RNAscope原位雜交技術(shù)在胃癌PD-1、PD-L1表達(dá)分析中的應(yīng)用

繆小兵，沈 蓉，張邢松，尹海兵

程序性死亡受體-1(programmed death 1, PD-1)及其配體程序性死亡配體-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已證實(shí)，PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞和(或)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞中表達(dá)異常。抗PD-1抗體已被批準(zhǔn)用于胃腺癌的臨床治療?，F(xiàn)階段，通過免疫組化法評(píng)估PD-L1表達(dá)是預(yù)測(cè)抗PD-1/PD-L1免疫療法是否有效的主要手段[1-2]。目前已有多個(gè)商品化PD-L1免疫組化抗體，不同抗體使用的檢測(cè)平臺(tái)、判讀標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)的陽性閾值均不同，這可能會(huì)導(dǎo)致不一致的治療選擇[3]。RNAscope原位雜交技術(shù)是一種新型抗體非依賴性分析法，可在石蠟包埋組織中進(jìn)行RNA原位雜交，因其特異性和可重復(fù)性較好而受到青睞[4]。本文通過RNAscope原位雜交、免疫組化法檢測(cè)胃癌組織中PD-1、PD-L1的表達(dá)，探討其在胃癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年7月～2015年11月江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院病理科確診的胃癌石蠟標(biāo)本255例，制作成組織芯片。其中男性197例，女性58例。患者年齡24～83歲，中位年齡66歲。所有患者術(shù)前均未行化療或放療。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 RNAscope原位雜交PD-1特異性探針(Hs-PDCD1)、PD-L1特異性探針(Hs-CD274)購自美國Advanced Cell Diagnostics公司，檢測(cè)步驟按Advanced Cell Diagnostics公司RNAscope 2.5 HD試劑盒說明書進(jìn)行。RNAscope結(jié)果判讀：PD-1、PD-L1 mRNA陽性為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中有棕色點(diǎn)，呈棕黃色顆粒狀，計(jì)數(shù)和得分如下：1～10個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞為1分，11～15個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞為2分，16～20個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞為3分，>20個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞為4分；將得分≥1分判斷為細(xì)胞陽性[5]。PD-1 mRNA陽性信號(hào)定位于腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞，陽性細(xì)胞比例≥5%定義為PD-1陽性。PD-L1 mRNA陽性信號(hào)定位于腫瘤細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞，參考Yuan等[4]的標(biāo)準(zhǔn)，將腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞≥1%陽性定義為PD-L1 mRNA陽性。

1.3 免疫組化一抗PD-1(UMAB199，稀釋度1 ∶100)購自北京中杉金橋公司，PD-L1(22C3，稀釋度1 ∶50)購自Dako公司，二抗及DAB購自Dako公司。免疫組化采用EnVision法，操作步驟嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，用已知陽性組織作為陽性對(duì)照。PD-1陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，按細(xì)胞著色程度：無陽性著色為0，淡黃色為1+，棕黃色為2+，棕褐色為3+。PD-1主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞，著色2+和3+的細(xì)胞比例≥5%時(shí)定義為PD-1陽性[6]。PD-L1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞PD-L1陽性染色定位于細(xì)胞膜(部分或完全膜染色)，免疫細(xì)胞PD-L1陽性染色為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜染色。PD-L1評(píng)分采用聯(lián)合陽性評(píng)分(combined positive score, CPS)法，CPS=PD-L1陽性細(xì)胞數(shù)(腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)/活腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100，將CPS≥1定義為PD-L1陽性[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析PD-1、PD-L1免疫組化及RNAscope檢測(cè)結(jié)果比較采用McNemar-Bowker檢驗(yàn)，一致性分析使用Kappa值，Kappa值<0.4代表兩者一致性差，0.4≤Kappa值<0.6代表一致性中等，0.6≤Kappa值<0.8代表一致性較好，Kappa值≥0.8代表一致性很好[8]。采用Pearson χ2檢驗(yàn)分析PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1免疫組化與RNAscope檢測(cè)結(jié)果的一致性比較RNAscope檢測(cè)顯示：255例胃癌組織中PD-1 mRNA陽性52例，陽性率為20.39%(表1，圖1)；PD-L1 mRNA陽性36例，陽性率為14.12%(表1，圖2)。免疫組化檢測(cè)顯示：255例胃癌組織中PD-1蛋白陽性36例，陽性率為14.12%(表1，圖3)；PD-L1蛋白陽性28例，陽性率為10.98%(表1，圖4)。免疫組化與RNAscope檢測(cè)的一致性分析顯示：PD-1的一致性較差(Kappa=0.154，P=0.012)；PD-L1的一致性中等(Kappa=0.465，P<0.001，表1)。

