• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      情志應(yīng)激激活潛伏單純皰疹病毒1型建立“肝郁化火”動(dòng)物模型的研究

      2022-04-03 06:17:01姜珊羅卓梁磊牛杰龔海標(biāo)李娥李怡芳栗原博何蓉蓉
      世界中醫(yī)藥 2022年4期

      姜珊 羅卓 梁磊 牛杰 龔海標(biāo) 李娥 李怡芳 栗原博 何蓉蓉

      摘要目的:建立情志應(yīng)激引起潛伏單純皰疹病毒1型(HSV1)復(fù)發(fā)的“肝郁化火”動(dòng)物模型。方法:小鼠通過鼻滴感染HSV1 4周后,采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRTPCR)和空斑法分別檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)(TG)中HSV1潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體(LAT)的表達(dá)和病毒顆粒,確定單純皰疹病毒1型(HSV1)潛伏模型成功建立。小鼠每天拘束應(yīng)激12 h,持續(xù)應(yīng)激4 d,采用致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法和免疫熒光法檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)中HSV1的gB蛋白的表達(dá),檢測(cè)情志應(yīng)激誘導(dǎo)HSV1激活情況。HSV1潛伏小鼠于拘束應(yīng)激前3 d給予“清肝瀉火”經(jīng)典方丹梔逍遙散或清肺熱的經(jīng)典方瀉白散,以方測(cè)證判定模型的中醫(yī)證型。采用眼球摘除法對(duì)小鼠血漿進(jìn)行取樣,液質(zhì)色譜質(zhì)譜法(LCMS)檢測(cè)各激素的含量。用Western Blotting法檢測(cè)TG中脂質(zhì)氧化指標(biāo)4HNE和固有免疫指標(biāo)干擾素β(IFNβ),腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細(xì)胞介素6(IL6)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:小鼠鼻滴感染HSV1 4周后,可在其三叉神經(jīng)節(jié)中建立潛伏,小鼠拘束4 d后可再次激活。與激活組比較,丹梔逍遙散比瀉白散更能有效降低HSV1的激活率,并能減輕復(fù)發(fā)性眼部感染。激活組以及丹梔逍遙散組的血漿中皮質(zhì)酮水平都明顯增加,2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,丹梔逍遙散能降低TG中4HNE和IFNβ的表達(dá),并能減少HSV1復(fù)發(fā)引起的TNFα和IL6炎癥介質(zhì)蛋白的表達(dá)。結(jié)論:丹梔逍遙散可增強(qiáng)固有免疫,降低情志應(yīng)激介導(dǎo)的HSV1重激活,并能減輕HSV1激活復(fù)發(fā)而引起的氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)。

      關(guān)鍵詞丹梔逍遙散;情志應(yīng)激;單純皰疹病毒1型;潛伏激活;肝郁化火;脂質(zhì)過氧化;中醫(yī)動(dòng)物模型

      Establishing an Animal Model of Emotional Stress Activated Latent HSV1

      for TCM Theory “Liver Qi Stagnation Forming Huo”

      JIANG Shan,LUO Zhuo,LIANG Lei,NIU Jie,GONG Haibiao,LI E,LI Yifang,LI Yuanbo,HE Rongrong

      (1 Jinan University Guangdong Engineering Research Center of Chinese Medicine & Disease Susceptibility,Guangzhou 510632,

      China; 2 Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products,College of Pharmacy,Jinan University,Guangzhou

      510632,China; 3 School of Traditional Chinese Medicine,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

      AbstractObjective:To establish an animal model of emotional stress activated latent HSV1,which is suitable for studying the TCM theory of “Liver qi stagnation forming Huo”.Methods:The expression of HSV1 latent associated transcripts(LAT) and virus particles in trigeminal ganglion(TG) were detected respectively by RTqPCR and plaque assay,to confirm the successful establishment of HSV1 latent model in mice after 14 days of nasal infection.To detect the HSV1 activation induced by emotional stress,the mice were daily subjected to restraint stress for 12 hours for 4 days.Following restraint stress,the TG of the mice was collected and the expression of gB protein in TG was measured by cytopathic effect(CPE) and immunofluorescence method.The mice in the latent phase of HSV1 were treated with Danzhi Xiaoyao Powder which was a classic recipe for clearing liver heat or Xiebai Powder that had the effects of clearing lung heat three days before the restraint stress.And the TCM syndromes type of the model was determined by the method of “Syndrome Differentiation through Formula Effect Assessment”.At the same time,the plasma of the mice was sampled by enucleation method,and the content of hormones was detected by LCMS.The expression of lipid oxidation indicator 4HNE and innate immune index IFNβ,TNFα and IL6 proteins in TG were measured by Western Blotting method.Results:HSV1 latent infection could be established in the TG of mice after 4 weeks nasal infection and it could be reactivated after being restrained for 4 days.Compared with the activated group,the Danzhi Xiaoyao Powder could significantly reduce the activation rate of HSV1 and recurrent eye infections than Xiebai Powder.The plasma corticosterone(CORT) level in the reactivated group and the Danzhi Xiaoyao Powder group were increased significantly.However,no significant difference between the two groups was observed.Moreover,the expression of 4HNE and IFNβ in TG was significantly reduced by Danzhi Xiaoyao Powder.Danzhi Xiaoyao Powder can also reduce TNFα and IL6 inflammatory proteins in TG induced recrudescent HSV1.Conclusion:Danzhi Xiaoyao Powder can enhance innate immunity and reduce stressmediated HSV1 reactivation,and it can alleviate the oxidative stress and inflammation response caused by HSV1 reactivation.

