近海微塑料含量的相干反斯托克斯拉曼光譜成像研究

焦若男，劉 琨，孔繁藝，王 婷，韓 雪，李泳江，孫長(zhǎng)森

大連理工大學(xué)光電工程與儀器科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116000

引 言

隨著塑料制品的廣泛應(yīng)用，微塑料逐漸成為地球上一種新興污染物。 微塑料是指尺寸小于5mm的塑料碎片。 由于其形成原因不同，微塑料被分為初級(jí)微塑料和次級(jí)微塑料，初級(jí)微塑料是指直接被制成微觀尺寸的塑料，如化妝品中含有的塑料顆粒、藥物載體等；次級(jí)微塑料是指大的塑料碎片經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)、生物等過(guò)程分解所得到的產(chǎn)物。 微塑料的體積小，表面積大，吸附能力強(qiáng)，擴(kuò)散范圍廣。

起初人們對(duì)微塑料的研究主要針對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)。 但近年來(lái)研究表明中國(guó)黃渤海海域沉積物中存在約100個(gè)·kg-1(干重)左右的微塑料[1]。 不僅在我國(guó)海域，在世界各大海域[2]、南極羅斯海[3]、甚至北極海冰[4]中都有微塑料的蹤跡。 海洋遭到微塑料的襲擊，海洋生物和海產(chǎn)品也不例外。 微塑料不僅被發(fā)現(xiàn)存在于蝦的體內(nèi)，在溫哥華島東海岸的幼年奇努克鮭魚(yú)體內(nèi)[5]、伊比利亞群島常見(jiàn)的海豚胃中[6]均有微塑料的蹤跡。 歐洲鱈魚(yú)、螃蟹、海鳥(niǎo)、南極企鵝、雙殼類(lèi)生物以及市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的冷凍魚(yú)中也發(fā)現(xiàn)了或多或少的微塑料，甚至日常生活中不可或缺的海鹽中也有微塑料的蹤跡。 雖然微塑料廣泛存在于海洋生態(tài)系統(tǒng)中，但大部分的微塑料都來(lái)源于陸地[7]。 耕地是生產(chǎn)糧食必不可少的，但有的高原耕地卻也存在嚴(yán)重的微塑料污染[8]，這就可能導(dǎo)致種植出的糧食中含有微塑料。 2019年，Panebianco等首次在陸生蝸牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了微塑料[9]。 諸如瓶裝水、罐裝魚(yú)等產(chǎn)品中檢測(cè)出微塑料的報(bào)道表明微塑料這一新興污染物已經(jīng)普遍存在于我們身邊。

雖然小于20 μm的微塑料不能在組織中轉(zhuǎn)移，但更小尺寸的微塑料被吸收轉(zhuǎn)移的概率會(huì)大大增加，如2 μm的微塑料就可被牡蠣吸收[10]。 人類(lèi)位于生物鏈的最頂端，微塑料最終會(huì)在人體內(nèi)聚集，引發(fā)呼吸道過(guò)敏、呼吸困難、咳嗽等癥狀，進(jìn)而引發(fā)哮喘、心血管類(lèi)疾病，甚至可能引發(fā)癌癥，對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。 微塑料污染日益嚴(yán)重，對(duì)生物及人類(lèi)造成的影響也是不可估量的，因此研究微塑料的來(lái)源、傳播以及治理問(wèn)題是刻不容緩的。

目前，人們對(duì)于微塑料的提取、檢測(cè)及鑒定有幾種不同的方法。 對(duì)于微塑料的提取大多數(shù)采用的是浮選法、密度分離法及過(guò)濾法，提取出微塑料后再利用顯微鏡進(jìn)行目視觀察，或運(yùn)用拉曼光譜技術(shù)[11]、傅里葉紅外光譜技術(shù)[12]、熱解氣相色譜與質(zhì)譜法[13]、高光譜成像等進(jìn)行檢測(cè)與鑒定。 土壤樣品中的微塑料可采用浮選法進(jìn)行提取，然后利用顯微鏡觀察結(jié)合加熱法進(jìn)行鑒定，由于土壤樣品中的微塑料受熱熔化后會(huì)轉(zhuǎn)化為圓形透明顆粒，而有機(jī)物、硅酸鹽等其他雜質(zhì)在受熱后不發(fā)生變化，因此利用加熱法進(jìn)行處理，再利用顯微鏡進(jìn)行目視觀察，對(duì)土壤中的微塑料的提取率可高達(dá)90%[14]。 對(duì)環(huán)境中微塑料的提取一般還較為簡(jiǎn)單，而提取生物體內(nèi)的微塑料則需要更復(fù)雜的樣品處理，首先要消解生物組織中的有機(jī)物，可向樣品中加入H2O2，HNO3[11]和KOH溶液[12]等試劑達(dá)到目的，然后再采用過(guò)濾的方式進(jìn)行提取，最后將過(guò)濾所得的濾渣放在高倍顯微鏡下觀察[5]，或結(jié)合拉曼光譜、傅里葉紅外光譜、高光譜成像等方法進(jìn)行識(shí)別與鑒定。

