拮抗霍亂弧菌菌株枯草芽孢桿菌YB-99的篩選及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

楊傳倫，車樹剛，張心青，陳振發(fā)，王建平，王秀芝

(黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500)

0 引言

【研究意義】水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌病是一種由弧菌引起的常見病害[1]，弧菌生命力強且繁殖速度快，營養(yǎng)需求低，一旦養(yǎng)殖水體中弧菌數(shù)量未得到有效控制，弧菌會爆發(fā)性繁殖，導(dǎo)致水體惡化[2-3]。水產(chǎn)動物由于環(huán)境改變將導(dǎo)致機體免疫減弱，弧菌乘勢入侵，出現(xiàn)白便、偷死、潰爛、發(fā)育異常等癥狀[4-5]。若不及時控制水體中的弧菌，一旦爆發(fā)后果將難以預(yù)測，輕者會導(dǎo)致大量養(yǎng)殖體死亡[6]，重者將面臨絕產(chǎn)[7]。因此，開展弧菌病防治研究，對促進水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色生態(tài)持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】導(dǎo)致弧菌病的病原菌主要包括鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)等[8-9]。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中弧菌病防治的主要手段仍為化學方法[10]，如抗生素與消毒劑的交替使用[11]，然而養(yǎng)殖過程中抗生素等化學藥劑的重復(fù)、大量使用勢必會提高弧菌的耐藥性與抗藥性，同時化學藥劑對養(yǎng)殖水體的污染是不可逆的[12]，更不會被水體降解，長期食用這些被化學藥劑污染的產(chǎn)品對人體也是百害而無利[13-14]。因此，亟需尋找能夠高效抑制水體中弧菌繁殖的且不會對水體環(huán)境造成破壞的產(chǎn)品或技術(shù)為水產(chǎn)養(yǎng)殖保駕護航?！狙芯壳腥朦c】近年來，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究備受關(guān)注，益生菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖的益處是多方位的，多集中于凈化水體、促進養(yǎng)殖體生長、通過分泌小分子物質(zhì)提高動物體免疫力及對水體中病原菌的競爭性抑制等，甄曉然等[15-16]篩選出對副溶血性弧菌具有拮抗作用的弧菌，拮抗效果達90%，但未進行應(yīng)用效果評價，而且多數(shù)學者主要是針對海水養(yǎng)殖中的弧菌進行研究，鮮有對淡水養(yǎng)殖尤其是霍亂弧菌拮抗方面的研究報道[17-18]。目前，主要應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的微生物菌劑包括酵母菌(Yeast)、乳酸菌(Lacticacidbacteria)及芽孢桿菌(Bacillus)等[19]，由于芽孢桿菌抗逆性強、易保存、可以分泌多種不同結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)等特點，在微生態(tài)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注?！緮M解決的關(guān)鍵問題】黃河三角洲京博化工研究院研究團隊多次對山東喬莊水產(chǎn)養(yǎng)殖基地取樣分析，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體中的弧菌多為霍亂弧菌，因此以實驗室分離的霍亂弧菌為研究對象，以喬莊養(yǎng)殖戶中廣泛好評的弧菌清藥劑為對照，篩選分離對霍亂弧菌具有拮抗效果的菌株，從拮抗株中篩選得到效果最優(yōu)的菌株并將其應(yīng)用于南美白對蝦養(yǎng)殖中，考察拮抗菌株對水產(chǎn)養(yǎng)殖池水體霍亂弧菌的拮抗效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌病生物防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株及水產(chǎn)動物 病原菌菌株霍亂弧菌(V.cholerae)為黃河三角洲京博化工研究院實驗室菌種庫保存，分離自山東喬莊水產(chǎn)養(yǎng)殖基地；拮抗菌株為實驗室菌種庫保存的120株芽孢桿菌類菌株，依次命名為YB-1至YB-120；試驗水產(chǎn)動物為南美白對蝦，蝦苗規(guī)格0.62 g/尾。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，檸檬酸三銨2 g，葡萄糖20 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，磷酸氫二鉀2 g，吐溫-80 1 mL，瓊脂20 g，蒸餾水，pH6.2～6.4；LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水，pH7.2～7.4；YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，蒸餾水，pH自然；TCBS培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，硫代硫酸鈉10 g，枸櫞酸鈉10 g，牛膽粉5 g，牛膽酸鈉3 g，蔗糖20 g，氯化鈉10 g，檸檬酸鐵1 g，溴麝香草酚蘭0.04 g，麝香草酚蘭0.04 g，瓊脂15 g，pH 8.5～8.7；弧菌清(100 g/瓶，是防治霍亂弧菌的常用藥劑),購買自上海西格生物科技有限公司。

1.1.3 試驗器材 恒溫振蕩器SHY-2(THZ-82),常州中捷精密機械有限公司；生化培養(yǎng)箱BJPX,山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；電子天平FB124，上海齊強儀器制造有限公司；滅菌鍋YXQ-75G，上海博迅實業(yè)有限公司；超凈工作臺VS-840，蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選