      KeywordsDanzhi Xiaoyao powder; Emotional stress; HSV1; Latent activation; Liver qi stagnation forming Huo; Lipid peroxidation; Animal model of traditional Chinese medicine

      中圖分類號(hào):R275文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.005

      在中醫(yī)理論中,“火”(包括溫、熱)為陽盛之氣所化生,多屬內(nèi)熱,由情志應(yīng)激、起居不節(jié)、嗜食辛辣、熬夜等因素會(huì)造成“上火”。情志內(nèi)傷,抑郁不暢,影響機(jī)體陰陽及臟腑的生理平衡,造成氣機(jī)郁結(jié),氣郁日久則從陽化熱,火熱內(nèi)生,即“五志過極化火”,最常見的是“肝郁化火”[1]。“肝郁化火”是情志致病的核心內(nèi)容,是一種病機(jī),也是一種證候,是指情志不遂,引起肝氣郁結(jié),郁久而轉(zhuǎn)化成“上火”的狀態(tài)。然而,至今為止沒有適合研究“肝郁化火”的動(dòng)物模型,也限制了“清肝瀉火”中藥藥效的表征和機(jī)制研究。肝郁化火廣泛存在于各種相關(guān)疾病的病理過程中,是情志致病病機(jī)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié),由單純皰疹病毒1型(Herpes Simplex Virus Type 1,HSV1)復(fù)發(fā)感染引發(fā)的口唇皰疹(中醫(yī)稱“熱瘡”)是“肝郁化火”最為常見的癥狀之一[2]。

      HSV1是一種至少能夠編碼80種蛋白的雙鏈DNA病毒,并將人類作為其唯一的天然宿主[3]。HSV1在人群中普遍存在,據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì),HSV1的全球感染率接近90%。HSV1經(jīng)皮膚黏膜感染后,在鼻、口腔和眼睛等處引起皰疹性的病變[4]。尤為重要的是,在引起原發(fā)感染后,少量的病毒能進(jìn)入神經(jīng)末梢并沿軸突逆行至神經(jīng)元胞體,并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)建立終身的潛伏感染[5]。當(dāng)機(jī)體處于情志抑郁不暢,易形成肝氣郁結(jié),郁久而化火,導(dǎo)致肝臟陽熱亢盛,氣火上沖,圍繞肝經(jīng)巡行的顏面部位形成“火熱”癥狀。如眼部紅腫、口唇皮膚黏膜交界處反復(fù)出現(xiàn)成群小皰并伴有刺痛、發(fā)紅、腫脹、發(fā)癢或灼熱感,充滿液體的水泡形成后可迅速破潰,遺留潰瘍并結(jié)痂,這些癥狀與潛伏的HSV1病毒復(fù)發(fā)癥狀高度相似,嚴(yán)重者可進(jìn)一步引發(fā)角膜炎、腦炎等其他嚴(yán)重疾病。于是,我們從情志應(yīng)激導(dǎo)致HSV1復(fù)發(fā)感染的角度來建立“肝郁化火”的研究模型。在本研究中采用了拘束應(yīng)激模型來模擬情志應(yīng)激,該應(yīng)激模型被認(rèn)為是可以更好理解中醫(yī)“肝”的功能,并被建議用于肝郁研究,因其可能有利于模擬或說明情志致病的部分過程。丹梔逍遙散由牡丹皮、梔子、柴胡和茯苓等9味藥材組成,具有抗炎解熱、疏肝解郁的功效,是治療肝郁化火證的經(jīng)典名方[6]。因此,我們基于“以方測(cè)證”在證候模型中應(yīng)用的依據(jù),采用丹梔逍遙散針對(duì)這一模型進(jìn)行了干預(yù)研究,結(jié)果顯示給予丹梔逍遙散的小鼠病毒激活復(fù)發(fā)率明顯下降,復(fù)發(fā)性眼部炎癥得到緩解。進(jìn)一步研究表明,丹梔逍遙散并不影響情志應(yīng)激誘導(dǎo)的皮質(zhì)酮水平,但能顯著增加干擾素β(IFNβ)的水平和抑制HSV1激活復(fù)發(fā)引起的脂質(zhì)氧化和炎癥反應(yīng)。

