定量核磁共振法測定甲磺酸伊馬替尼質(zhì)量分?jǐn)?shù)

蘇 鳳,汪一帆

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate),商品名格列衛(wèi),是一種由諾華公司開發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑[1]。2001年5月,甲磺酸伊馬替尼經(jīng)FDA的批準(zhǔn)在美國上市,2002年在中國正式銷售,作為費城染色體陽性慢性粒細(xì)胞白血病加速器、急慢性和α-干擾素治療失敗后的首選治療藥物[2-7]。甲磺酸伊馬替尼作為一種有機酸鹽,目前常用的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測方法主要有高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)[8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Iiquidchromatograph mass spectrometer,LC-MS)[9]等。由于甲磺酸伊馬替尼的結(jié)構(gòu)特性,應(yīng)用這些方法進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定時均需要被測樣品的對照品,在配制流動相的過程中往往會添加三乙胺或者離子對試劑如辛烷磺酸鈉等,但在質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定實驗中流動相平衡時間過長,且重現(xiàn)性差[10],在離子對試劑的使用過程中,對色譜柱有一定的損害,使色譜柱使用壽命和柱效降低[11]。

近年來,定量核磁共振技術(shù)(Quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)逐漸被用于藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定中,原理是不同環(huán)境下響應(yīng)信號的積分強度與化合物中被激發(fā)質(zhì)子數(shù)成正比[12]。利用qNMR方法,既能夠?qū)衔锝Y(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定歸屬,又可以利用分子結(jié)構(gòu)中特定基團(tuán)的質(zhì)子數(shù)與其相應(yīng)譜峰的峰面積之間的正比關(guān)系進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定,方法簡單快捷,特異性強,不破壞樣品,可使用已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的普通化學(xué)物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo),而不必使用待測物的對照品,適合無對照品的新化合物的定量測定[13-17]。NMR定量常見方法分為相對定量法和絕對定量法,其中絕對定量法適用于無對照品的新藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定[18]。qNMR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)[19]、藥學(xué)[20-21]、生物學(xué)[22]和食品[23]等諸多學(xué)科領(lǐng)域。筆者在前期研究工作的基礎(chǔ)上[24-26],對甲磺酸伊馬替尼的1D,2D NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬,建立了甲磺酸伊馬替尼質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的qNMR方法。到目前為止,尚未見到有關(guān)采用qNMR方法對甲磺酸伊馬替尼進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的報道。

1 實 驗

1.1 原料與試劑

甲磺酸伊馬替尼原料藥,江蘇八巨藥業(yè)有限公司提供(批號:201704008);甲磺酸伊馬替尼對照品,上海源葉生物科技有限公司(批號:G28O6K5134,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%);順丁烯二酸對照品,中國食品藥品檢定研究院(馬來酸,批號:VLD6-3BQZ,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%);氘代二甲基亞砜,美國Sigma公司(DMSO-d6,99.9% D);乙酸銨,天津市永大化學(xué)試劑有限公司(分析純,批號:2014G705,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%);乙腈,美國TEDIA公司(色譜純,批號:20095293,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)。

1.2 儀器與條件

所有NMR實驗均在600 M AVANCE Ⅲ核磁共振儀上進(jìn)行,NMR譜圖處理均在Bruker Topspin 3.5.6軟件上完成,對每幅圖進(jìn)行相位調(diào)整和基線校正。采集條件是zg 90脈沖序列,溫度為298 K,譜寬(SWH)為12 019 Hz,采樣點數(shù)(TD)為30 s,掃描次數(shù)(NS)為32次。甲磺酸伊馬替尼的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用計算公式為

(1)

式中:Ix為樣品定量峰積分面積;Nx為樣品定量峰代表的氫個數(shù);Mx為樣品分子量;Wx為樣品稱樣質(zhì)量;Istd為內(nèi)標(biāo)峰積分面積;Nstd為內(nèi)標(biāo)峰代表的氫個數(shù);Mstd為內(nèi)標(biāo)分子量;Wstd為內(nèi)標(biāo)稱樣質(zhì)量;Pstd為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

所有HPLC實驗均在Agilent 1260上完成。采集條件是Welch Welchrom-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),測定波長254 nm,流動相V(乙腈)∶V(1%醋酸銨水溶液)=60∶40,柱溫30 ℃,流速0.7 mL/min。

