禽蛋黃免疫球蛋白促進人體健康作用的研究進展

夏民權(quán)，李小萌，柳 聰，蔡朝霞

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，教育部環(huán)境食品學(xué)重點實驗室，蛋品加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖北 武漢 430070）

日常生活中，人類的健康受諸多因素影響，除了人體免疫系統(tǒng)功能和環(huán)境因素外，微生物在其中扮演著至關(guān)重要的角色。根據(jù)人體健康取向，微生物群可分為威脅人體健康的病原微生物和與人體系統(tǒng)互惠互利的非病原微生物。微生物的分布環(huán)境包括人類生活的環(huán)境，人類的體表[1]、口腔[2]、胃腸道黏膜[3-4]以及生殖系統(tǒng)[5-6]。據(jù)報道，超過1014個微生物與人體腸道微環(huán)境共存，其中包括超過104個細菌個體[7-8]。人體腸道內(nèi)微生物的種類涵蓋了細菌（至少存在一種古細菌）、真核生物、病毒[7]。它們與宿主之間維持著一個動態(tài)平衡，共同參與人體免疫系統(tǒng)的形成、成熟和維護，及必要營養(yǎng)素的合成等[4,8]。一旦這種動態(tài)平衡被打破，人體健康將受到不同程度的影響[9]，例如：輪狀病毒過量增殖導(dǎo)致腹瀉[10]；綠膿桿菌引起呼吸道感染[11]、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎等；幽門螺桿菌引起腸胃癌[12]；以及變異鏈球菌引起齲齒病[13]等。

對于人類健康面臨的威脅，目前主要的治療措施為疫苗注射、抗生素使用及其他藥物治療。主流治療方法引起的病原微生物耐藥性增加[14]日益成為人們不得不面對的健康難題[13]。因此，人們迫切需求尋找新的免疫治療方法。禽蛋類中的卵黃免疫球蛋白（yolk immunoglobulin，IgY）憑借其在被動免疫治療中獨特的優(yōu)勢逐漸被學(xué)者關(guān)注和研究，例如：IgY抗體是通過禽類免疫系統(tǒng)自然生產(chǎn)的，蓄積于雞蛋蛋黃中，來源天然健康；通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生的特異性IgY抗體能針對特定病原體的多個抗原表位，不會引起病原微生物的特異性抗性，也不會影響宿主體內(nèi)微生物菌群的結(jié)構(gòu)[15]；與哺乳動物的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）相比，IgY具有更好的局部活性和更強的抗原結(jié)合力[16]，另外，禽源IgY抗體不與哺乳動物細胞Fc受體結(jié)合，也不會與人類補體系統(tǒng)發(fā)生作用[17]，因此不會引起免疫副反應(yīng)（如過敏反應(yīng)）；IgY被動免疫治療理論上適用于各個年齡段的人群（包括嬰兒和孕婦以及免疫缺陷患者）[13,18]等。因此，口服IgY抗體疫苗在對抗因細菌、病毒以及真核生物誘發(fā)疾病的被動免疫治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。雖然目前IgY抗體應(yīng)對多種疾病的治療方法（抗蛇毒[19]、流感[20]等）已逐漸被開發(fā)和應(yīng)用，但是，IgY免疫功能區(qū)在被動免疫治療中的分子作用機理，降解產(chǎn)物在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)運、降解和利用，以及黏液屏障、胃腸道環(huán)境等因素導(dǎo)致口服IgY抗體的生物可及性和利用率低下等問題還沒有得到有效的解決。本文綜述了IgY抗體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能活性、IgY抗體研究應(yīng)用現(xiàn)狀，并指出新型IgY抗體疫苗能夠作為應(yīng)對當前日益劇增的突發(fā)衛(wèi)生事件（如新型冠狀病毒肺炎（以下簡稱新冠肺炎）、甲型H1N1流感、禽流感等）的新方法，以及IgY抗體可作為腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)劑，強化微生物菌群、維護人體健康，以期為IgY抗體在促進人類健康應(yīng)用中提供新的視角和研究啟發(fā)。

