重慶地區(qū)辣椒疫霉交配型分布及對(duì)烯酰嗎啉的敏感性現(xiàn)狀

張世才 李怡斐 王春萍 楊小苗 段敏杰 黃任中 黃啟中

摘要 為明確重慶地區(qū)辣椒疫霉Phytophthora capsici交配型分布及對(duì)烯酰嗎啉的敏感性情況，對(duì)2019年-2020年分離的辣椒疫霉進(jìn)行交配型和敏感性測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)存在A1和A2兩種交配型，且兩者在大部分地區(qū)同時(shí)存在，測(cè)定的102株菌株中，24株菌株為A1交配型，78株為A2交配型，2種交配型的發(fā)生頻率分別為23.53%和76.47%。采自重慶潼南、巴南、石柱等地的102株辣椒疫霉菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性測(cè)定結(jié)果顯示，其EC50分布在0.107 5～0.438 3 μg/mL之間，最不敏感菌株是最敏感菌株的4.1倍，平均EC50為（0.296 2±0.005 3）μg/mL。102株菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性分布呈單峰曲線，未出現(xiàn)抗藥性病原菌亞群體。

關(guān)鍵詞 辣椒疫霉; 交配型; 烯酰嗎啉; 敏感性

中圖分類號(hào)： S436.418.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021295

Abstract In order to clarify the mating type distribution of Phytophthora capsici and its sensitivity to dimethomorph in Chongqing， the mating types and sensitivity of P.capsici isolated in 2019-2020 were determined. The results showed that there were two mating types （A1 and A2） in Chongqing， and they existed in most areas at the same time. Among 102 isolates， 24 were A1 mating type and 78 were A2 mating type. The frequencies of two mating types were 23.53% and 76.47%， respectively. Their sensitivity to dimethomorph was tested， and the results showed that their EC50 values ranged from 0.107 5 to 0.438 3 μg/mL， with an overall mean of （0.296 2±0.005 3） μg/mL. The EC50 value of the most insensitive strain was 4.1 times of that the most sensitive strain.The distribution curve of sensitivity frequencies of P.capsici to dimethomorph was unimodal， and there was no resistant subpopulation among these isolates.

Key words Phytophthora capsici; mating type; dimethomorph; sensitivity

由辣椒疫霉Phytophthora capsici侵染引起的疫病是辣椒生產(chǎn)上的一種毀滅性土傳病害，在世界各地辣椒種植區(qū)均有發(fā)生[1]。P.capsici屬于異宗配合的卵菌，兩種不同的交配型菌株相互誘導(dǎo)才能發(fā)生有性生殖，產(chǎn)生的卵孢子具有更強(qiáng)的致病性、抗逆能力以及更廣泛的寄主植物[2]。有性生殖也是疫霉等植物病原菌遺傳變異的重要來源，因此，研究辣椒疫霉的交配型及分布，對(duì)辣椒疫霉的起源與演化、疫病發(fā)生規(guī)律及抗性育種材料的篩選等有重要意義。

在生產(chǎn)上，辣椒疫病的防治主要以培育抗病品種和化學(xué)藥劑為主[3]。烯酰嗎啉（dimethomorph）是一種羧酸酰胺類的內(nèi)吸性殺菌劑，對(duì)霜霉屬Peronospora和疫霉屬Phytophthora卵菌病害具保護(hù)和治療作用，與苯基酰胺類殺菌劑無交互抗性[45]。當(dāng)前，羧酸酰胺類殺菌劑已經(jīng)在多種卵菌病害如辣椒疫病、番茄晚疫病、瓜類霜霉病等病害的防治中廣泛應(yīng)用[6]。隨著藥劑使用量的不斷加大，辣椒疫霉的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)也逐年升高。近年來，有關(guān)辣椒疫霉對(duì)羧酸酰胺類殺菌劑的抗藥性已有一些研究[67]，但未見重慶地區(qū)的相關(guān)報(bào)道。

對(duì)重慶地區(qū)辣椒疫霉的交配型組成以及烯酰嗎啉的抗藥性水平的研究，旨在了解重慶地區(qū)辣椒疫霉有性生殖在病原菌遺傳多樣性和致病性分化中的作用及抗藥性程度，為辣椒疫霉抗藥性治理及化學(xué)殺菌劑的選擇和綠色防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

2019年-2020年從重慶潼南、巴南、合川、石柱等辣椒主產(chǎn)區(qū)采集具有典型癥狀的病葉和病果樣品，分離、純化獲得辣椒疫霉菌株102株，分離純化用加有抗生素的選擇性燕麥培養(yǎng)基，其配方和配制參照鄭小波[8]的方法。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株A1交配型（P991）和A2交配型（P731）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

10% V8 培養(yǎng)基：將100 mL V8蔬菜汁、0.2 g CaCO3、900 mL去離子水和18 g瓊脂粉置于三角瓶中，充分搖勻后，高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min。