圖1 胃癌組織中腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞PD-1 mRNA陽性，RNAscope法圖2 胃癌組織中腫瘤細(xì)胞及部分間質(zhì)免疫細(xì)胞PD-L1 mRNA陽性，RNAscope法 圖3 胃癌組織中腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞PD-1蛋白陽性，EnVision法 圖4 胃癌組織中腫瘤細(xì)胞及少量間質(zhì)免疫細(xì)胞PD-L1蛋白陽性，EnVision法

表1 RNAscope和免疫組化檢測(cè)胃癌中PD-1、PD-L1表達(dá)結(jié)果的一致性

2.2 PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、Lauren分型、pT分期、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期及腫瘤直徑均無關(guān)(P均>0.05，表2)。

表2 PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier分析顯示：PD-1 mRNA表達(dá)與患者總生存期(overall survival, OS)無關(guān)(P=0.270，圖5A)；PD-L1 mRNA表達(dá)與患者OS相關(guān)，PD-L1 mRNA陽性患者較陰性患者的OS延長(P=0.017，圖5B)。

圖5 A.Kaplan-Meier法分析PD-1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系;B.Kaplan-Meier法分析PD-L1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

人類PD-1由2號(hào)染色體上的Pdcd1基因編碼，屬于免疫球蛋白B7-CD28家族成員，是一種由288個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-1包含一個(gè)免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域、一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的莖、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)約95個(gè)殘基構(gòu)成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含免疫受體酪氨酸抑制基序以及免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序。PD-1可表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞，而靜止T細(xì)胞通常不表達(dá)PD-1。PD-L1(也稱為CD274、B7-H1)是PD-1的配體之一，是一種由290個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，人類PD-L1由9號(hào)染色體上的Cd274基因編碼。PD-L1除在腫瘤細(xì)胞表達(dá)外，在T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中也有表達(dá)[9-10]。

以PD-1和PD-L1為靶點(diǎn)的免疫治療已在多種不同腫瘤中顯示出較好的療效。PD-L1蛋白是預(yù)測(cè)抗PD-1治療(帕博利珠單抗)治療反應(yīng)的常用生物標(biāo)志物。據(jù)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌、胃腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、子宮頸癌、尿路上皮癌、三陰型乳腺癌以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中，使用PD-L1 22C3 pharmDx評(píng)估PD-L1表達(dá)有助于預(yù)測(cè)患者是否可從帕博利珠單抗治療中獲益[11]?，F(xiàn)階段，有多個(gè)商品化PD-L1免疫組化抗體，不同抗體使用的檢測(cè)平臺(tái)、判讀標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)的陽性閾值均不同，這可能會(huì)導(dǎo)致不一致的治療選擇。現(xiàn)已證實(shí)，并非所有商品化PD-L1抗體均具有特異性，RNAscope技術(shù)可能是一種可行的替代檢測(cè)方法[12]。RNAscope技術(shù)是美國Advanced Cell Diagnostics公司開發(fā)的一項(xiàng)新型原位mRNA檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理可對(duì)特定基因的mRNA進(jìn)行檢測(cè)。RNAscope檢測(cè)因不依賴于抗體，探針可重復(fù)生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)而受到重視[5, 13-14]。

李瑩瑩等[6]報(bào)道，RNAscope和免疫組化法檢測(cè)非特殊型浸潤性乳腺癌中PD-1、PD-L1表達(dá)的一致性較好。而在非小細(xì)胞癌中，RNAscope和免疫組化法檢測(cè)PD-1的一致性較差，檢測(cè)PD-L1的一致性一般[15]。在胃腸道間質(zhì)瘤中，RNAscope和免疫組化法檢測(cè)PD-1、PD-L1表達(dá)的一致性均一般[13]。本文通過RNAscope技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌組織中PD-1 mRNA陽性率為20.39%，PD-L1 mRNA陽性率為14.12%；免疫組化檢測(cè)顯示胃癌組織中PD-1蛋白陽性率為14.12%，PD-L1蛋白陽性率為10.98%。免疫組化與RNAscope檢測(cè)的一致性分析顯示：PD-1的一致性較差，PD-L1的一致性中等。Yuan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展期胃癌中PD-L1 mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤分化、轉(zhuǎn)移無關(guān)，與Lauren分型相關(guān)：PD-L1 mRNA在腸型胃癌中的表達(dá)顯著高于彌漫型胃癌。與上述研究不完全相同，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)與患者性別、年齡、Lauren分型、pT分期、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期及腫瘤直徑均無關(guān)。此外，Yuan等[4]研究亦發(fā)現(xiàn)，PD-L1 mRNA表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者的OS以及無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)無關(guān)。本組結(jié)果顯示，PD-1 mRNA表達(dá)與患者OS無關(guān)；但PD-L1 mRNA表達(dá)與患者OS相關(guān)，PD-L1 mRNA陽性患者較PD-L1 mRNA陰性患者OS延長。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNAscope和免疫組化法檢測(cè)PD-1的一致性較差，PD-L1的一致性中等；PD-1 mRNA表達(dá)與患者OS無關(guān)，但PD-L1 mRNA陽性患者較PD-L1 mRNA陰性患者OS延長。