1.3 溶液配制

1.3.1 NMR內(nèi)標(biāo)溶液和供試品溶液制備

精密稱取馬來酸對照品11 mg,置于2 mL容量瓶中,加入約2 mL DMSO-d6溶解后定容至刻度線,得內(nèi)標(biāo)溶液。

精密稱取甲磺酸伊馬替尼原料藥25.35 mg,置于2 mL容量瓶中,加入約2 mL DMSO-d6溶解后定容至刻度線,得供試品溶液。

1.3.2 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

精密稱取5.3 mg的甲磺酸伊馬替尼對照品,置于10 mL容量瓶中,加入V(乙腈)∶V(水)=60∶40的溶劑溶解后定容至刻度線,再分別稀釋成0.02,0.05,0.1,0.2,0.4 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲磺酸伊馬替尼的結(jié)構(gòu)歸屬

甲磺酸伊馬替尼的化學(xué)名為4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-苯胺甲磺酸鹽。甲磺酸伊馬替尼的結(jié)構(gòu)式為

甲磺酸伊馬替尼1D NMR譜圖如圖1所示。由圖1(a,b)可知:除溶劑峰(DMSO-d6)外共有34個氫質(zhì)子和23組碳信號,其中碳信號結(jié)合圖1(c),可知共有12組伯碳或叔碳,3組仲碳,其余為季碳,部分碳原子由于化學(xué)結(jié)構(gòu)特性,其化學(xué)位移重疊在一起。

圖1 甲磺酸伊馬替尼1D NMR譜圖Fig.1 1D NMR spectrum of imatinib mesylate

甲磺酸伊馬替尼2D NMR譜圖如圖2所示。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)與位移可以將δ2.22處的質(zhì)子歸屬于H-24,結(jié)合圖2(b)中直接相連的碳?xì)潢P(guān)系,將δ17.56處的碳?xì)w屬為C-24。根據(jù)圖2(c)中遠(yuǎn)程偶合的碳?xì)潢P(guān)系,該處質(zhì)子與δ133.98處的碳信號相關(guān)聯(lián),可推出δ133.98為C-21。在圖2(b)中,C-21與δ7.20～7.21處質(zhì)子有相關(guān)點,將δ7.20～7.21處的質(zhì)子歸屬于H-22和H-22,對應(yīng)的碳化學(xué)位移為δ129.96,碳信號歸屬于C-22;在圖2(a)中,同一碳上的氫質(zhì)子有耦合關(guān)系,H-22與δ7.48～7.49處的質(zhì)子有相關(guān)點,將該處的質(zhì)子歸屬于H-23,對應(yīng)的碳化學(xué)位移為δ116.75,碳信號歸屬于C-23。根據(jù)結(jié)構(gòu),C-18是季碳,結(jié)合圖2(c)和圖1(c),可推出C-18化學(xué)位移為δ137.06;在圖2(c)中,C-18與δ8.07～8.08處的質(zhì)子有相關(guān)點,推出該處的質(zhì)子為H-19,由圖2(b)可以推出碳信號化學(xué)位移δ117.24為C-19;在圖2(c)中,H-19與δ137.74處有相關(guān)點,又根據(jù)圖1(c)顯示該處碳信號為季碳,可以推出碳信號為C-20。