      1材料與方法

      1.1材料

      1.1.1動(dòng)物4周齡雄性BALB/c小鼠,購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(粵)20180002。倫理審批號(hào):[2019]倫審批科026號(hào)。飼養(yǎng)溫度為25 ℃,相對(duì)濕度為55%,12 h明暗交替環(huán)境,標(biāo)準(zhǔn)飼料和水喂養(yǎng)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究涉及的動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物樣本采集在生物安全Ⅱ級(jí)(BSL2)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,動(dòng)物飼養(yǎng)于P2實(shí)驗(yàn)室。

      1.1.2病毒和細(xì)胞本研究用的HSV1毒株(F株)的擴(kuò)增在Vero細(xì)胞上進(jìn)行。Vero細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。Vero細(xì)胞和HSV1毒株(F株)由暨南大學(xué)王一飛課題組饋贈(zèng)。

      1.1.3藥物丹梔逍遙散組成為牡丹皮9 g、梔子9 g、柴胡9 g、茯苓12 g、白術(shù)9 g、當(dāng)歸9 g、白芍12 g、炙甘草6 g、薄荷6 g、生姜3片。瀉白散組成為地骨皮30 g、桑白皮30 g、炙甘草3 g。上述藥物均購于正規(guī)藥店,按所列劑量精確稱取。分別按500 mL常規(guī)煎制并按人體用量的9倍濃縮定容,使其分別形成相當(dāng)于生藥含量1.215 g/mL和0.945 g/mL的藥液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ER用前置于20 ℃環(huán)境下預(yù)熱。

      1.1.4試劑與儀器超聲粉碎機(jī)(北京潤(rùn)澤康生物科技有限公司,型號(hào):KBS1200);3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司,德國,型號(hào):CR1260);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司,美國,型號(hào):120300);qPCR儀(BioRad公司,美國,型號(hào):1708882AP);高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技有限公司,美國,型號(hào):4.80112.2500);熒光顯微鏡(尼康公司,日本,型號(hào):ECLIPSE Tis);蛋白膠成像系統(tǒng)(廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司,型號(hào):14T12NPFL161239);胎牛血清(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C0234);DMEM(上海生工生物工程股份有限公司,貨號(hào):E6000080500);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):RP110550T);甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,貨號(hào):F112034);乙腈(上海麥克林生化科技股份有限公司,貨號(hào):A800362);gB抗體(Santa Cruz公司,美國,貨號(hào):SC69798);GAPDH抗體(杭州費(fèi)德生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):FD0068);4HNE抗體(Abcam公司,英國,貨號(hào):ab46545);IFNβ抗體(Abcam公司,英國,貨號(hào):ab85803);TNFα抗體(廣州佰匯生物科技有限公司,貨號(hào):200946);IL6抗體(北京義翹神州科技股份有限公司,貨號(hào):90197RP01200);山羊抗小鼠IgG(H+L)HPR(杭州弗德生物科技有限公司,貨號(hào):FDM007);山羊羊抗兔IgG(H+L)HPR(杭州弗德生物科技有限公司,貨號(hào):FDR007)。

      1.2方法

      1.2.1分組與模型制備分別將BALB/c小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組和病毒感染組。用異氟烷輕度麻醉后,用滴鼻的方式給正常對(duì)照組小鼠滴入純DMED(20 μL/只),給病毒感染組小鼠滴入相同劑量的HSV1病毒(1×106 PFU)。感染操作結(jié)束后,將小鼠放回動(dòng)物飼養(yǎng)房,待小鼠自然蘇醒。4周后將存活下來的小鼠隨機(jī)分為潛伏組、激活組、丹梔逍遙散組和瀉白散組。