1 IgY抗體來源與構(gòu)成

IgY抗體是主要存在于禽類蛋黃中的一類免疫球蛋白，其功能與哺乳動物體內(nèi)的IgG相似[15]，由禽類機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，經(jīng)由血清轉(zhuǎn)移到蛋黃中[21]。據(jù)報道，經(jīng)病原微生物免疫的母雞能產(chǎn)生大量的IgY抗體，每個雞蛋約含100～150 mg[22]。一只母雞每年所產(chǎn)雞蛋中共含有20～40 g的IgY抗體，其中約有2%～10%為特異性抗體[23-24]。IgY抗體是由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的Y型結(jié)構(gòu)（圖1）。輕鏈是由可變區(qū)VL和恒定區(qū)CL構(gòu)成，重鏈可分為可變區(qū)VH和4 個恒定CH結(jié)構(gòu)域。輕鏈（VL-CL）和重鏈（VH-CH）之間通過二硫鍵連接，構(gòu)成了IgY的抗原結(jié)合區(qū)（Fab區(qū)），其可變末端（VL和VH）共同構(gòu)成了IgY的抗原識別和結(jié)合位點。重鏈的CH2-CH3-CH4區(qū)為可結(jié)晶片段（Fc區(qū)）[25-26]。Fab區(qū)主要由多肽序列構(gòu)成，參與抗原的特異性識別和捕獲，而Fc區(qū)主要由多糖序列構(gòu)成，參與對細胞上受體的信號識別和信息傳遞[27]。

圖1 IgY的基本結(jié)構(gòu)Fig. 1 Basic structure of IgY

高效、便捷的分離純化是進行IgY研究的前提，Tong Chenyao等[28]經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，蛋黃液先經(jīng)過不同濃度的去脂溶液（果膠、λ-卡拉膠、羧甲基纖維素、甲基纖維素和硫酸葡聚糖，用于去除不溶性脂質(zhì)和脂蛋白）處理后，使用硫酸銨鹽析、高效液相色譜純化，可得到高純度的IgY（質(zhì)量濃度和產(chǎn)率分別達到了8.36 mg/mL和83.3%）。賀真蛟[29]使用不同濃度的聚乙二醇（PEG 6000）經(jīng)過兩步沉淀-凝膠過濾色譜法制備得到純度為92.01%的IgY樣品，并對其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進行了分析鑒定。Zhou Xin等[30]在此基礎(chǔ)上，報道了一種利用木瓜蛋白酶酶解、二乙胺基乙基纖維素（diethylaminoethyl cellulose，DEAE）-瓊脂糖離子交換色譜法純化IgY片段（Fab和Fc片段）的簡便分離方法，并對Fab和Fc片段的回收率和純度進行了分析，為IgY的進一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

2 IgY抗體在免疫治療中的生物學(xué)活性

IgY抗體在禽類血液和組織液中主要通過毒素中和作用、調(diào)理作用和補體激活作用發(fā)揮免疫學(xué)功能[26]。當IgY抗體應(yīng)用于抵抗病原微生物時，其主要作用方式為抑制細菌酶的活性、阻斷病原微生物在宿主細胞上的黏附及中和病原微生物毒素[31]。IgY抗體還可以通過聚集、固定作用，阻斷病原微生物的擴散和增殖，便于被機體免疫系統(tǒng)識別和清除[32]；Jin[33]和Wang Zhaobin[34]等研究表明IgY抗體能抑制大腸桿菌K88對仔豬腸道黏液的黏附；IgY抗體還能與革蘭氏陰性菌表面暴露的成分（如脂多糖、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等）相結(jié)合，從而抑制病原菌在宿主體內(nèi)的黏附、定植及生長，抑制細菌的活性和毒素的釋放[25]。Arimitsu等[35]通過對志賀毒素2型e突變體特異性IgY抗體藥物動力學(xué)進行研究，發(fā)現(xiàn)IgY抗體能夠中和志賀毒素2型e突變體的毒性。

