基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術探討黃芪建中湯治療腹瀉型腸易激綜合征的作用機制研究

葉坤，雷敏，謝欣，鄭暉，陳敏，余曙光*

目前腸易激綜合征（IBS）全球患病率為10%～15%，中國為1.4%～11.5%[1-2]。IBS是一種身心共患病，反復發(fā)作不僅給患者的工作和生活帶來嚴重影響，對患者精神心理也有不同程度的損害[3]。最新的羅馬Ⅳ標準將IBS分為4個亞型，其中腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）最常見，占40%～45%[4-5]。IBS發(fā)病機制復雜，涉及腦腸交互紊亂、遺傳因素、腸道炎癥和菌群紊亂、內臟高敏感性以及腸道動力異常等。因此，國際上對于IBS的治療，主要以瀉藥、止瀉藥、解痙劑以及抗抑郁藥等為主，但效果欠佳，且藥物的長期療效尚不能確定[6]。

IBS-D屬于中醫(yī)學的腹瀉、腹痛范疇，與“大腸泄”“痛泄”等有聯(lián)系[7]，其多是因先天稟賦不足和/或后天失養(yǎng)，加之情志失調、飲食不節(jié)以及感受外邪而導致，病位涉及肝、脾（胃）、腎等臟腑，與心和肺亦有關系[8]。IBS-D主要病機為肝郁、脾虛、腎陽不足，臨床治療以抑肝補脾、滲濕止瀉，必要時佐以溫補腎陽[9]。《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》述黃芪建中湯云：“虛勞里急，諸不足，黃芪建中湯主之。”本方含黃芪、桂枝、白芍、生姜、甘草、大棗、飴糖，其中黃芪甘溫，補氣升陽舉陷；桂枝味辛、甘溫，溫通經(jīng)脈、補心腎脾之陽氣；白芍甘、酸、微寒，平抑肝陽、柔肝止痛；生姜辛溫以溫中散寒；甘草甘平以益氣補脾、緩急止痛；大棗甘溫能補中益氣；飴糖甘溫可補脾益氣、緩急止痛。諸藥合用，共收柔肝止痛、溫中健脾止瀉之功。臨床運用黃芪建中湯治療IBS-D較為普遍且療效肯定，有較多研究表明，與對照組相比，黃芪建中湯對IBS-D的療效優(yōu)勢具有統(tǒng)計學意義[10-12]。但目前關于黃芪建中湯治療IBS-D的確切機制尚不十分明確，相關研究亦不多見。

網(wǎng)絡藥理學這一概念是英國Hopkins教授于2007年提出，在近些年成為中藥藥理基礎與作用機制研究的熱門工具[13-14]?；谏鲜霰尘?，本研究擬借助網(wǎng)絡藥理學和分子對接，預測黃芪建中湯在IBS-D治療中的有效化合物、潛在的作用靶點及信號通路，為進一步探究黃芪建中湯治療IBS-D的作用機制提供研究方向。

為什么開展本研究？

運用中藥及中藥復方治療、預防疾病在我國已經(jīng)有幾千年的歷史。隨著現(xiàn)代科技的進步，醫(yī)學相關的其他學科如生物學、蛋白組學、基因組學等發(fā)展迅速，為中醫(yī)藥治療疾病的微觀機制研究提供了便捷。鑒于黃芪建中湯治療腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）臨床有效，且具體作用機制尚不十分明確，本文運用網(wǎng)絡藥理學對黃芪建中湯治療IBS-D的微觀機制進行預測并進行分子對接驗證，為實驗研究提供思路，也為黃芪建中湯治療IBS-D提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃芪建中湯有效活性成分與作用靶點的搜集與篩選 利用 TCMSP數(shù)據(jù)庫[15]（https://www.tcmsp-e.com/）對黃芪、桂枝、白芍、生姜、甘草、大棗、飴糖進行相關活性成分篩選及靶點預測。藥物活性成分篩選條件為：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%；類藥性（drug-likeness，DL）≥ 0.18[16]。刪除藥物的重復靶點，得到最終靶點集，導入Uniprot數(shù)據(jù)庫[17]（http://www.uniprot.org/），限定物種為人（已驗證），對靶點名稱進行標準化。