      1.2.2給藥方法給予激活組、丹梔逍遙散組和瀉白散組拘束應(yīng)激處理,即將小鼠置于50 mL通風(fēng)拘束管中,每天拘束12 h,連續(xù)拘束4 d。在此期間,所有小鼠禁水禁食。丹梔逍遙散組和瀉白散組于拘束前3 d開始分別灌胃給予上述制備的丹梔逍遙散(12.15 g/kg)和瀉白散(9.45 g/kg),每次灌胃給藥0.2 mL,1次/d,連續(xù)給藥1周。潛伏組和激活組給予等體積的生理鹽水。拘束完成后,立即對(duì)每組小鼠進(jìn)行取血取材,用眼球摘除取血法取血,取材部位為三叉神經(jīng)節(jié)。該研究通過動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

      1.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

      1.2.3.1定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRTPCR)法檢測(cè)小鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG)中病毒基因潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(LAT)的表達(dá)用隨機(jī)數(shù)字表法取正常對(duì)照組和潛伏組各3只小鼠的TG組織進(jìn)行裂解,依照試劑盒方法提取樣本總RNA,定量并檢測(cè)樣品RNA純度,將提取的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,擴(kuò)增目的基因。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL,反應(yīng)條件為37 ℃共15 min,85 ℃共5 s,4 ℃;PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃共3 min,95 ℃共30 s,60 ℃共30 s,40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列:18S上游:TGACGTGGACATCCGCAAAG,下游:CTGGAAGG TGGACAGCGAGG擴(kuò)增片段242 bp;LAT上游:CGGCGACATCCTCCCCCTAAGC,下游:GACAGA CGAACGAAACGTTCCG,擴(kuò)增片段149 bp。

      1.2.3.2空斑法檢測(cè)小鼠TG中病毒的表達(dá)量將取出的三叉神經(jīng)節(jié)用含2%雙抗的冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍,往三叉神經(jīng)節(jié)中加入含10% FBS,1%谷氨酰胺,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,超聲粉碎。將收集到的三叉神經(jīng)節(jié)懸浮液經(jīng)過3次反復(fù)凍融后,接種到Vero單層細(xì)胞上,放置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中吸附3 h,棄去上清,用PBS洗3遍,加入含5% FBS,1%谷氨酰胺,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱中孵育4 d后,收集上清,重新接種到鋪有Vero單層細(xì)胞的六孔板中,吸附3 h加入細(xì)胞覆蓋液(0.5% FBS+0.5%羧甲基纖維素)1 mL繼續(xù)培養(yǎng)7 d后,加入500 μL的4%甲醛溶液固定30 min后,吸棄甲醛固定液,加入1%結(jié)晶紫使用液500 μL,染色30 min。自來水沖洗,空斑呈現(xiàn),計(jì)數(shù)。

      1.2.3.3致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect,CPE)法和免疫熒光法觀察小鼠TG中g(shù)B蛋白的表達(dá)將取出的TG與Vero細(xì)胞共孵育(方法見上一段)后,連續(xù)7 d觀察是否有CPE效應(yīng),并統(tǒng)計(jì)。棄去一半體積培養(yǎng)液,加入500 μL 4%多聚甲醛放置10 min,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)固定,然后棄去預(yù)固定液體,加入1 mL 4%多聚甲醛放置15 min固定細(xì)胞,PBS洗3次,5 min/次。用0.1%的Triton X100透膜15~20 min,PBS洗3次,5 min/次。用5% BSA封閉1 h,PBS洗3次,5 min/次。加入100 μL TOM20(1∶200)一抗孵育液,4 ℃孵育過夜,第2天回收一抗孵育液,PBS洗3次,5 min/次,接著加入100 μL二抗孵育液(1∶300),避光室溫孵育1 h,棄去二抗孵育液,PBS洗細(xì)胞3次,5 min/次;加入100 μL抗熒光淬滅劑,在熒光顯微鏡下初步觀察熒光情況,接著使用熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察拍照,導(dǎo)出并處理數(shù)據(jù)。