3 IgY抗體的穩(wěn)定性與安全性

IgY抗體在生產(chǎn)、加工、貯藏過程中，對環(huán)境中的pH值、溫度、酶等因素具有一定的抵抗穩(wěn)定性，為IgY抗體的研究和應(yīng)用提供了不小的便利。Nilsson等[36]報道IgY抗體4 ℃下儲存6 個月沒有發(fā)生活性損失。IgY抗體在室溫下儲存6 個月或者37 ℃環(huán)境儲存1 個月，沒有發(fā)生顯著的活性降低[17]。但是，溫度升高和加熱時間延長均會導(dǎo)致IgY抗體與抗原的結(jié)合活性下降，如當溫度從60 ℃升高到80 ℃時，IgY抗體的活性損失率從20%升高到90%[37]。－20 ℃下反復(fù)凍融不會影響IgY抗體的活性，但是，－70 ℃環(huán)境下儲存一年，IgY抗體的活性顯著降低，其最適的長期貯藏溫度為－20 ℃[38]。另外，Shin等[37]的研究還表明抗幽門螺旋桿菌IgY抗體在pH 4～8環(huán)境下保持穩(wěn)定，當pH值下降到3和2時，其活性分別降低了70%和80%。山梨醇能夠提高IgY抗體在酸堿性環(huán)境下的抗性[31]，如pH 5～7環(huán)境下，IgY抗體保持良好的穩(wěn)定性，而當pH＜3時，IgY抗體表現(xiàn)出顯著的不可逆失活，添加30%（以溶液體系質(zhì)量計）以上的山梨醇能顯著提高IgY抗體酸穩(wěn)定性[39]。類似地，蔗糖、麥芽糖、甘油、甘氨酸等物質(zhì)的添加也能夠為IgY抗體提供良好的保護作用[13]。除此之外，化學(xué)修飾（糖基化、磷酸化、唾液酸化等）也是改善IgY穩(wěn)定性的有效途徑。據(jù)報道，免疫球蛋糖鏈是由N-乙酰氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖、唾液酸、海藻糖等構(gòu)成[27,40]，并且存在多個可修飾的糖基化位點（圖1）。He Zhenjiao等[41]對構(gòu)成IgY的4 個糖基位點（葡萄糖、甘露糖、海藻糖、果糖）進行修飾，發(fā)現(xiàn)糖基化能改善IgY的親水性、熱穩(wěn)定性，但是會降低其抗原結(jié)合活性。Sheng Long等[42]進一步分析了N端糖基的去除對IgY構(gòu)象和穩(wěn)定性的影響，研究表明，N-聚糖的酶解導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、對胃蛋白酶的抗性均顯著降低，N-糖基化是維持IgY結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要原因。另外，據(jù)報道，IgY抗體對胰蛋白酶和凝乳蛋白酶也具有較強的抗性，但是能被胃蛋白酶分解[43]。胃蛋白酶對IgY抗體的分解高度依賴于環(huán)境的pH值（pH≥5時，IgY抗體保持有一定的胃蛋白酶抗性和抗原結(jié)合活性，當pH＜4.5時，其活性消失）[13]。低pH值條件下，IgY抗體活性的損失很可能是因為分子構(gòu)象的變化引發(fā)抗原結(jié)合位點的變形[44]。

另外，IgY的安全性也已經(jīng)得到了廣泛的認可。IgY是禽類通過免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生的抗體，蓄積于蛋黃中，來源天然健康；通過免疫反應(yīng)產(chǎn)生的特異性IgY抗體能針對特定病原體的多個抗原表位，不會引起病原微生物的特異性抗性，也不會影響宿主體內(nèi)微生物菌群的結(jié)構(gòu)[15]；從生物學(xué)角度來講，人與雞的親緣關(guān)系較遠，存在人和雞共患疾病的機率也較小，禽源IgY抗體不與哺乳動物細胞Fc受體結(jié)合，也不會激活人類補體系統(tǒng)[45]，不會引發(fā)免疫副反應(yīng)（如過敏反應(yīng)）；IgY被動免疫治療理論上適合各個年齡段的人群（包括嬰兒和孕婦以及免疫缺陷患者）[13,18]等。同時，IgY抗體長達10 年的臨床應(yīng)用[46]也證實了IgY抗體的安全性。

4 IgY抗體應(yīng)用的研究現(xiàn)狀

2019年末，來勢迅猛的新型冠狀肺炎病毒席卷全球。在巨大突發(fā)衛(wèi)生事件面前，人類醫(yī)療衛(wèi)生水平受到前所未有的挑戰(zhàn)。被動應(yīng)對新冠肺炎蔓延的同時，人們也在積極尋求治療策略，其中，很多科學(xué)工作者將目光轉(zhuǎn)移到了禽蛋IgY上，旨在尋求能夠?qū)剐鹿诜窝滋禺愋訧gY抗體。成立于美國芝加哥的IgY Life Sciences公司計劃利用抗冠狀病毒刺突蛋白IgY-110抗體制成噴劑通過鼻腔給藥治療新冠肺炎感染，并定于2020年9月進入第一階段臨床試驗，雖然目前還未達到預(yù)期效果[47]。在此之前，大量關(guān)于IgY的研究為其在新冠肺炎治療策略探索之路上提供了寶貴的研究經(jīng)驗。下面將對近年來IgY的研究和應(yīng)用進行回顧和歸納分析。