圖2 甲磺酸伊馬替尼2D NMR譜圖Fig.2 2D NMR spectrum of imatinib mesylate

化合物結(jié)構(gòu)中共有3組仲碳,根據(jù)結(jié)構(gòu)可以判斷此處仲碳對應(yīng)的質(zhì)子峰信號在高場,且峰型為單峰,將δ3.64處的氫歸屬為H-8,根據(jù)圖2(b),將δ60.34處的碳?xì)w屬為C-8;在圖2(c)中,H-8與δ40.84處的碳有相關(guān)點,結(jié)合圖1(c),可以推出δ140.84處的碳信號為C-9,在圖2(c)中,C-9和δ7.94～7.95處的質(zhì)子有相關(guān)點,將δ7.94～7.95處的質(zhì)子歸屬于H-11和H-13;在圖2(b)中,將δ127.63處的碳信號歸屬為C-11和C-13;在圖2(a)中,δ7.94～7.95與δ7.45～7.46處的質(zhì)子有相關(guān)點,將δ7.45～7.46處的質(zhì)子歸屬為H-10和H-14;在圖2(b)中,將δ128.71處的碳信號歸屬于C-10和C-14;在圖2(c)中,H-11和H-13與δ134.35處有相關(guān)點,將δ134.35歸屬為C-12;在圖2(c)中,H-8與δ49.18處有相關(guān)點,將δ49.18處的碳信號歸屬為C-2和C-6,此處碳信號為仲碳,可以推出δ2.33和δ2.91處的質(zhì)子分別為H-2a,H-6a和H-2b,H-6b;在圖2(a)中,此2處質(zhì)子同時與δ2.89和δ3.04處的質(zhì)子相關(guān),推出該2處質(zhì)子分別為H-3a,H-5a和H-3b,H-5b,根據(jù)圖2(b),將δ52.71處碳信號歸屬為C-3,C-5。

由于羰基在碳譜中的位移處于低場,故將δ164.99處碳信號歸屬為C-15。在圖2(c)中,C-15與δ10.15處的質(zhì)子有相關(guān)點,將該質(zhì)子歸屬為H-16;在圖2(c)中,C-20與δ8.95處的質(zhì)子有相關(guān)點,將該質(zhì)子歸屬為H-25;在圖2(c)中,H-25與δ161.54有相關(guān)點,結(jié)合圖1(c),該處碳信號為季碳,將該碳信號歸屬為C-26;在圖2(c)中,C-26與δ8.50～8.51處的質(zhì)子有相關(guān)點,將該質(zhì)子歸屬于H-30,根據(jù)圖2(b),將δ159.41處碳信號歸屬于C-30;在圖2(a)中,H-30與δ7.42～7.43處的質(zhì)子有相關(guān)點,將該處質(zhì)子歸屬于H-29,根據(jù)圖2(b),將δ107.46歸屬為C-29;在圖2(c)中,H-29與δ161.14處的碳信號有相關(guān)點,且該處為季碳,將δ161.14歸屬為C-28;在圖2(c)中,C-28與δ9.27～9.23和δ8.46～8.48處的質(zhì)子有相關(guān)點,根據(jù)結(jié)構(gòu)以及峰形,將δ9.27～9.23歸屬為H-37,δ8.46～8.48歸屬為H-33;在圖2(b)中,將δ132.16歸屬為C-33,δ148.13歸屬為C-37;在圖2(c)中,C-33與δ7.50～7.52處有相關(guān)點,將該處質(zhì)子歸屬于H-34,在圖2(b)中,δ123.70歸屬為C-34;在圖2(c)中,C-34與δ8.67～8.68有相關(guān)點,將該處質(zhì)子歸屬為H-35,在圖2(b)中,將δ151.29歸屬為C-35;由于受到氮原子的電負(fù)性影響,與氮相連的甲基應(yīng)在較低場,故將δ2.79歸屬為H-7,δ2.31歸屬為H-4′;在圖2(b)中,將δ39.91歸屬為C-4′,δ42.16歸屬為C-7。

甲磺酸伊馬替尼的1D及2D的NMR結(jié)構(gòu)解析數(shù)據(jù)歸納整理如表1所示。

表1 甲磺酸伊馬替尼的NMR數(shù)據(jù)Table 1 NMR data of Imatinib Mesylate

2.2 專屬性實驗

馬來酸是常用的定量核磁共振法內(nèi)標(biāo)物,內(nèi)標(biāo)物馬來酸既不干擾待測物峰信號,又在DMSO-d6中有較好的溶解度,因此馬來酸可作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量。根據(jù)樣品和內(nèi)標(biāo)的溶解性,選擇DMSO-d6作為溶劑,由于高場區(qū)質(zhì)子信號密集,因此選擇低場區(qū)的質(zhì)子信號作為定量峰,待測物甲磺酸伊馬替尼低場區(qū)質(zhì)子信號分別選擇為δ7.21～7.22,δ7.43～7.44,δ7.54～7.56,δ8.103～8.106作為定量峰,并且與溶劑峰δ2.50、內(nèi)標(biāo)物馬來酸定量峰δ6.26互不干擾。甲磺酸伊馬替尼與馬來酸(MA)的1HNMR譜圖(DMSO-d6)如圖3所示。