      1.2.3.4LCMS法檢測(cè)血漿中各激素的含量拘束應(yīng)激后,進(jìn)行小鼠眼球摘除取血,取血2.0 mL,在4 ℃,以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速,13.5 cm的離心半徑,離心10 min,取50 μL血漿,加3 μL可的松(1 μg/mL)作為內(nèi)標(biāo),加600 μL甲基叔丁基醚,渦旋2.5 min,取上層,氮?dú)獯蹈桑?0 μL甲醇復(fù)溶,4 ℃ 12 000 r/min,離心半徑8.79 cm離心15 min,取上清,進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用儀,進(jìn)行測(cè)樣。液相色譜儀配備DAD檢測(cè)器。色譜柱:Waters Acquity UPLC HSST3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm),配備Van Guard預(yù)柱(1.8 μm,2.1 mm×5 mm);流動(dòng)相:0.1%甲酸水溶液(A)乙腈(B);梯度洗脫程序如下:0~3 min,27%B;9 min,43%B;14 min,53%B;14.5 min,95%B;18.5 min,95%B;19~23 min,27%B,流速:0.25 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:2 μL。質(zhì)譜儀配備加熱電噴霧離子源(Heated Electrospray Ionization,HESI)。質(zhì)譜掃描模式為正離子掃描,一級(jí)掃描分辨率為70 000,掃描質(zhì)量范圍為150~1 000 m/z,最大注射時(shí)間為100 ms,二級(jí)掃描分辨率為17 500,最大注射時(shí)間為50 ms,分離窗口為2 m/z,碰撞能設(shè)置為30、40、50 eV。鞘氣設(shè)置為35 arb,輔助氣為10 arb,反吹氣為1 arb。噴霧電壓為3.5 kV。毛細(xì)管柱溫為320 ℃,輔助氣溫度為350 ℃。

      1.2.3.5Western Blotting檢測(cè)TG中4羥基壬烯醛婦(4HNE)、干擾素β(IFNβ)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細(xì)胞介素6(IL6)蛋白的表達(dá)利用總蛋白提取試劑盒提取各組小鼠TG中的蛋白,根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性、上樣、進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,濕法轉(zhuǎn)膜60 min。4HNE(1∶1 000)、IFNβ(1∶1 000)、TNFα(1∶1 000)、IL6(1∶1 000)及GAPDH(1∶3 000)一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜;二抗稀釋液室溫孵育2 h。采用ECL發(fā)光后膠片暗室曝光顯影。用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度比值表示。

      1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2結(jié)果

      2.1情志應(yīng)激引起潛伏HSV1激活動(dòng)物模型的建立給小鼠鼻滴接種感染HSV1,4周后建立潛伏感染,然后連續(xù)拘束4 d,每天拘束12 h,誘導(dǎo)HSV1激活。見圖1A。在未感染組的TG中沒有檢測(cè)到LAT的mRNA,在潛伏組的TG中檢測(cè)到LAT的mRNA。見圖2A。同時(shí),用空斑法檢測(cè)未感染組和潛伏組的TG中是否存在病毒顆粒。結(jié)果如圖2B所示,發(fā)現(xiàn)在六孔板中未形成空斑,未感染組和潛伏組的TG中沒有病毒顆粒。在鏡下觀察激活組的Vero細(xì)胞腫脹、變圓甚至飄起,正常組和潛伏組的Vero細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞膜界限清晰,胞質(zhì)透明度好,細(xì)胞形態(tài)完整,為正常狀態(tài)。在熒光顯微鏡下觀察到,激活組gB蛋白呈現(xiàn)綠色熒光,可清晰地檢測(cè)到gB蛋白陽性信號(hào)。但是,在正常組和潛伏組中,未能檢測(cè)到gB蛋白陽性信號(hào)。見圖3。

      2.2以方測(cè)證研究“清肝瀉火”方對(duì)情志應(yīng)激引起潛伏HSV1激活動(dòng)物模型的干預(yù)作用丹梔逍遙散組大部分未形成空斑,激活組和瀉白散組有空斑形成。見圖4A。對(duì)每組小鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì),激活組的病毒激活率為70%,瀉白散組的病毒激活率為60%,表明清“肺熱”方劑瀉白散對(duì)該模型沒有明顯的干預(yù)作用;而丹梔逍遙散組的病毒激活率為30%,表明清“肝火”方劑丹梔逍遙散能有效抑制情志應(yīng)激引起的潛伏HSV1激活。見圖4B。在給與小鼠拘束應(yīng)激后,與激活組比較,丹梔逍遙散組的小鼠眼部感染癥狀明顯減輕。見圖5A。對(duì)每組小鼠的眼部炎癥評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,激活組的小鼠角膜炎復(fù)發(fā)率為40%,丹梔逍遙散組的小鼠角膜炎復(fù)發(fā)率為10%。見圖5B。

      2.3丹梔逍遙散對(duì)情志應(yīng)激復(fù)發(fā)小鼠應(yīng)激激素水平的影響23個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)線內(nèi),檢測(cè)到醛固酮、睪酮、孕烯醇酮、皮質(zhì)酮、脫氧皮質(zhì)酮和脫氧皮質(zhì)醇這6種激素。見圖6A。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示皮質(zhì)酮水平明顯升高,其他5種激素?zé)o明顯變化。見圖6B。丹梔逍遙散組和激活組的皮質(zhì)酮水平都顯著升高,但2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6C。