可見(jiàn)在提取微塑料的過(guò)程中不論是哪種方法，都需要較長(zhǎng)時(shí)間的等待，甚至需要復(fù)雜的樣品處理。 諸多檢測(cè)方法中，目視檢測(cè)對(duì)于檢測(cè)大塊的微塑料比較直觀，但受主觀因素的影響較多，而對(duì)于小尺寸微塑料的鑒別，拉曼光譜檢測(cè)與傅里葉紅外光譜檢測(cè)有一定的優(yōu)勢(shì)，但也需要對(duì)可疑顆粒進(jìn)行逐個(gè)分析。 鑒于此，開(kāi)發(fā)一種快速、準(zhǔn)確鑒別環(huán)境中是否含有微塑料的技術(shù)是有必要的。 因此提出使用多通道圖像采集的方法檢測(cè)環(huán)境中的微塑料，并結(jié)合形態(tài)學(xué)分析與中值濾波的算法直觀顯示出微塑料在環(huán)境中的分布。

選取海水及沙子為研究對(duì)象，由于聚苯乙烯和聚乙烯是世界上最常用的塑料，也是海洋環(huán)境中最常見(jiàn)的塑料，所以我們選擇將聚苯乙烯微球摻入到海水及沙子中模擬被微塑料污染的海水和沙子，在不進(jìn)行任何處理的情況下，利用多通道圖像采集系統(tǒng)同時(shí)獲得樣品白光通道下的圖像及相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes Raman scattering, CARS)光譜成像信號(hào)，通過(guò)CARS光譜成像結(jié)合形態(tài)學(xué)分析與中值濾波算法，直觀地顯示出海水及沙子中的聚苯乙烯微球的分布，同時(shí)與拉曼光譜檢測(cè)進(jìn)行了對(duì)照。

1 原 理

1.1 CARS光譜成像原理

1965 年，Terhune和Maker等發(fā)現(xiàn)了CARS現(xiàn)象。 CARS光譜成像是一種基于非線(xiàn)性光學(xué)與分子振動(dòng)的四波混頻過(guò)程，在CARS光譜成像過(guò)程中，通常使用泵浦光(頻率為ωp)和斯托克斯光(頻率為ωs)兩束光同時(shí)激發(fā)樣品，本研究中采用正向CARS，當(dāng)兩者頻率的差值正好等于所要探測(cè)的化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率ωR(即共振條件ωR=ωp-ωs)，同時(shí)又滿(mǎn)足匹配條件Ka=2Kp±Ks時(shí)，會(huì)激發(fā)出頻率為ωas=2ωp-ωs的反斯托克斯光(圖1)。 通過(guò)調(diào)節(jié)延時(shí)線(xiàn)使兩束光達(dá)到匹配從而得到反斯托克斯信號(hào)。 CARS光譜成像作為一種成像手段，具有非侵入性、非破壞性、實(shí)時(shí)性且可三維成像的特點(diǎn)，常被應(yīng)用于化學(xué)、材料、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，如利用CARS對(duì)活體小鼠中C—H化學(xué)鍵進(jìn)行成像[15]。 CARS光譜成像不需要特殊制備或處理樣品，因此把它用來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的微塑料。

圖1 CARS示意圖Fig.1 The schematic of CARS process

1.2 算法分析

圖2 算法流程圖Fig.2 Algorithmic framework

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器及材料

使用RENISHAW(INVIA)拉曼光譜儀(激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，輸出功率5.15 mW)、Olympus FV1200MPE系統(tǒng)的多光子激光掃描顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)800 nm，泵浦光功率149 mW，斯托克斯光功率81 mW)、電子天平(上海梅特勒J(rèn)B/T)、高速離心機(jī)(TG16-WS)。