圖3 內(nèi)標(biāo)組、樣品含內(nèi)標(biāo)組、樣品組的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR spectrum of IS, sample with IS, and samples

2.3 線性關(guān)系考察

采用1.3.1節(jié)的試品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液,2種溶液按V(供)∶V(內(nèi))分別為2∶5,3∶4,1∶1,4∶3,5∶2混合后至0.7 mL搖勻,分別精密量取混合溶液0.6 mL加至核磁共振樣品管中測試,以橫坐標(biāo)X為m(甲磺酸伊馬替尼)∶m(馬來酸),縱坐標(biāo)Y為定量峰面積,得到回歸方程為Y=0.097 6X-0.005,相關(guān)系數(shù)r=0.999,m(甲磺酸伊馬替尼)∶m(馬來酸)為0.92～5.77時與定量峰面積比呈良好線性。

2.4 儀器精密度實驗

精密稱取甲磺酸伊馬替尼5.97 mg,馬來酸對照品5.82 mg,溶解于0.6 mL DMSO-d6中,振蕩,轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中,按1.2節(jié)的條件連續(xù)測定5次,甲磺酸伊馬替尼和馬來酸定量峰峰面積比的RSD為0.93%。結(jié)果顯示該方法精密度良好,其結(jié)果如表2所示。

表2 儀器精密度實驗結(jié)果Table 2 Precision test results of instrument

2.5 重復(fù)性實驗

精密稱取甲磺酸伊馬替尼樣品6 mg,馬來酸對照品5 mg用0.6 mL DMSO-d6溶解,混勻。平均配制6份。按1.2節(jié)的條件測定,算出甲磺酸伊馬替尼定量峰面積與稱樣量比值的RSD為1.6%,甲磺酸伊馬替尼質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.6%。結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好,其結(jié)果如表3所示。

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 3 Repeatability test results

2.6 穩(wěn)定性實驗

取2.4節(jié)的樣品,室溫放置時間分別為0,4,8,12,18,24 h,測定其定量峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量峰面積比的RSD為1.08%,表明樣品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定性良好,其結(jié)果如表4所示。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 Stability test results

2.7 HPLC法與qNMR法測定結(jié)果對比

對于甲磺酸伊馬替尼原料藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定,參考了《印度藥典》2010年版中對甲磺酸伊馬替尼的規(guī)定,甲磺酸伊馬替尼對照品在質(zhì)量濃度為0.4～0.02 mg/mL時與峰面積X線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=89 602X-129.44,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9,平行配制3份樣品溶液,取峰面積平均值,得出甲磺酸伊馬替尼原料藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%。HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果與qNMR方法對比測得的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果98.6%基本一致。

3 結(jié) 論

實驗建立了qNMR方法測定甲磺酸伊馬替尼原料藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)。定量峰的選擇主要依據(jù)以下規(guī)則:1) 定量峰與其相鄰峰的分離度好,易于識別;2) 定量峰對應(yīng)氫質(zhì)子的化學(xué)結(jié)構(gòu)盡量與內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)相似,化學(xué)位移相近,減小誤差;3) 定量峰對應(yīng)的氫質(zhì)子為非活潑氫。在甲磺酸伊馬替尼的氫譜中,4處的共振峰δ在7.21～7.22,7.43～7.44,7.54～7.56,8.103～8.106均為芳環(huán)上SP2雜化碳上的氫,各之間均具有良好的分離度,同時內(nèi)標(biāo)馬來酸中的定量峰也為SP2雜化碳上的氫,化合物環(huán)境相似。因此,實驗中選擇4處化學(xué)位移的共振峰作為定量峰。在定量核磁實驗中不需要引入任何校正因子及特定的對照品,所需的樣品量少,對待測物無破壞性,而且檢測時間快,通過與HPLC定量法結(jié)果進(jìn)行對比,顯示質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果準(zhǔn)確。在采用HPLC測定有機酸鹽時,不僅流動相的配制操作繁瑣,而且對色譜柱的使用及壽命造成影響,不適合測定有機鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在采用qNMR方法對化合物定量的同時,還可以通過1D,2D NMR譜圖歸屬出化合物分子結(jié)構(gòu),滿足對甲磺酸伊馬替尼進(jìn)行質(zhì)量控制的要求。