      2.4丹梔逍遙散對(duì)“肝郁化火”模型小鼠氧化應(yīng)激、固有免疫和炎癥介質(zhì)的影響如圖7A所示,與激活組比較,丹梔逍遙散組的4HNE表達(dá)明顯降低,即丹梔逍遙散能顯著降低4HNE的表達(dá)。如圖7B所示,與激活組比較,丹梔逍遙散組的IFNβ蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),即丹梔逍遙散能顯著增強(qiáng)IFNβ的表達(dá)。如圖7C所示,與激活組比較,丹梔逍遙散組的TNFα蛋白和IL6蛋白表達(dá)明顯下降,即丹梔逍遙散能顯著減弱TNFα和IL6的表達(dá)。

      3討論

      情志內(nèi)傷,抑郁不暢,影響了機(jī)體陰陽及臟腑的生理平衡,造成氣機(jī)郁結(jié),氣郁日久則火熱內(nèi)生,引起肝郁化火。肝郁化火證主要以火熱之邪上攻頭目所表現(xiàn)出來的面紅目赤,口舌生瘡、面部皰疹等臨床表現(xiàn)為主。這癥狀可能與HSV1的感染有關(guān)[78]。情志應(yīng)激是肝郁化火證的主要發(fā)病原因之一[9],同時(shí)也是使HSV1激活復(fù)發(fā)的重要因素之一[1012]。丹梔逍遙散是治療“肝郁化火”證的經(jīng)典名方[6]。因此,建立情志應(yīng)激誘導(dǎo)潛伏HSV1激活的肝郁化火型動(dòng)物模型,可用于研究情志應(yīng)激引起病毒易感的機(jī)制,并用于評(píng)價(jià)丹梔逍遙散這類清熱中藥的藥效。

      當(dāng)HSV1處于潛伏期時(shí),LATs是HSV1病毒在潛伏期間唯一大量存在和被轉(zhuǎn)錄的RNAs[13]。因此,本研究采用定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量,進(jìn)行定量分析,監(jiān)測(cè)細(xì)胞LAT mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果在未感染組的TG中沒檢測(cè)到LAT mRNA的表達(dá),在潛伏組的TG中檢測(cè)到LAT mRNA的表達(dá)。空斑形成實(shí)驗(yàn)是病理學(xué)研究中一種檢測(cè)受試樣品對(duì)病毒感染程度影響的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法[14]。我們將未感染組和潛伏組的TG均漿,接種到鋪有一層致密Vero細(xì)胞的六孔板中,用空斑法檢測(cè)病毒顆粒,結(jié)果在未感染組和潛伏組都未發(fā)現(xiàn)空斑,以上結(jié)果說明HSV1潛伏模型建立成功。HSV1編碼的蛋白質(zhì)分子已經(jīng)明確的就多于80個(gè),但是如此眾多的編碼基因并不是同時(shí)開始工作的,它們遵循一個(gè)線性的時(shí)間程序,即即刻早期、早期和晚期。而晚期基因編碼的蛋白中有11種包膜糖蛋白,gB就是其中之一。因此,本研究采用細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect,CPE)法[15]和免疫熒光法檢測(cè)gB蛋白,驗(yàn)證潛伏HSV1是否激活。為了考察丹梔逍遙散對(duì)情志應(yīng)激引起潛伏HSV1激活動(dòng)物模型的干預(yù)作用,我們采用空斑法檢測(cè)激活后小鼠TG中的病毒顆粒。結(jié)果在丹梔逍遙散組中大部分未發(fā)現(xiàn)空斑,發(fā)現(xiàn)激活組的激活率為70%,丹梔逍遙散組的激活率為30%。以上結(jié)果說明,丹梔逍遙散明顯降低了HSV1的激活復(fù)發(fā)率。有趣的是,通過觀察我們發(fā)現(xiàn)丹梔逍遙散能減輕HSV1復(fù)發(fā)性眼部感染。有研究表明,情志的應(yīng)激狀態(tài)會(huì)顯著影響機(jī)體的激素水平,導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)的生理功能紊亂,引起HSV1的再激活[1617]。因此,為了探究丹梔逍遙散是否是通過改變機(jī)體的激素水平,而導(dǎo)致HSV1的潛伏激活率降低,我們用LCMS法檢測(cè)小鼠血漿中各激素的水平變化。發(fā)現(xiàn)激活組和丹梔逍遙散組的皮質(zhì)酮水平明顯上升,但是這2組之間無顯著性差異。以上結(jié)果說明,丹梔逍遙散并不影響拘束應(yīng)激后皮質(zhì)酮的水平,這表明其保護(hù)作用與皮質(zhì)酮的分泌水平無關(guān)。有研究表明,由HSV1感染的不同細(xì)胞和動(dòng)物模型都會(huì)發(fā)生氧化損傷[18]。氧化損傷是指當(dāng)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產(chǎn)生速度高于清除速度,濃度超過生理限度時(shí),就會(huì)損傷生物大分子,如ROS氧化生物膜,破壞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。4羥基壬烯醛(4HNE)是ROS破壞生物膜結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物之一。為了驗(yàn)證丹梔逍遙散是否能減輕HSV1激活復(fù)發(fā)引起的氧化損傷,我們用Western Blotting法觀察TG中4HNE的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與激活組比較,丹梔逍遙散組的4HNE表達(dá)明顯降低,即丹梔逍遙散能顯著降低4HNE的表達(dá)。有研究表明,肝郁化火的情志應(yīng)激狀態(tài)可抑制機(jī)體對(duì)HSV1的固有免疫應(yīng)答,使固有免疫系統(tǒng)抗病毒作用的代表性細(xì)胞因子干擾素β(IFNβ)表達(dá)下調(diào)[19]。為了驗(yàn)證丹梔逍遙散是否能增強(qiáng)HSV1的固有免疫應(yīng)答,我們用Western Blotting法觀察TG中IFNβ蛋白的變化情況,結(jié)果表明與激活組比較,丹梔逍遙散組的IFNβ蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),即丹梔逍遙散能顯著增強(qiáng)IFNβ的表達(dá)。有研究表明肝氣郁結(jié)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能減弱,抵抗力下降,炎癥反應(yīng)增強(qiáng),宿主通過機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),如腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細(xì)胞介素6(IL6)[20]。為了驗(yàn)證丹梔逍遙散是否能減弱HSV1激活復(fù)發(fā)引起的炎癥反應(yīng),我們用Western Blotting法觀察TG中TNFα蛋白和IL6蛋白的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與激活組比較,丹梔逍遙散組的TNFα蛋白和IL6蛋白表達(dá)明顯下降,即丹梔逍遙散能顯著減弱TNFα和IL6的表達(dá)。以上結(jié)果說明,丹梔逍遙散可增強(qiáng)固有免疫,并能減輕HSV1激活復(fù)發(fā)而引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