4.1 IgY抗病毒的研究

病毒的種類繁多，其誘發(fā)的疾病癥狀、發(fā)病機理不一，為了尋求良好的治療策略，科學(xué)工作者對IgY在病毒性疾病的治療和防控中做了大量研究。病毒的生物學(xué)結(jié)構(gòu)相對簡單，暴露于病毒表面的抗原決定簇是IgY特異性識別和發(fā)揮免疫功能的重要途徑。下面通過近幾年IgY在冠狀病毒和輪狀病毒防治中的一些研究來揭示其在病毒性疾病中的預(yù)防、治療潛力。

4.1.1 抗冠狀病毒

一直以來，冠狀病毒與人類共存，Bok等[48]對1994—2010年流行病原體牛冠狀病毒致病行為和抗原特性進行了對比分析。據(jù)報道，在野生反芻動物、狗和馬等宿主身上也檢測到了與牛冠狀病毒類似的病毒菌株[49]。2003年的非典型肺炎是因冠狀病毒引發(fā)的人類急性呼吸道感染并首次在人類群體中大規(guī)模傳播的案例，Cleri等[50]對非典型肺炎冠狀病毒從被發(fā)現(xiàn)到大范圍傳染的整個過程進行了詳細報道。大量科學(xué)工作者投身于冠狀病毒誘發(fā)的非典型肺炎疫苗和防治策略的研究中，其中，F(xiàn)u Chaoyang等[51]利用滅活的非典型冠狀病毒對雞進行免疫，從蛋黃中分離純化IgY，并對其中和活性進行了評估，發(fā)現(xiàn)IgY在抗非典病毒中具有極大的潛力。He Runtao等[52]報道，冠狀病毒對細胞通路的激活存在選擇性，冠狀病毒通過核衣殼蛋白（而不是膜蛋白）對激活蛋白-1相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行激活，不激活核因子-κB通路。Palaniyappan等[53]利用大腸桿菌表達非典型冠狀病毒核衣殼蛋白，并制備了相關(guān)的雞多克隆IgY抗體，聯(lián)合酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測法開發(fā)了一套對非典型冠狀病毒定量檢測系統(tǒng)。Lee等[54]在雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了對非典型冠狀病毒刺突蛋白具有高親和力的抗體片段，且其可以通過噬菌體展示技術(shù)大量表達。此外，Wei Shuangshi等[55]研究了雞IgY抗體對新冠肺炎模擬病毒的中和作用，并指出IgY抗體能夠抑制新冠肺炎病毒刺突蛋白與人的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）（受體）結(jié)合，證實了IgY抗體在新冠肺炎病毒防治上巨大的潛力。Somasundaram等[22]剖析了特異性IgY對新冠肺炎病毒的潛在治療價值，并對預(yù)防新冠肺炎的可能途徑進行了描述（圖2）。IgY抗體可以與冠狀病毒上的刺突蛋白特異性結(jié)合，從而競爭性抑制病毒對人體細胞受體的侵染，并且可以通過噬菌體展示技術(shù)對目標IgY抗體進行優(yōu)化和大量表達[22]。Lu Yan等[56]通過抗原表位定位發(fā)現(xiàn)了5 個IgY抗新冠肺炎病毒刺突蛋白的線性表位，IgY與抗原表位結(jié)合可以阻止蛋白酶對S1/S2裂解位點的切割，從而抑制新冠病毒與細胞膜融合和抑制病毒入侵細胞。開發(fā)IgY應(yīng)對新冠病毒的治療策略[57]和口服IgY法預(yù)防、治療呼吸道疾病[58]也被科學(xué)工作者認可和提倡。但是，目前人們對IgY在冠狀病毒中的研究和了解遠遠滿足不了IgY抗體在新冠肺炎防治應(yīng)用中的需求。因此，還需要大量的研究來推動IgY抗體技術(shù)在冠狀病毒防治中的應(yīng)用。

圖2 IgY抑制冠狀病毒侵染人體細胞示意圖[22]Fig. 2 Schematic diagram of inhibition of coronavirus infection in human cells by IgY[22]