燕麥培養(yǎng)基：取燕麥片30 g放入l 000 mL的燒杯中，加入500 mL去離子水，沸水浴加熱1 h后雙層紗布過濾;稱取18 g瓊脂粉加入適量去離子水，溶化后與濾液充分混合，定容至1 000 mL后趁熱分裝，高壓滅菌鍋中121℃滅菌20 min。

1.1.4 供試藥劑

96.8%烯酰嗎啉原藥，由安徽豐樂農(nóng)化有限責(zé)任公司提供，將原藥溶于二甲基亞砜（DMSO），配制成1×104 μg/mL母液，置于4℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 交配型測(cè)定

交配型測(cè)定采用直接配對(duì)法[9]。供試菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株分別在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用直徑5 mm的打孔器從菌落邊緣打取菌餅，將A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株分別與供試菌株對(duì)峙接種在V8平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿平行排2列，每列放置3塊菌餅，兩列菌餅間距4～5 cm。平板置于25℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)10 d后，將培養(yǎng)皿倒置在顯微鏡載物臺(tái)上，10×10倍視野下檢查菌落交界處及周圍是否產(chǎn)生藏卵器、雄器及卵孢子。每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，測(cè)定試驗(yàn)重復(fù)2次。

待測(cè)菌株交配型的確定按照以下標(biāo)準(zhǔn)[2，8]：僅與A1交配型菌株配對(duì)產(chǎn)生卵孢子的為A2交配型;僅與A2交配型菌株配對(duì)產(chǎn)生卵孢子的為A1交配型;與A1和A2交配型菌株配對(duì)均不產(chǎn)生卵孢子的為A0交配型;單獨(dú)培養(yǎng)或自身配對(duì)即可產(chǎn)生卵孢子的為A1A2交配型;與A1和A2交配型菌株配對(duì)均產(chǎn)生卵孢子，但是單獨(dú)培養(yǎng)或自身配對(duì)都不產(chǎn)生卵孢子的為A1，A2交配型。

1.2.2 辣椒疫霉對(duì)烯酰嗎啉的敏感性測(cè)定

先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，將待測(cè)菌株轉(zhuǎn)接至烯酰嗎啉濃度為0.1、1.0、10.0、100.0 μg/mL的V8培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)6 d，根據(jù)菌落的生長(zhǎng)情況確定烯酰嗎啉的濃度梯度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μg/mL。待測(cè)菌株在V8培養(yǎng)基上25℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，用打孔器（直徑5 mm）在菌落外緣同一圓周上打取菌餅，分別接種到含系列濃度的烯酰嗎啉V8培養(yǎng)基平板上，以只含等量二甲基亞砜的V8培養(yǎng)基平板作為對(duì)照，置25℃黑暗條件下培養(yǎng)6 d。采用十字交叉法測(cè)量處理菌落的直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。求出每個(gè)藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率，生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落的增長(zhǎng)直徑-藥劑處理菌落的增長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑×100%。計(jì)算抑制率的幾率值，求出毒力回歸方程y=a+bx，根據(jù)毒力回歸方程計(jì)算烯酰嗎啉的有效抑制中濃度EC50（μg/mL）和相關(guān)系數(shù)r值。

2 結(jié)果與分析

2.1 交配型測(cè)定

對(duì)分離保存的102株菌株進(jìn)行交配型測(cè)定，結(jié)果顯示（表1）：78株為A2交配型，發(fā)生頻率為76.47%，其余24株為A1交配型，發(fā)生頻率為23.53%，未檢測(cè)到其他交配型?？梢姡苯芬呙乖谥貞c地區(qū)以A2交配型為主。在12個(gè)辣椒產(chǎn)區(qū)中，A1和A2兩種交配型在其中10個(gè)產(chǎn)區(qū)同時(shí)存在，且兩種交配型在不同地區(qū)的發(fā)生頻率也不同。

2.2 辣椒疫霉對(duì)烯酰嗎啉的敏感性測(cè)定

測(cè)定結(jié)果表明（表2）：采自重慶潼南、巴南、合川及石柱等地區(qū)的102株辣椒疫霉菌株對(duì)烯酰嗎啉的EC50介于0.107 5～0.438 3 μg/mL之間，平均值為（0.296 2±0.005 3）μg/mL，最不敏感菌株的EC50為最敏感菌株的4.1倍。所有菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性分布呈連續(xù)性單峰曲線（圖1），總體來看，接近正態(tài)分布，未出現(xiàn)敏感性顯著下降的病原菌亞群體。