材料為直徑10 μm，濃度為0.05 g·mL-1的聚苯乙烯微球(上海麥克林生化科技有限公司)、海水(采集于大連市東港)、沙子(采集于中國(guó)大連星海浴場(chǎng))。

2.2 方法

將10 μL的聚苯乙烯微球與3 mL海水均勻混合作為海水的實(shí)驗(yàn)樣品。 將聚苯乙烯微球加去離子水稀釋至0.001 g·mL-1，取0.5 mL加入到2 g干沙中，混合均勻(用離心機(jī)以8 000 r·min-1離心3 min)作為沙子的實(shí)驗(yàn)樣品。

拉曼光譜在檢測(cè)環(huán)境中的微塑料方面已經(jīng)是一種成熟的手段，因此將拉曼光譜檢測(cè)作為一種對(duì)照方法。 對(duì)樣品進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)與多通道的圖像采集，并進(jìn)行分析。

采用Origin9.0軟件繪制曲線(xiàn)圖，采用FV10-ASW 4.2 Viewer進(jìn)行多通道采集圖像的簡(jiǎn)單處理，采用Matlab R2017a進(jìn)行算法處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚苯乙烯微球的拉曼光譜與多通道圖像采集

為了能夠準(zhǔn)確辨別海水及沙子中的聚苯乙烯微球，首先對(duì)聚苯乙烯進(jìn)行了拉曼光譜檢測(cè)及多通道圖像采集。 聚苯乙烯在998，1 597和3 047 cm-1等位置處有明顯的拉曼頻移，且拉曼頻移信號(hào)的強(qiáng)度隨著微球濃度的降低而減弱(圖3)。 選取聚苯乙烯中由苯環(huán)內(nèi)碳原子之間非對(duì)稱(chēng)收縮引起的1 597 cm-1處的拉曼頻移進(jìn)行多通道圖像采集。 在多通道圖像采集中使用800 nm的飛秒激光作為激發(fā)光源，通過(guò)分光鏡將激光分為兩束，其中一束光作為泵浦光，另一束光經(jīng)過(guò)光子晶體拓寬為一束寬譜帶的光，兩束光同時(shí)照射在樣品上，激發(fā)出反斯托克斯信號(hào)，通過(guò)放置合適的濾光片，得到特定波數(shù)的CARS光譜成像信號(hào)，此處采用的為正向的。 在CARS光譜成像通道中放置(710±6.5) nm的濾光片可獲取1 597 cm-1拉曼頻移處的信號(hào)，調(diào)節(jié)延時(shí)線(xiàn)使其相位匹配，得到了聚苯乙烯的以1 597 cm-1為中心的多通道圖像采集信號(hào)(圖4)，其CARS光譜成像信號(hào)與白光通道下聚苯乙烯的輪廓可以一一對(duì)應(yīng)，且不會(huì)隨著小球的濃度變化而發(fā)生變化。

圖3 不同濃度聚苯乙烯微球的拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectrum of polystyreneat different concentrations

3.2 海水中微塑料的檢測(cè)

在對(duì)海水中的聚苯乙烯進(jìn)行多通道圖像采集時(shí)，信號(hào)明顯且與白光通道下觀察到的聚苯乙烯輪廓一一對(duì)應(yīng)。 由于激光照射加快了海水蒸發(fā)的過(guò)程并析出鹽顆粒，海水發(fā)生了結(jié)晶，雖然結(jié)晶部位有微弱的CARS光譜成像信號(hào)，但經(jīng)過(guò)一次開(kāi)運(yùn)算算法，可以直觀地看到聚苯乙烯在海水中的分布(圖5)。

圖4 以1 597 cm-1為中心的聚苯乙烯微球的多通道成像(a)： 白光通道成像；(b): CARS光譜成像Fig.4 Multi-channel imaging of polystyrenecentered at 1 597 cm-1(a)： The white light imaging；(b): The CARS imaging

圖5 以1 597 cm-1為中心的聚苯乙烯在海水中的多通道成像(a)： 白光通道成像；(b): CARS光譜成像Fig.5 Multi-channel imaging of polystyrenecentered at 1 597 cm-1 in seawater(a)： The white light imaging；(b): The CARS imaging