4.1.2 抗輪狀病毒

輪狀病毒是世界范圍內(nèi)誘發(fā)嬰幼兒（5 周歲以下）腹瀉的重要病原體之一，它可以經(jīng)動物通過直接或者間接方式傳染給人類，甚至可能導(dǎo)致嬰幼兒的死亡[59]?？诜贵w被動免疫治療在這類流行病的防治中受到了廣泛的關(guān)注。大量研究表明，禽類IgY抗體能夠緩解、治療和預(yù)防輪狀病毒感染誘發(fā)的腹瀉等癥狀。例如，Vega等[60]研究發(fā)現(xiàn)，特異性IgY抗體對輪狀病毒誘發(fā)新生犢牛腹瀉具有有效的預(yù)防效果，IgY的治療可以顯著縮短犢牛腹瀉持續(xù)時間和降低嚴重程度。通過仔豬模型（仔豬生理和免疫特征與嬰兒極為相似）研究發(fā)現(xiàn)，口服IgY抗體作為牛奶補充劑能有效地保護新生豬免受輪狀病毒感染[59]。IgY能有效地降低人輪狀病毒誘發(fā)的小鼠腹瀉發(fā)病率，距離感染時間越短，IgY的治療效果越好，在感染后1 h內(nèi)口服IgY能完全預(yù)防腹瀉[43]。另外，在動物模型中的一些其他研究也證實了IgY對輪狀病毒感染具有良好的防治效果，如牛輪狀病毒感染[61]、人輪狀病毒誘發(fā)小鼠腸炎及防治[62]等。研究輪狀病毒的致病機制是徹底克服此類流行病的關(guān)鍵，也是研究IgY治療輪狀病毒病的立足點。20世紀90年代至今，大量研究已經(jīng)對輪狀病毒的致病機制進行了報道。Jolly等[63]報道，輪狀病毒的衣殼蛋白由VP4和VP7組成，VP4作為病毒的附著蛋白能被胰蛋白酶水解成VP5*和VP8*，這會導(dǎo)致病毒感染性增強[64]。輪狀病毒對MA104細胞受體的識別與半乳糖成分緊密聯(lián)系[63]。Puccetti等[65]發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒感染與不適當?shù)淖陨砻庖叻磻?yīng)相關(guān)。乳糜瀉被證實是易感個體對谷蛋白過度免疫導(dǎo)致，研究表明，輪狀病毒VP7蛋白與谷蛋白具有同源性肽，當腸上皮細胞暴露于輪狀病毒VP7衍生肽時，其調(diào)控基因簇與乳糜瀉中的調(diào)控基因簇相似[65]。輪狀病毒感染導(dǎo)致了小腸絨毛發(fā)育不良和萎縮、腸壁變薄、電解質(zhì)失衡、葡萄糖和氨基酸的轉(zhuǎn)運被抑制、鈉-鉀ATP酶活性降低、小腸上皮細胞通透性增加等[66]。IgY與輪狀病毒之間和對相關(guān)癥狀治療的作用機制也是目前科學(xué)工作者關(guān)注的熱點問題之一。在眾多的研究報道中，IgY對輪狀病毒的預(yù)防治療機制被認為是更趨向于：一方面能黏附和抑制病毒的增殖，中和病毒毒素[32,67]；另一方面加強了對生物體黏膜免疫的正向調(diào)節(jié)作用[59-60]。據(jù)研究報道，給出生前14 d的犢牛飼喂添加有抗牛輪狀病毒特異性IgY抗體的牛乳，犢牛腸黏膜中的抗體分泌細胞數(shù)量和同型抗體多樣性顯著增加，IgY在對生物體黏膜免疫正向調(diào)節(jié)中表現(xiàn)出積極作用[68]。輪狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4對腸細胞具有一定毒性[69]，IgY除了能抑制輪狀病毒在腸道中定植和在感染細胞間的擴散外，還能夠部分中和輪狀病毒的NSP4蛋白[32]。