1.2 IBS-D 的靶點獲取 使用 GeneCards[18]（https：//www.geneca-rds.org/）、OMIM[19]（https://omim.org/）、TTD[20]（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drug Bank[21]（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB[22]（https://www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫，檢索“diarrhea irritable bowel syndrome”，篩選IBS-D相關靶點基因集。將刪除重復靶點的最終疾病靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫，對靶點名稱進行標準化。

1.3 繪制“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖 對疾病靶點和藥物靶點利用R語言中的Venn程序進行映射取交集，繪制韋恩圖；使用Cytoscape 3.8.1軟件[23]繪制“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，利用內置工具Network Analyzer分析網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)，依據(jù)節(jié)點連接度值（degree）篩選核心活性成分。

1.4 構建黃芪建中湯治療IBS-D靶點的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡 為探究黃芪建中湯藥物相關靶點與IBS-D靶點間的相互作用，將交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫[24]（https://string-db.org/），物種設置為“Homo Sapiens”，構建PPI網(wǎng)絡，隱藏游離靶標，設定PPI分值為0.4，下載TSV格式文件并導入Cytoscape 3.8.1，繪制PPI網(wǎng)絡圖。Network Analyzer用于網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)分析，中心度值（betweenness centrality）、緊密中心度值（closeness centrality）、節(jié)點連接度值（degree）用于篩選核心靶點。

1.5 基因本體論（GO）功能和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析 將黃芪建中湯治療IBS-D的靶基因上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫[25]（http://metascape.org/gp/in dex.html），物種設置為“Homo Sapiens”，選擇“Custom Analysis”，分別進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。GO功能富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。參數(shù)設置為最小重疊＞3，值截止＜0.01，最小富集＞1.5。選擇排名前20位的GO功能和KEGG信號通路上傳到BioLadder生信云平臺（https://www.bioladder.cn/）繪制氣泡圖，對數(shù)據(jù)進行可視化，并采用Cytoscape 3.8.1繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病-信號通路”圖。

1.6 分子對接驗證 核心小分子化合物作為配體，從Pubchem 數(shù)據(jù)庫[26]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索化合物CAS號，下載3D結構，用Chem3D pro[27]使其能量最小化，保存為mol2格式。核心靶點作為受體，從PDB 數(shù)據(jù)庫[28]（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點的三維結構（PDB格式），核心靶點蛋白選擇遵循原則：（1）人源蛋白；（2）分辨率高；（3）優(yōu)先選擇具有原始配體[29]。使用PyMOL 2.4.1軟件對核心靶點蛋白進行去除水分子和原始配體。利用AutoDock軟件[30]將核心靶點加氫并轉換為pdbqt格式，同時設置小分子化合物旋轉鍵后保存為pdbqt格式，然后，運用AutoDock Vina 1.5.6軟件[31]進行對接，結果用PyMOL軟件進行可視化，輸出三維圖，并做熱圖分析。

2 結果

2.1 黃芪建中湯活性成分與作用靶點 以OB≥30%，DL≥0.18為標準檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選得到142種活性成分，其中甘草88個、大棗19個、黃芪17個、白芍8個、桂枝6個、生姜4個，飴糖未在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到活性成分，通過查閱文獻補充葡萄糖、糊精、麥芽糖3個化合物，均未滿足篩選標準，故刪除。其中共有活性成分11個，刪除活性成分中的重復項和不能在Uniprot數(shù)據(jù)庫找到official symbol的活性成分后，最終得到123個活性成分，選取共有活性成分11個進行展示，見表1。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中選取“RelatedTargets”模塊，獲得247個黃芪建中湯活性成分對應的靶點。

表1 黃芪建中湯中共有活性成分的基本信息Table 1 Information of common active ingredients in Huangqi Jianzhong Decoction

2.2 IBS-D相關靶標的收集及黃芪建中湯治療作用靶點的篩選利用 檢索Gene Cards、OMIM、TTD、Drug Bank及PharmGKB數(shù)據(jù)庫，去除重復靶點后獲得3 486個與IBS-D相關靶點，將藥物靶點映射到疾病靶點中，最終獲得黃芪建中湯治療IBS-D的潛在作用靶點180個，見圖1（彩圖掃描文章首頁二維碼）。