適當(dāng)增加多通道圖像采集的曝光時(shí)間，可以使以1 597 cm-1為中心的聚苯乙烯信號(hào)更加清晰(圖6)。 雖然結(jié)晶部位的信號(hào)也得到了增強(qiáng)，但結(jié)晶的信號(hào)普遍位于結(jié)晶部位附近，對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響不大。 進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)掃描時(shí)，以1 597cm-1為中心的聚苯乙烯信號(hào)強(qiáng)度減弱，原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的照射，激光的熱量過(guò)高導(dǎo)致小球熔化，如圖7所示，箭頭所指位置為含有聚苯乙烯的位置。 可以看出，多通道圖像采集在檢測(cè)海水中聚苯乙烯時(shí)不受其他成分干擾，可以快速直觀地看到聚苯乙烯的分布情況，雖然隨著照射時(shí)間增長(zhǎng)，局部熱量導(dǎo)致水分蒸發(fā)，海水結(jié)晶，會(huì)對(duì)成像有一定的影響，CARS系統(tǒng)的單幅掃描成像時(shí)間可以在幾秒鐘完成，完全可以避免海水結(jié)晶的干擾。

圖6 不同曝光時(shí)間下海水中聚苯乙烯的CARS光譜成像信號(hào)(a)： 曝光時(shí)間2 μs·像素-1；(b): 曝光時(shí)間8 μs·像素-1

圖7 連續(xù)掃描下海水中聚苯乙烯的CARS光譜成像信號(hào)Fig.7 CARS imaging of polystyrene in seawaterunder continuous scanning

3.3 沙子中的微塑料檢測(cè)

在對(duì)沙子中的微塑料進(jìn)行檢測(cè)之前，由于沙子中有較大顆粒，其大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出聚苯乙烯微球的大小，為了避免沙子本身信號(hào)形成的干擾，首先對(duì)沙子進(jìn)行了檢測(cè)。

為了檢測(cè)沙子與聚苯乙烯是否有重疊的拉曼頻移，我們對(duì)沙子進(jìn)行了拉曼光譜檢測(cè)。 由于沙子普遍有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，在700～3 200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)只有一個(gè)大的熒光峰，沒(méi)有明顯的拉曼頻移。 對(duì)所得拉曼光譜圖進(jìn)行了去基線(xiàn)處理，取100～700 cm-1波數(shù)范圍的拉曼光譜，如圖8所示(為了直觀地區(qū)分沙粒的顏色，圖8中同時(shí)展示了顯微鏡下沙粒的形態(tài))。 沙子在479 cm-1處有較小的拉曼頻移，隨著沙粒顏色逐漸變淺，該拉曼頻移的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，同時(shí)在125，201和461 cm-1位置處出現(xiàn)了新的拉曼頻移。 由于沙子主要是由礦物和微小的巖石碎片組成，且具體成分因地而異，我們認(rèn)為拉曼頻移及強(qiáng)度的差異是由于不同沙粒組成成分及含量的不同導(dǎo)致的。 在對(duì)沙子進(jìn)行多通道圖像采集時(shí)，淺色的接下來(lái)對(duì)沙子與聚苯乙烯混合后的樣品進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，沿一直線(xiàn)取十個(gè)點(diǎn)依次進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，沙子有強(qiáng)烈的熒光，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行去基線(xiàn)處理后，發(fā)現(xiàn)只有在激光聚焦在聚苯乙烯存在的位置時(shí)，才能檢測(cè)到微弱的信號(hào)(圖10)。 對(duì)沙子中的單個(gè)聚苯乙烯進(jìn)行檢測(cè)，聚苯乙烯的大部分信號(hào)會(huì)被沙子的強(qiáng)熒光遮住，進(jìn)行去基線(xiàn)及平滑處理后，可以看到較小的信號(hào)(圖11)。 由此可見(jiàn)，運(yùn)用拉曼光譜檢測(cè)的方法來(lái)檢測(cè)沙子中的聚苯乙烯具有一定的局限性，若要準(zhǔn)確的測(cè)得沙子中是否含有聚苯乙烯就要進(jìn)行拉曼逐點(diǎn)掃描成像，這一過(guò)程非常耗時(shí)，且沙子的熒光對(duì)聚苯乙烯的檢測(cè)有較大影響，需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理才能得到想要的結(jié)果。

圖8 不同沙粒的拉曼光譜圖Fig.8 Raman spectrum of different sand

沙粒幾乎沒(méi)有CARS光譜成像信號(hào)，而深色沙粒有較強(qiáng)的CARS光譜成像信號(hào)(圖9)，這也進(jìn)一步證實(shí)了不同顏色的沙粒組成成分的不同。 對(duì)于細(xì)小沙粒，CARS光譜成像信號(hào)多為小且離散的信號(hào)，這與以1 597 cm-1為中心的聚苯乙烯的信號(hào)相比有較大的差別。