4.2 IgY的抗菌潛力

暴露于細菌表面的多種結(jié)構(gòu)（如脂多糖、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等）是IgY抗體特異性識別和抑制細菌增殖擴散的重要位點[25]。大量研究表明，IgY抗體具有良好的抗菌效果和應(yīng)用潛力，例如，Lee等[70]研究發(fā)現(xiàn)特異性IgY抗體能有效地抑制腸沙門氏菌的生長，在含有抗鼠沙門氏菌特異性IgY抗體的脂質(zhì)培養(yǎng)基上，鼠沙門氏菌生長速度被抑制，僅為對照組的1/6～1/4。Zhen Yuhong等[71]用甲醛滅活的大腸桿菌O111免疫母雞，并從蛋黃中分離純化特異性IgY抗體，研究發(fā)現(xiàn)，特異性IgY抗體不僅能抑制大腸桿菌O111的生長，還能顯著增加分離自牛奶中的巨噬細胞和多形核中粒細胞對大腸桿菌O111的吞噬活性，從而具有抑制和預(yù)防奶牛因大腸桿菌O111增殖誘發(fā)的乳腺炎疾病的作用。金黃色葡萄球菌也是誘發(fā)奶牛乳腺炎的重要原因之一，與上述相似的研究結(jié)果在金黃色葡萄球菌的體外抑制實驗中也被報道[72]。Wang Linhui等[73]的研究表明，特異性IgY抗體是通過阻滯金黃色葡萄球菌在牛乳腺上皮細胞的內(nèi)化作用或者毒素中和作用來防止牛乳腺炎癥的發(fā)生。幽門螺桿菌是誘發(fā)胃炎、胃潰瘍、胃癌等病癥的重要原因之一，由于耐藥性增強，傳統(tǒng)抗生素（包括甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素等）在幽門螺桿菌誘發(fā)病癥的治療中顯得越來越乏力，特異性IgY抗體被動免疫治療可以很好地解決這個問題。幽門螺桿菌脲酶是抑制幽門螺桿菌增殖和感染正常細胞途徑中重要的抗原識別靶標，Suzuki等[74]對17 名無癥狀幽門螺桿菌感染者進行口服特異性IgY抗體治療試驗，治療4 周后發(fā)現(xiàn)13C尿素呼吸試驗數(shù)值顯著降低，證實特異性IgY抗體具有緩解和治療胃炎的潛力。銅綠假單胞菌感染是誘發(fā)囊性纖維化肺疾病導(dǎo)致肺功能下降的重要原因，Thomsen等[75]研究發(fā)現(xiàn)，特異性IgY抗體能改變細菌的適應(yīng)能力，增強多形核粒細胞介導(dǎo)的吞噬作用促進細菌的快速清除。此外，關(guān)于IgY對其他致病菌的防治研究也被報道，如變異鏈球菌[76]、白色念珠菌[77]等。由此可見，IgY在對抗致病菌中具有巨大的應(yīng)用潛力，然而，IgY抗菌功效的發(fā)揮受諸多因素限制。其中，“給藥途徑”是決定IgY能否在生物體內(nèi)發(fā)揮生物活性功能的首要因素，相比于傳統(tǒng)的皮下和靜脈注射，口服方式占據(jù)了絕對優(yōu)勢（如方便、痛苦小、不存在交叉感染、不需要定點集中操作等）。但是，口服遞送同樣也面臨諸多障礙，如IgY容易受到胃液環(huán)境的降解[13]、生物屏障（胃腸黏膜、細胞膜等）屏蔽IgY的吸收轉(zhuǎn)運[78]等。Chalghoumi等[79]通過將抗沙門氏菌特異性IgY抗體添加到飼料中對感染沙門氏菌的母雞進行飼喂實驗，由于口服遞送障礙的影響，不同給藥劑量的特異性IgY抗體對沙門氏菌的生長和盲腸定植均無顯著作用。所以，為了使IgY在生物疾病防治中起到良好的作用，需要建立靈活、智能、安全的遞送體系或者進行物理、化學(xué)改性修飾，達到避免酸性胃液環(huán)境的消化降解實現(xiàn)定點釋放和吸收的目的。