對(duì)菌株敏感性分析表明，不同地區(qū)和同一地區(qū)的不同菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性有一定的差異。其中，巴南區(qū)12個(gè)菌株的EC50平均值最低，為0.259 3 μg/mL，分布范圍為0.107 5～0.338 1 μg/mL;璧山區(qū)12個(gè)菌株的 EC50平均值最高，為0.340 4 μg/mL，分布范圍為 0.276 4～0.430 5 μg/mL。雖然巴南區(qū)菌株的EC50平均值最低，但是其最高 EC50為最低的3.15倍，在所有測(cè)定地區(qū)中最高。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于辣椒疫霉的交配型，2012年-2014年的相關(guān)研究表明[1012]，江西、安徽和青海的交配型均以A2為主，其中，江西省未發(fā)現(xiàn)其他交配型;安徽省A2交配型占90.6%，A1交配型占9.4%;青海省A2交配型占61.9%，A1交配型占33.3%，A0交配型占4.8%。2008年劉永剛等[13]研究認(rèn)為甘肅省辣椒疫霉存在A1、A2和A0三種交配型，以A1和A0占優(yōu)勢(shì);2009年楊明英等[14]報(bào)道了云南省疫霉菌株由A1、A2和A1A2三種類型組成，以A2和A1A2交配型為主。本研究中，重慶地區(qū)存在A1和A2兩種交配型，A2交配型占76.47%，A1交配型占23.53%，未檢測(cè)到其他類型，這一結(jié)果與江西、安徽和青海的分布相似，都以A2交配型為主，但不同地區(qū)之間交配型的發(fā)生頻率又各不相同?？梢钥闯?，辣椒疫霉在我國(guó)有豐富的遺傳多樣性，其交配型呈不均等分布。本研究測(cè)定重慶的12個(gè)辣椒產(chǎn)區(qū)中，兩種交配型共存的產(chǎn)區(qū)有10個(gè)，所有產(chǎn)區(qū)的交配型均以A2為主，這表明重慶地區(qū)辣椒疫霉能夠完成有性生殖過程，產(chǎn)生的卵孢子有助于病原越冬存活，將大大提高疫病的發(fā)生頻率。另外，有性生殖過程可通過基因重組提高病原的遺傳變異幾率，導(dǎo)致致病力和遺傳多樣性分化，增加病害防治的難度。

在我國(guó)，烯酰嗎啉用于霜霉病、疫病等卵菌病害的防治已有20余年，隨著烯酰嗎啉等羧酸酰胺類殺菌劑使用量的不斷增大，病原的抗藥性問題引起了科研人員的極大關(guān)注。2009年崔曉嵐等[6]對(duì)采自河北、內(nèi)蒙古和陜西等地的125株辣椒疫霉菌株進(jìn)行烯酰嗎啉敏感性測(cè)定，結(jié)果表明未出現(xiàn)抗性的病原菌亞群體，其EC50在0.126～0.318 μg/mL之間，最不敏感菌株是最敏感菌株的2.5倍，平均EC50為（0.218±0.036 8）μg/mL;2010年Sun等[15]對(duì)采集自江蘇、遼寧、安徽等地未接觸過羧酸酰胺類殺菌劑的90株辣椒疫霉開展敏感性測(cè)定，結(jié)果顯示EC50范圍為0.122～0.203 μg/mL，最不敏感菌株是最敏感菌株的2倍，EC50平均值為（0.154±0.022）μg/mL。本研究中，重慶地區(qū)辣椒疫霉的平均EC50（0.296 2 μg/mL）、最大EC50（0.438 3 μg/mL）及最不敏感菌株是最敏感菌株的倍數(shù)值（4.1倍），與崔曉嵐和Sun等的研究結(jié)果相一致?？梢姡壳爸貞c地區(qū)的辣椒疫霉對(duì)烯酰嗎啉還沒有產(chǎn)生抗藥性。烯酰嗎啉具有多個(gè)作用位點(diǎn)，由于抗藥性機(jī)理復(fù)雜，盡管國(guó)內(nèi)已使用多年，至今還未見從大田中檢測(cè)到疫霉抗性菌株的報(bào)道，但有一些通過室內(nèi)誘變抗性突變體的研究。崔曉嵐等[6]通過室內(nèi)紫外誘變辣椒疫霉，獲得13個(gè)烯酰嗎啉的抗性突變體，其中1個(gè)突變體菌株的抗性指數(shù)高達(dá)680倍;Sun等[15]獲得了4個(gè)抗性突變體菌株，其中1個(gè)突變體菌株抗性指數(shù)高達(dá)1 200倍;Bagirova等[16]采用化學(xué)誘變和二次紫外線照射誘導(dǎo)致病疫霉游動(dòng)孢子，篩選出了低水平抗藥性菌株突變體;Stein等[17]研究得出抗烯酰嗎啉突變體菌株在生長(zhǎng)速率和致病性方面有下降的趨勢(shì)，認(rèn)為突變體在自然環(huán)境中很難發(fā)展成優(yōu)勢(shì)群體?？梢?，辣椒疫霉對(duì)烯酰嗎啉存在一定的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，至于某些抗性突變體菌株出現(xiàn)的生長(zhǎng)速率和致病性下降情況，還有待進(jìn)一步研究。在大田使用過程中應(yīng)盡可能減少烯酰嗎啉的使用頻率及用量，注意與嘧菌酯、霜霉威等不同作用機(jī)理的藥劑混配或輪換使用[1819]，并繼續(xù)開展抗藥性監(jiān)測(cè)工作。

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（責(zé)任編輯：田 喆）