1)拮抗菌株初篩。采用濾紙片法[20]，分別將活化后的病原菌(霍亂弧菌)和拮抗菌株接種入新鮮的無菌LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，取100 μL指示菌涂布于新鮮的TCBS固體培養(yǎng)基中，用無菌打孔器在涂過指示菌的平板上等距離打2個直徑10 mm已滅菌孔，取10 μL待測菌液滴于孔內(nèi)，同時設(shè)置弧菌清藥劑(稀釋1 000倍后取10 μL滴于孔內(nèi))作為對照，然后35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，24 h左右觀察孔周圍是否出現(xiàn)抑菌圈并測量其直徑，初步篩選拮抗菌株。

2)拮抗菌株復(fù)篩。采用共培養(yǎng)法[20]，分別刮取活化后的拮抗菌株和霍亂弧菌接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，分別吸取200 μL霍亂弧菌和拮抗菌菌液接入同一個裝有100 mL稀釋5倍的液體LB培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)共培養(yǎng)，以未接種拮抗菌株的LB液體培養(yǎng)基為對照，37℃、150 r/min培養(yǎng)過夜，16 h后采用10倍遞增稀釋法稀釋，選擇合適濃度(平板上菌落數(shù)30～300個為宜)涂布于新鮮的 TCBS固體培養(yǎng)基中，放入恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，考察拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗率，篩選最優(yōu)拮抗菌株。

1.2.2 拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗試驗

1)實驗室接種試驗。4℃冰箱中取出拮抗菌株平板，在超凈工作臺用無菌的接種環(huán)小心挑取平板上的單菌落接種于100 mL無菌LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h。于500 mL錐形瓶中加入100 mL喬莊南美白對蝦養(yǎng)殖水。取25 mL培養(yǎng)完成的拮抗株發(fā)酵液，4 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，將離心后的菌體接入養(yǎng)殖水中(處理組)，同時以未接種拮抗菌的為對照組，每組2個重復(fù)，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每天取樣檢測弧菌變化，連續(xù)檢測3 d，即在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時考察霍亂弧菌的菌量及其拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗率。

2)南美白對蝦養(yǎng)殖池應(yīng)用試驗。2020年7—9月,在山東喬莊某農(nóng)戶的室外南美白對蝦養(yǎng)殖池開展拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗試驗。養(yǎng)殖池面積1 000 m2，投殖密度約53尾/m2，蝦苗投放15 d后開始投加菌劑。4℃冰箱中取出拮抗菌株平板，在超凈工作臺用無菌接種環(huán)挑取平板上的單菌落接種于100 mL無菌LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h后轉(zhuǎn)接入1 L無菌LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，按照此方法制備10 L拮抗菌株發(fā)酵液待用。取10 L培養(yǎng)完成的拮抗菌株發(fā)酵液，4 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，離心后的菌體接入其中1個養(yǎng)殖池中(處理組)，同時以施用弧菌清藥劑處理的為對照組。試驗開始后每隔15 d取樣1次，連續(xù)取樣5次，按照平板涂布方式檢測水體中弧菌菌量。養(yǎng)殖池出蝦時進行蝦重、成活率等生物量的檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel、Microsoft PowerPoint和SPSS等進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗霍亂弧菌的枯草芽孢桿菌YB-99的獲得

初篩選結(jié)果表明，在120株芽孢桿菌中，YB-9、YB-45、YB-95、YB-95、YB-96、YB-99、YB-119菌株對霍亂弧菌的抑菌圈直徑極顯著大于對照藥劑(弧菌清)，其中以菌株YB-99的抑菌圈直徑最大，達2.20 cm。因此，初步判斷該6株菌株對霍亂弧菌具有拮抗效果。對初篩獲得的6株拮抗菌株進行共培養(yǎng)復(fù)篩，結(jié)果(表1)表明，對霍亂弧菌拮抗率最高的菌株為YB-99，拮抗率達96.80%。復(fù)篩與初篩結(jié)果高度吻合，因此選取菌株YB-99為霍亂弧菌拮抗菌株。

表1 6 株弧菌拮抗菌株對霍亂弧菌的拮抗率Table 1 The antagonistic rate of 6 strains against V. cholerae

2.2 枯草芽孢桿菌YB-99對霍亂弧菌的拮抗率

從表2看出，在實驗室接種試驗中，接種拮抗菌株YB-99的處理連續(xù)3 d即接種72 h內(nèi)對霍亂弧菌的拮抗率都保持90%以上，且隨接種時間推延拮抗率呈上升趨勢。另外，同一考察時間，空白對照的弧菌菌量遠高于接種拮抗菌株YB-99的處理，說明菌株YB-99在短時間內(nèi)可有效抑制弧菌的快速繁殖。

表2 不同接種時間枯草芽孢桿菌YB-99對霍亂弧菌的拮抗率Table 2 The antagonistic rate of B. subtilis YB-99 against V. cholerae with different inoculation time