圖1 藥物-疾病靶點的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of drug-IBS-D intersected targets

2.3 “藥材-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖”的分析 利用Cytoscape對180個交集靶點進行“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖的繪制，該網(wǎng)絡有306個節(jié)點，其中6個藥材節(jié)點、121個化合物節(jié)點、180個靶點節(jié)點，2 396條邊，見圖2。根據(jù)Network Analyzer計算網(wǎng)絡中的拓撲參數(shù)，篩選中心度值、緊密中心度值、節(jié)點連接度值較大的節(jié)點，這些節(jié)點在整個網(wǎng)絡中起到樞紐的作用，可能是關鍵的化合物或者靶點[32]。每個靶點平均與12.53個化合物相互作用，每個化合物平均與14.94個靶點相互作用，體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點共同作用的整體性和聯(lián)系性的特點[33]。通過篩選得出前8名的活性成分：槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊異黃酮、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇度值，除7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇只為黃芪活性成分外，其余均為共有活性成分，見表2。依據(jù)節(jié)點連接度值（degree）調節(jié)網(wǎng)絡中靶基因的面積大小，由圖2可知PTGS2、HSP90AA1、雌激素受體1（ESR1）、PPARG、AR、NOS2、PTGS1、NCOA2、PRSS1、SCN5A、CDK2等靶基因度值較大。

圖2 “藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖Figure 2 Network of herbals-active ingredients-targets

表2 網(wǎng)絡節(jié)點連接度值前8名的活性成分Table 2 Top 8 active ingredients ranked by network connectivity value

2.4 黃芪建中湯治療IBS-D潛在作用靶點互作網(wǎng)絡構建與分析 基于String數(shù)據(jù)庫獲取黃芪建中湯治療IBS-D靶點間的互作信息，下載TSV文件，導入Cytoscape 3.8.1進行可視化及分析，得到PPI網(wǎng)絡，見圖3A，該網(wǎng)絡包括180個節(jié)點、3 762條邊，通過Network Analyzer分析，得到緊密中心度值平均值為0.543 096 779、節(jié)點連接度值平均值為41.8、中心度值平均值約為0.004 9，以節(jié)點連接度值≥83.6、中心度值≥0.009 92為條件進行篩選，得到核心網(wǎng)絡（圖3B）。依據(jù)PPI網(wǎng)絡圖，度值排名前10位的核心靶標為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素（IL）-6、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、IL-1B、表皮生長因子受體（EGFR）、連環(huán)蛋白β1（CTNNB1）、轉錄因子AP-1（JUN）、ESR1，見表3。

圖3 黃芪建中湯治療IBS-D潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡圖Figure 3 PPI network of potential targets of Huangqi Jianzhong Decoction in treatment of IBS-D

表3 PPI網(wǎng)絡圖度值排名前10位的蛋白質Table 3 Top 10 proteins ranked by PPI network connectivity value

2.5 GO功能和KEGG信號通路富集分析 GO功能富集分析中BP分析獲得2 376個條目，前3條為response to inorganic substance（對無機物質的反應）、response to lipopolysaccharide（對脂多糖的反應）、response to xenobitic stimulus（對異種刺激的反應）；CC分析獲得115個條目，前3條為membrane raft（膜筏）、plasma membrane protein complex（質膜蛋白復合物）、apical part of cell（細胞頂端）；MF分析獲得194個條目，前3條為transcription factor binding（轉錄因子結合）、protein kinase binding（蛋白激酶結合）、protein domain specific binding（蛋白質結構域特異性結合）；選取BP、CC、MF分析中最為顯著的20個過程繪制GO功能分析圖，見圖4。KEGG信號通路富集分析共獲得352條信號通路，選取最為顯著的20個過程繪制KEGG信號通路富集分析圖，見圖5。使用Cytoscape 3.8.1繪制“藥物-活性成分-靶點-疾病-信號通路”圖，見圖6。

圖4 黃芪建中湯治療IBS-D的潛在靶點GO功能富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of potential targets of Huangqi Jianzhong Decoction in treatment of IBS-D