      本研究成功建立了情志應(yīng)激引起潛伏HSV1激活復(fù)發(fā)的“肝郁化火”動(dòng)物模型,并以“以方測(cè)證”為依據(jù),采用丹梔逍遙散針對(duì)這一模型進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)丹梔逍遙散對(duì)這一模型有干預(yù)作用,可降低HSV1的激活復(fù)發(fā)率,緩解復(fù)發(fā)性眼部炎癥,但其并不影響情志應(yīng)激誘導(dǎo)的皮質(zhì)酮水平,與皮質(zhì)酮的分泌水平無關(guān),可能是通過減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),增強(qiáng)固有免疫來干預(yù)潛伏HSV1的激活復(fù)發(fā),但其具體的作用機(jī)制還有待更深入的探討。目前,臨床上主要用阿昔洛韋和噴昔洛韋等核苷類似物來治療HSV1,但在治療過程會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)和耐藥性,最重要的是,這些藥物無法對(duì)抗HSV1的激活復(fù)發(fā)感染[21],目前世界上尚無有效的藥物來阻止?jié)摲麳SV1的重激活[22]。本研究對(duì)潛伏HSV1激活復(fù)發(fā)感染導(dǎo)致的相關(guān)疾病的中醫(yī)藥防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      參考文獻(xiàn)

      [1]朱思睿,羅祥,李怡芳,等.情志“上火”增加“疾病易感性”的研究[J].中國中藥雜志,2018,43(8):15291535.

      [2]汪琴靜,包潔,李思敏,等.“上火”與病毒的相關(guān)性探討[J].中國中醫(yī)急癥,2015,24(3):453456.

      [3]Bradley H,Markowitz LE,Gibson T,et al.Seroprevalence of herpes simplex virus types 1 and 2United States,19992010[J].J Infect Dis,2014,209(3):325333.

      [4]Piret J,Boivin G.Resistance of herpes simplex viruses to nucleoside analogues:mechanisms,prevalence,and management[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(2):459472.

      [5]Whitley RJ.Herpes Simplex Virus Infections of the Central Nervous System[J].Continuum(Minneap Minn),2015,21(6 Neuroinfectious Disease):17041713.

      [6]陳蓉蓉.丹梔逍遙散加減聯(lián)合情志干預(yù)療法治療肝郁化火型不寐的臨床觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管?。ㄟB續(xù)型電子期刊),2019,7(28):153154.

