樣本構(gòu)成的近似度問(wèn)題，樣本間距離越近則相似度越高。由圖2可知，供試的壽寧茶樹(shù)品系和對(duì)照福鼎大白茶全部分布于圖中的橢圓內(nèi)，并且不同茶樹(shù)品系之間得到了較好的區(qū)分，說(shuō)明了供試茶樹(shù)品系的氨基酸成分之間存在較明顯差異。其中，壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)、壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)和芎坑大白1號(hào)皆分布在橫軸的負(fù)半軸（第二象限和第三象限），距離較近；而伏際大茶樹(shù)、芎坑大白2號(hào)和福鼎大白茶位于橫軸的正半軸（第一象限和第四象限），且芎坑大白2號(hào)與福鼎大白茶的距離最近，略有相交，這表明芎坑大白2號(hào)與對(duì)照福鼎大白茶氨基酸組分最為相似。

圖2 基于游離氨基酸組分的供試茶樹(shù)品系主成分分析圖Fig. 2 Principal component analysis based on free amino acids of tested tea varieties

3 討論與結(jié)論

茶葉中的兒茶素屬于黃烷醇類(lèi)化合物，是茶葉的主要品質(zhì)成分，對(duì)提高茶湯濃度有積極作用，兒茶素滋味苦澀，含量過(guò)高則不利于茶湯良好滋味的形成［18］。5個(gè)供試茶樹(shù)品系中，兒茶素平均含量較低，僅為113.29 mg·g-1，低于中國(guó)茶樹(shù)種質(zhì)資源的平均含量（154.50 mg·g-1）［19］。其中EGCG3" Me有著比EGCG更強(qiáng)的抗過(guò)敏和消炎等藥理作用，在茶葉深加工與開(kāi)發(fā)為保健產(chǎn)品上有著很大的潛在價(jià)值［20－21］；供試茶樹(shù)品系中，芎坑大白1號(hào)與伏際大茶樹(shù)為EGCG3" Me含量較高的茶樹(shù)品系（含量分別為5.88 mg·g-1和6.49 mg·g-1）。

大部分氨基酸具有鮮味，略帶甜味，是構(gòu)成綠茶“鮮爽”滋味的主要呈味成分，氨基酸含量高，則制成的茶葉滋味鮮醇、香氣較好［22］。竹尾忠一［23］等研究發(fā)現(xiàn)各種氨基酸與滋味評(píng)價(jià)的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.984，其中的茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸與綠茶品質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，是構(gòu)成綠茶鮮爽滋味的主要成分。茶氨酸是茶葉中的特征氨基酸，被部分學(xué)者稱(chēng)作“幸福茶氨酸”，是茶葉鮮爽滋味的主要呈味物質(zhì)，占茶葉游離氨基酸總量的40%～70%，具有保護(hù)神經(jīng)、延緩衰老、提高免疫力、代謝調(diào)節(jié)等生理功效［24－25］。本研究5個(gè)供試茶樹(shù)品系中，氨基酸含量均高于20 mg·g-1，其中壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)、壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)和芎坑大白1號(hào)的氨基酸總量均大于50.00 mg·g-1，茶氨酸含量均大于30.00 mg·g-1，為高茶氨酸茶樹(shù)品系。

氨基酸是決定綠茶品質(zhì)的重要成分，其含量與組分影響茶葉的香氣和品質(zhì)，其中茶氨酸是茶湯鮮味的主要來(lái)源，與綠茶品質(zhì)呈極顯著正相關(guān),一般茶氨酸和游離氨基酸含量高的綠茶，滋味鮮爽、香氣高長(zhǎng)，品質(zhì)表現(xiàn)優(yōu)異［26］；而綠茶茶湯的苦澀味主要由EGCG貢獻(xiàn)，當(dāng)EGCG含量過(guò)高，則綠茶滋味濃且苦澀［27］。5個(gè)供試茶樹(shù)品系中鮮味氨基酸（天冬氨酸，谷氨酸）含量高于對(duì)照福鼎大白茶，且氨基酸總量除伏際大茶樹(shù)略低于對(duì)照福鼎大白茶，其余均高于福鼎大白茶，其中壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)、壽寧長(zhǎng)葉2號(hào)和芎坑大白1號(hào)的氨基酸總量（＞5%）和茶氨酸含量（＞3%）均很高，且兒茶素總量偏低，其中EGCG含量較低（＜8.5%），推測(cè)其制成的成品茶滋味鮮爽且苦澀味較輕，這與楊秀芳［23］等適制綠茶茶樹(shù)品種的生化指標(biāo)的要求相符，適合制作成綠茶或者白茶［28］，壽寧長(zhǎng)葉1號(hào)等5個(gè)茶樹(shù)新品系的茶類(lèi)感官品質(zhì)有待在今后的茶類(lèi)試制性試驗(yàn)中進(jìn)一步鑒定與評(píng)價(jià)。