圖5 黃芪建中湯治療IBS-D的潛在靶點KEGG信號通路富集分析Figure 5 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of potential target of Huangqi Jianzhong Decoction in treatment of IBS-D

圖6 “藥物-活性成分-關鍵靶點-疾病-信號通路”圖Figure 6 Network of drug-active ingredients-key target-IBS-D-signaling pathway

2.6 分子對接 利用AutoDock軟件將“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖中度值最高的8個活性成分（槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊異黃酮、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇）與PPI網(wǎng)絡圖中8個核心蛋白（AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、IL-1B、EGFR、CTNNB1）進行分子對接。配體和受體結合能越低，結合越穩(wěn)定，兩者結合能≤-5.0 kcal/mol說明兩者可以結合，≤-7.0 kcal/mol說明有較好的結合能力[34]。結果表明8個核心蛋白和8個活性成分結合能均≤-6.0 kcal/mol，見表4。將對接結果導入PyMOL軟件進行視覺優(yōu)化，輸出三維圖，部分活性成分和蛋白分子對接圖見圖7。

表4 黃芪建中湯治療IBS-D的核心活性成分與核心蛋白結合能（kcal/mol）Table 4 The binding energies of core active ingredients and core proteins of Huangqi Jianzhong Decoction in the treatment of IBS-D

圖7 黃芪建中湯治療IBS-D的部分活性成分和蛋白分子對接圖Figure 7 Part of the active ingredients and protein molecular docking diagram of Huangqi Jianzhong Decoction in the treatment of IBS-D

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術的研究方法，探索黃芪建中湯治療IBS-D的作用機制，據(jù)“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，發(fā)現(xiàn)黃芪建中湯主要活性成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、刺芒柄花素等。槲皮素作為黃酮類化合物的一個亞類，廣泛存在于植物界中，擁有多種藥理活性，例如抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛等[35-36]。5-羥色胺（5-HT）作為一種廣泛存在人體中樞神經(jīng)及胃腸道中的腦腸肽，與內臟疼痛及胃腸道動力異常相關，IBS-D患者血清5-HT水平顯著高于正常者，初始感覺和持續(xù)排便閾值及最大耐受容量明顯低于正常者[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可降低結腸5-HT水平、腸嗜鉻細胞數(shù)量，減輕炎癥誘導型腸易激綜合征（PI-IBS）大鼠的內臟高敏感性及內臟運動反應[39]。IBS-D患者的結腸上皮通透性增加，槲皮素調節(jié)IBS模型大鼠細胞因子TNF-α的含量和緊密連接蛋白claudin-1、occludin的表達，改善腸上皮細胞通透性，增強腸屏障功能[40]。槲皮素還表現(xiàn)出一定的調節(jié)腸道微生物、抗焦慮和抗抑郁的作用[41-42]。山柰酚是一種廣泛存在于蔬菜、中草藥中的黃酮類物質，具有抗菌、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等藥理活性[43]。山柰酚可對Toll樣受體4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）和STAT信號通路起到負調控的作用，顯著降低脂多糖（LPS）誘導的大鼠腸道微血管內皮細胞TNF-α、IL-1B、IL-6的過度分泌，減輕炎癥[44]。槲皮素和山柰酚均可通過調控Ca2+通道，抑制大鼠結腸縱肌的自發(fā)收縮，達到解痙作用[45]。β-谷甾醇具有抗炎、抗抑郁、抗氧化等生物活性[46]。β-谷甾醇可抑制TLR4和NF-κB的過度表達、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的活化，下調細胞中TNF-α、IL-1B、IL-6、IL-8的生成[47-48]。異鼠李素可提高痛閾值，其機制可能與抑制NF-κB通路，繼而減少一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-1及IL-6的表達、合成或釋放有關[49]。在前8位活性成分中，黃芪占6味，其次是甘草占5味，推測黃芪有可能是黃芪建中湯治療IBS-D的核心中藥，與原方君藥地位相符。