4.3 IgY參與營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)

生物體內(nèi)進行的營養(yǎng)物質(zhì)吸收、運輸、轉(zhuǎn)化和能量代謝過程（如糖酵解、三羧酸循環(huán)等）是一系列高效的酶促反應(yīng)過程，關(guān)鍵性酶數(shù)量的減少或者缺失會導(dǎo)致營養(yǎng)代謝紊亂。常見的因代謝紊亂誘發(fā)的疾病包括高膽固醇動脈粥樣硬化及肥胖等。利用特異性IgY對代謝過程中相關(guān)酶進行調(diào)控，有利于將IgY應(yīng)用于調(diào)節(jié)生物體的營養(yǎng)代謝。Ding Lili[80]和Li Jinmei[81]等研究表明，甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白是調(diào)節(jié)膽固醇、脂肪酸和甘油三酯生物合成相關(guān)基因表達的主要轉(zhuǎn)錄因子，姜黃素和大黃素能夠抑制甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，降低膽固醇和脂肪酸的生物合成。Li Meixin等[82]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，利用蛋白水解定向嵌合體介導(dǎo)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶蛋白（存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種跨膜蛋白，被認為是治療血脂異常經(jīng)典藥物靶點）的降解將可能是降低膽固醇水平和治療相關(guān)疾病的新策略。此過程類似于抗體結(jié)合誘導(dǎo)降解，因此，IgY特異性抗體也具有類似的潛力。關(guān)于IgY在能量調(diào)控中的作用效果也有文獻報道。例如，Bae等[83]報道了一種抗Niemann-Pick C1-Like 1（NPC1L1）（一種膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白）IgY特異性抗體對非酒精性脂肪肝的治療效果，圖3顯示了阻斷NPC1L1治療非酒精性脂肪肝的潛在機制[84]。Bobeck等[85]將人腸道鈉依賴磷酸轉(zhuǎn)運蛋白2b免疫母雞得到特特異性IgY抗體，通過飼喂小鼠治療高磷血癥，得到了積極的結(jié)果。Hirose等[86]制備并檢測了抗脂酶特異性IgY抗體抑制胰腺脂肪酶的活性及其預(yù)防肥胖的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗脂酶IgY抗體的使用伴隨著甘油三酯排泄量的增加，是一種良好的減肥策略。此外，Stadlmann等[87]利用單克隆抗體技術(shù)制備了雞的VH-VL單鏈抗體，并對其親和力進行了評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對由小麥醇溶蛋白誘發(fā)的小腸炎癥性疾病（乳糜瀉）具有很好的治療潛力。

圖3 IgY通過阻斷膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白（NPC1L1）治療非酒精性脂肪肝的潛在機制[84]Fig. 3 Potential therapeutic mechanism of IgY in nonalcoholic fatty liver disease by blocking cholesterol transporter (NPC1L1)[84]

4.4 IgY調(diào)節(jié)腸道微生物穩(wěn)態(tài)

微生物菌群與宿主免疫系統(tǒng)完整性息息相關(guān)，微生物通過直接參與或者通過代謝產(chǎn)物（如短鏈脂肪酸、膽汁酸、色氨酸代謝物等）間接參與宿主免疫調(diào)節(jié)作用[88]，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和免疫系統(tǒng)的成熟也有一定的影響[89]。腸道內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)失衡可以通過影響T細胞活性來觸發(fā)多種免疫功能紊亂[90]。IgY對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用主要包括兩個層面：一是對外來病原菌定植的清除作用；二是對土著菌群穩(wěn)態(tài)失衡的輔助調(diào)節(jié)作用。腸道內(nèi)，IgY對外來病原菌的清除作用與體外抗菌、抗病毒的作用過程類似。目前，關(guān)于IgY在腸道菌群穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方面的文獻報道非常少，最近一項工作對可能定植于腸道的幾種病原菌特異性IgY抗體進行研究，選取100 名志愿者進行為期12 周的口服試驗，通過16S RNA測序分析炎癥指標變化來反映腸道微生物菌群的調(diào)控情況[91]。該方法還需要進一步研究才能確保其有效性。綜上，借助IgY抗體對腸道微生物的微調(diào)控來實現(xiàn)維護宿主免疫健康，將是一種具有巨大潛力的新方法。

同時，一些其他相關(guān)的報道可能提供新的研究思路和可行性依據(jù)，例如，Wallace等[92]通過體外模擬腸液實驗分析了單克隆抗體（IgG1、IgA等）改善胃腸道穩(wěn)態(tài)的治療潛力，研究發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體的可變區(qū)有助于提高抗體自身的穩(wěn)定性和介導(dǎo)相關(guān)蛋白酶的敏感性。盡管單克隆抗體經(jīng)模擬腸液消化后產(chǎn)生了降解，但仍表現(xiàn)出對大腸桿菌產(chǎn)的產(chǎn)毒素抑制活性[92]。Xi Menglu等[93]分析了水蘇糖對微生物菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)水蘇糖可以促進雙歧桿菌增殖，提高短鏈脂肪酸、分泌型免疫球蛋白A和白蛋白水平，降低脂多糖誘發(fā)相關(guān)炎癥因子（白細胞介素-1、6、17和腫瘤壞死因子）表達，從而起到對腸道感染后部分菌群的恢復(fù)和保護作用。Chen Qingqing等[94]從腸黏膜免疫和腸道菌群的角度分析了黃連多糖對腸道穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連多糖能夠被腸道菌利用并且動態(tài)調(diào)控微生物菌群的組成、分布和多樣性，也能夠影響腸上皮組織炎癥因子的表達水平。除此之外，最近的報道表明，每千克飼料中添加12.1 g精氨酸能促進黃羽雞個體生長，提高腸道抗氧化能力、先天免疫力和調(diào)節(jié)微生物菌群（增加厚壁菌門、軟壁菌門和念珠菌屬相對豐度，降低梭狀芽孢桿菌相對豐度）[95]。氨基酸參與T、B淋巴細胞，自然殺傷細胞和巨噬細胞的活化調(diào)節(jié)，氨基酸的缺乏會導(dǎo)致免疫力下降，精氨酸、組氨酸和色氨酸在機體免疫增強中發(fā)揮著重要的作用[96]。