      [7]孫志毅,宋繼科,畢宏生.抑火清肝退翳湯加減治療肝經(jīng)風(fēng)熱型單純皰疹性角膜炎的臨床療效及作用機(jī)制[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2020,26(11):124129.

      [8]Yan C,Luo Z,Li W,et al.Disturbed YinYang balance:stress increases the susceptibility to primary and recurrent infections of herpes simplex virus type 1[J].Acta Pharm Sin B,2020,10(3):383398.

      [9]Pan MH,Zhu SR,Duan WJ,et al.“Shanghuo” increases disease susceptibility:Modern significance of an old TCM theory[J].J Ethnopharmacol,2020,250:112491.

      [10]Becker HC.Influence of stress associated with chronic alcohol exposure on drinking[J].Neuropharmacology,2017,122:115126.

      [11]Li W,Luo Z,Yan CY,et al.Autophagic degradation of PML promotes susceptibility to HSV1 by stressinduced corticosterone[J].Theranostics,2020,10(20):90329049.

      [12]Yu W,Geng S,Suo Y,et al.Critical Role of Regulatory T Cells in the Latency and StressInduced Reactivation of HSV1[J].Cell Rep,2018,25(9):23792389.e3.

      [13]Nicoll MP,Proena JT,Efstathiou S.The molecular basis of herpes simplex virus latency[J].FEMS Microbiol Rev,2012,36(3):684705.

      [14]孟繼鴻.細(xì)胞單層速成法病毒空斑試驗(yàn)在單純皰疹病毒分型中的應(yīng)用[J].南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1986,8(2):7.

      [15]王巧利,于立堅(jiān),王一飛,等.土貝母苷甲對(duì)單純皰疹病毒1型和2型的增殖和基因組復(fù)制的抑制效應(yīng)[J].病毒學(xué)報(bào),2019,35(4):569577.

      [16]Ives AM,Bertke AS.Stress Hormones Epinephrine and Corticosterone Selectively Modulate Herpes Simplex Virus 1(HSV1) and HSV2 Productive Infections in Adult Sympathetic,but Not Sensory,Neurons[J].J Virol,2017,91(13):e0058217.

      [17]羅卓,顏暢,李怡芳,等.Ⅰ型單純皰疹病毒潛伏感染及其應(yīng)激復(fù)發(fā)[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2017,33(9):11851190.

      [18]De Chiara G,Marcocci ME,Sgarbanti R,et al.Infectious agents and neurodegeneration[J].Mol Neurobiol,2012,46(3):614638.

      [19]Ashcraft KA,Bonneau RH.Psychological stress exacerbates primary vaginal herpes simplex virus type 1(HSV1) infection by impairing both innate and adaptive immune responses[J].Brain Behav Immun,2008,22(8):12311240.

      [20]雷珊珊,潘小平,徐莉,等.復(fù)發(fā)性唇皰疹實(shí)熱“上火”患者免疫功能變化[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2018,36(12):28262831.

      [21]Viswanathan K,Dhabhar FS.Stressinduced enhancement of leukocyte trafficking into sites of surgery or immune activation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(16):58085813.

      [22]Johnston C,Gottlieb SL,Wald A.Status of vaccine research and development of vaccines for herpes simplex virus[J].Vaccine,2016,34(26):29482952.

      (2021-01-26收稿本文編輯:吳珊)

      基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81873209,U1801284,81622050);珠江創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2017BT01Y036);珠江學(xué)者計(jì)劃項(xiàng)目(GDUPS2019);廣州市科技計(jì)劃基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目(907158833068,201903010062)

      作者簡(jiǎn)介:姜珊(1997.03—),女,碩士研究生在讀,研究方向:中藥藥理學(xué),Email:1005921730@qq.com

      通信作者:何蓉蓉(1983.01—),女,博士研究生,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向:中醫(yī)理論基礎(chǔ)和中藥作用機(jī)制,Email:rongronghe@jnu.edu.cn

      茌平县| 汕尾市| 潮州市| 南投市| 西乌| 建昌县| 元氏县| 扬中市| 包头市| 漳平市| 齐河县| 夏邑县| 达州市| 南康市| 绥棱县| 长葛市| 浦城县| 灵丘县| 收藏| 东兰县| 桃源县| 徐汇区| 安塞县| 阳西县| 永城市| 齐齐哈尔市| 肇源县| 清原| 沙洋县| 汪清县| 遂宁市| 丹阳市| 登封市| 大宁县| 汉寿县| 米易县| 永济市| 鄢陵县| 确山县| 宁海县| 蓝山县|