通過PPI網(wǎng)絡圖，篩選得出黃芪建中湯治療IBS-D的關鍵靶點有AKT1、TP53、TNF、IL-6、IL-1B等，體現(xiàn)出中藥治療的多靶點特點。AKT1作為AKT的亞型，參與代謝、生殖、細胞存活、生長以及血管生成等在內的多種生物學過程，AKT是治療IBS的主要焦點分子，而AKT1作為AKT的同源基因，推測其應與IBS有密切聯(lián)系[50-51]。TP53作為一種常見的突變基因，與早發(fā)性癌癥的易感性有密切關系，但目前尚無研究表明其與IBS-D的發(fā)生有聯(lián)系[52]。關于IBS的發(fā)病機制，近年發(fā)現(xiàn)低度炎癥和免疫激活在一定程度上參與了該病的發(fā)生、發(fā)展[53-54]。TNF-α、IL-6、IL-1B為促炎因子，有研究顯示采用慢性束縛聯(lián)合番瀉葉灌胃法建造的小鼠模型相較空白對照組血清、結腸TNF-α、IL-6、IL-1B均增高，表明痛瀉藥方可降低結腸組織TNF-α、IL-6、IL-1B表達，抑制炎癥，治療IBS-D[55-56]。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，MAPK、NF-κB、cAMP和雌激素信號通路等為主要治療通路。MAPK信號通路是體內調節(jié)炎性反應及免疫應答的重要通路，分為p38 MAPK、細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2、c-Jun氨基末端激酶（JNK）亞型通路[57]。MAPK信號通路在維持腸道局部黏膜免疫穩(wěn)態(tài)、參與調控腸道局部免疫細胞的功能和調節(jié)內臟高敏性均發(fā)揮重要作用[58]。通過對IBS-D患者中有差異表達的基因進行pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路有顯著差異性變化[59]。研究表明p38 MAPK信號通路在機體疼痛感知、胃腸動力功能紊亂和免疫性炎癥異常激活中均有重要的作用[60]，研究發(fā)現(xiàn)MAPK-ERK信號通路或許是導致IBS-D內臟高敏性的機制之一，痛瀉要方改善IBS-D臨床癥狀可能是通過調控MAPK-ERK信號通路、p38 MAPK，緩解IBS-D的內臟高敏性，減輕結腸的炎性反應[59]。cAMP信號通路與NF-κB信號通路均參與IBS-D的發(fā)生，其中cAMP信號通路被抑制，NF-κB信號通路活化，抑制NF-κB信號通路，激活cAMP信號通路可有效改善IBS-D癥狀[61]。NF-κB信號通路對于IBS-D的腸道炎癥和內臟高敏性有重要作用[62]。IBS患者以女性多見，女性IBS患者外周血中雌二醇含量顯著低于健康對照組，腸黏膜中雌激素受體的表達顯著高于健康對照組[63]。

根據(jù)分子對接結果，核心蛋白與核心活性成分的結合能均≤-6 kcal/mol，表示黃芪建中湯核心化合物與核心受體蛋白穩(wěn)定結合，可起到治療IBS-D的作用，其中AKT1、EGFR與活性成分對接結果較好，提示AKT1、EGFR可能與IBS-D有一定聯(lián)系，但目前關于這2個靶點與IBS-D的關聯(lián)研究極少。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學探討黃芪建中湯治療IBS-D的機制，驗證了中藥復方多途徑、多靶點、協(xié)調治療疾病的過程。黃芪建中湯可能通過活性成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、刺芒柄花素、豆甾醇、毛蕊異黃酮、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇與AKT1、TP53、TNF、IL-6、CASP3、IL-1B、EGFR、CTNNB1等蛋白相結合，進一步調節(jié)MAPK、NF-κB、cAMP、雌激素等信號通路，從而增強腸屏障功能、降低內臟敏感、減少炎性反應、調節(jié)腸道菌群，治療IBS-D。

作者貢獻：葉坤、雷敏構思和設計文章的思路與框架，撰寫論文初稿，繪制圖表，負責論文結果的可視化呈現(xiàn)；雷敏、謝欣進行相關文獻/資料收集、整理和提煉；陳敏進行論文的修訂；鄭暉、余曙光負責論文終稿的審定，文章的質量控制及審校；葉坤、余曙光對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。