圖9 沙粒的多通道成像 (a)，(b) 分別為透明沙粒的白光及CARS光譜成像信號(hào)； (c)，(d) 分別為深色沙粒的白光及CARS光譜成像信號(hào)Fig.9 Multi-channel imaging of sand

對(duì)其進(jìn)行多通道圖像采集，與海水的多通道圖像采集結(jié)果不同，沙子對(duì)聚苯乙烯的檢測(cè)有一定的干擾。 如圖11所示，CARS光譜成像信號(hào)中有大且聚集信號(hào)和一些點(diǎn)狀離散信號(hào)。 將白光通道成像與CARS光譜成像信號(hào)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)較大且聚集的信號(hào)與聚苯乙烯的輪廓相符(圖12)，其中黃色圓圈標(biāo)記的位置是可以確定為聚苯乙烯的位置，點(diǎn)狀離散信號(hào)可以確定為沙子本身的信號(hào)，在該檢測(cè)過(guò)程中為干擾信號(hào)。 由于在CARS光譜成像信號(hào)中并不能明顯地從沙子中辨別出聚苯乙烯，對(duì)圖像進(jìn)行算法處理。 因?yàn)榫郾揭蚁┡c沙子的信號(hào)尺寸差距較大，首先采用濾波算法進(jìn)行處理。 然而經(jīng)過(guò)3×3的中值濾波算法后仍然存在大范圍的沙子信號(hào)的干擾[圖13(a)]。 由于聚苯乙烯微球有一定的體積，在進(jìn)行多通道圖像采集過(guò)程中可能存在不同的聚苯乙烯微球在不同的焦平面從而使得聚苯乙烯的信號(hào)不夠均勻，邊界不夠平滑，這可能導(dǎo)致在濾波過(guò)程中將有效信息濾除，因此提出運(yùn)用先腐蝕后膨脹的開(kāi)運(yùn)算算法，得到的結(jié)果仍然不夠直觀[圖13(b)]。 經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腐蝕膨脹與中值濾波相結(jié)合的算法可以得到較好的結(jié)果。 首先通過(guò)3×3的中值濾波結(jié)合圖像腐蝕算法去除掉沙子的點(diǎn)狀信號(hào)，再經(jīng)過(guò)中值濾波結(jié)合膨脹算法填充聚苯乙烯的信號(hào)，使其信號(hào)均勻，邊界平滑，便于觀察。 經(jīng)此過(guò)程可以濾除掉大部分沙子的點(diǎn)狀離散信號(hào)而保留聚苯乙烯的大且聚集信號(hào)。 雖然所得結(jié)果不夠精確，但能夠直觀地看到聚苯乙烯在沙子中的分布[圖13(c)]。

圖10 含有聚苯乙烯的沙子中不同位置的拉曼光譜圖Fig.10 Raman spectrum of different locationsin sand containing polystyrene

圖12 以1 597 cm-1為中心的聚苯乙烯在沙子中的CARS光譜成像信號(hào)Fig.12 CARS imaging of polystyrene insand centered at 1 597 cm-1

圖13 不同算法處理后的以1 597 cm-1為中心的聚苯乙烯在沙子中的CARS光譜成像信號(hào)(a)： 僅中值濾波；(b): 開(kāi)運(yùn)算；(c): 濾波與開(kāi)運(yùn)算結(jié)合Fig.13 CARS imaging of polystyrene in sand after processing by algorithm(a)： Median filter; (b): Erode and dilation; (c): Corrosion and expansion combined with median filtering

4 結(jié) 論

運(yùn)用多通道圖像采集的方法快速檢測(cè)出海水及沙子中的微米級(jí)聚苯乙烯。 對(duì)于毫米級(jí)的微塑料，該檢測(cè)手段的準(zhǔn)確率將大幅提高。 對(duì)于不同種類(lèi)的微塑料，如聚乙烯、聚丙烯等，可以以不同的拉曼頻移為中心，選用對(duì)應(yīng)的濾光片進(jìn)行成像。 與目前其他檢測(cè)手段相比，在不進(jìn)行預(yù)處理的情況下，多通道圖像采集對(duì)于微米量級(jí)的微塑料可以快速識(shí)別，也展現(xiàn)出了其對(duì)環(huán)境中的微塑料檢測(cè)方面應(yīng)用潛力。