2.3 枯草芽孢桿菌YB-99在南美白對蝦養(yǎng)殖池的應(yīng)用效果

2.3.1 抑制弧菌繁殖 從圖1可知，添加枯草芽孢桿菌YB-99的處理養(yǎng)殖池中霍亂弧菌菌量隨養(yǎng)殖時間延長略有增加，但變幅不大，一直保持在安全限值(小于103cfu/mL)[21]以內(nèi)，處理75 d時霍亂弧菌菌量為4.01×102cfu/mL。對照組(施用弧菌清)的弧菌菌量隨養(yǎng)殖時間延長呈上升趨勢，處理45 d時弧菌菌量由初始的1.55×102cfu/mL升至1.97×103cfu/mL，已超出安全限值；處理75 d時弧菌菌量升高至8.84×103cfu/mL。表明，枯草芽孢桿菌YB-99對弧菌繁殖具有抑制作用，其抑制效果明顯優(yōu)于對照藥劑弧菌清。

圖1 不同處理養(yǎng)殖池霍亂弧菌的菌量Fig.1 The number of V. cholerae with different treatments

2.3.2 促進南美白對蝦生長 從表3看出，不同抑菌處理養(yǎng)殖池南美白對蝦的生長存在較大差異。添加枯草芽孢桿菌YB-99處理的對蝦成活率為92.81%，蝦重為21.74 g/尾，池塘出蝦量1 372 kg，3項指標均明顯高于對照組(施用弧菌清)，原因是對照組池塘的弧菌量超限，對南美白對蝦的養(yǎng)殖造成一定負面影響。說明，枯草芽孢桿菌YB-99對霍亂弧菌的拮抗效果優(yōu)于藥劑弧菌清，施用枯草芽孢桿菌YB-99后可促進對蝦健康安全生長。

表3 不同抑菌處理養(yǎng)殖池南美白對蝦的生長情況Table 3 Growth status of P. vannamei cultured under different antimicrobial treatments

3 討論

隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，逐漸成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱[21]，由于對蝦對水體及環(huán)境的敏感性，弧菌病等爆發(fā)性流行疾病對對蝦養(yǎng)殖是致命性打擊，然而近年來抗生素類藥劑泛濫使用使水體中病原菌產(chǎn)生抗藥性，且對水體環(huán)境造成不可逆的污染，尋求安全高效的弧菌病防治技術(shù)是對蝦養(yǎng)殖業(yè)多年來的關(guān)注焦點。生物拮抗技術(shù)以調(diào)節(jié)水體微生態(tài)環(huán)境為手段達到水體凈化的效果[22]，對水環(huán)境及養(yǎng)殖體不會產(chǎn)生二次污染，而且在增強動物體免疫力及生長方面效果顯著，因此該技術(shù)近年來得到廣泛應(yīng)用。

生物拮抗技術(shù)的關(guān)鍵是高效拮抗株的篩選，黃河三角洲京博化工研究院從菌株的安全性及應(yīng)用現(xiàn)場水體環(huán)境出發(fā)，以實驗室菌種庫中保存的120株芽孢桿菌為篩選對象進行試驗，分別通過初篩與復(fù)篩確定高效拮抗株，通過微生態(tài)技術(shù)實現(xiàn)養(yǎng)殖水體中霍亂弧菌的高效拮抗，不但保護了水產(chǎn)養(yǎng)殖體免受弧菌的危害，而且對養(yǎng)殖環(huán)境不會產(chǎn)生破壞，是一種可持續(xù)低成本的養(yǎng)殖方法，具有化學方法所無法比擬的優(yōu)勢。

4 結(jié)論

黃河三角洲京博化工研究院實驗室通過初篩與復(fù)篩獲得高效拮抗霍亂弧菌的枯草芽孢桿菌YB-99，將其應(yīng)用于南美白對蝦養(yǎng)殖中，能夠抑制霍亂弧菌的繁殖，施用枯草芽孢桿菌YB-99處理75 d時養(yǎng)殖池的霍亂弧菌菌量為4.01×102cfu/mL，在弧菌菌量安全限值(小于103cfu/mL)以內(nèi)；而弧菌清對照組處理45 d時養(yǎng)殖池的弧菌菌量達1.97×103cfu/mL，已超出安全限值；處理75 d時弧菌菌量升高至8.84×103cfu/mL。說明養(yǎng)殖池中施用枯草芽孢桿菌YB-99可有效抑制弧菌繁殖。

施用拮抗菌枯草芽孢桿菌YB-99的養(yǎng)殖池南美白對蝦成活率達92.81%，較弧菌清對照組提高9.1%；出蝦時蝦重為21.74 g/尾，較對照組提高13.04%；施用YB-99菌組的南美白對蝦收益較對照組提高18.38%?？傮w看，枯草芽孢桿菌YB-99抑制養(yǎng)殖池中弧菌生長，保護蝦體免受弧菌侵染，從而提高對蝦的成活率與收益。