綜上，IgY可能通過直接作用于有害微生物（特異性識別和結(jié)合致病菌，抑制微生物增殖、擴散等作用）、間接途徑（毒素中和作用）、作為底物被微生物代謝利用、調(diào)節(jié)宿主細胞炎癥因子表達水平和水解產(chǎn)生活性多肽或者氨基酸等途徑參與腸道微生物和宿主免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。

5 口服IgY在被動免疫治療中的應(yīng)用

IgY抗體經(jīng)過胃腸道時，會被酸性的胃液環(huán)境消化[13]，加上生物屏障的存在[78]，會導(dǎo)致IgY抗體生物可及性和生物利用度下降甚至消失，這也是目前IgY的研究和應(yīng)用的技術(shù)難題之一。Winkelbach等[97]比較了口服和腹腔注射下IgY的被動免疫效果，發(fā)現(xiàn)給予鱒魚口服200 倍劑量（相對于腹腔注射）后，其血樣中仍檢測不到IgY，證實了胃液環(huán)境對IgY的消化降解。為了提高口服IgY的生物活性穩(wěn)定性和靶向吸收，科學(xué)工作者開展了系列相關(guān)的研究。納米包載技術(shù)的發(fā)展為IgY生物可及性的提高提供了很好的途徑，據(jù)報道，殼聚糖-海藻酸鈉逐層組裝載藥納米顆粒能實現(xiàn)對藥物在酸性胃液環(huán)境下保護，并在弱堿性小腸液環(huán)境中釋放，有效地促進IgY的靶向腸道釋放[98]。脂質(zhì)體[99]、膠束[100]、納米乳液[101]等包載技術(shù)在保證活性物質(zhì)經(jīng)胃腸道穩(wěn)定遞送中均取得了顯著的進展。Xu Le等[102]利用殼聚糖-海藻酸鹽體系對特異性IgY抗體進行包載，對大菱鲆體內(nèi)防治愛德華氏菌病效果進行評估，肯定了IgY包載體系的治療效果。Li Xiaoyu等[103]研究了特異性IgY抗體-殼聚糖-海藻酸鹽體系在豬體內(nèi)對產(chǎn)毒素大腸桿菌K88+的防治作用，也證實了殼聚糖-海藻酸鹽微膠囊可以保護IgY免受胃酸環(huán)境消化降解。Gu Luping等[104]也報道了海藻酸鈉/卡拉膠微膠囊系統(tǒng)可以通過靜電相互作用實現(xiàn)IgY在胃液環(huán)境下緊縮、小腸液環(huán)境膨脹釋放，達到定點遞送的目的。關(guān)于提高物質(zhì)在腸細胞處靶向性吸收的研究也有報道，Bakshi等[105]制備了重組抗體（特異性重鏈抗體片段與小鼠IgG 2a Fc結(jié)構(gòu)域融合），并通過單克隆抗體技術(shù)獲得大量抗氨肽酶N的特異性抗體（氨肽酶N為產(chǎn)毒素大腸桿菌F4菌毛特異性蛋白受體，在腸細胞上大量表達，常被作為黏膜疫苗口服給藥的靶標），以此作為載體實現(xiàn)病原疫苗的靶向遞送和靶向細胞吸收。然而，目前的遞送技術(shù)仍然滿足不了IgY在生物體液環(huán)境中穩(wěn)定、靶向遞送的需求，這方面的研究還相對薄弱。Magwira等[106]對腸道菌群影響口服輪狀疫苗作用效果現(xiàn)狀進行了綜述，并指出腸道菌群與口服疫苗有效性關(guān)系的研究仍處于初級階段，特定菌株的分子免疫調(diào)節(jié)功能尚不明確。因此，在人類被動免疫治療應(yīng)用過程中，需要更加靈活、智能的遞送體系來提高IgY在復(fù)雜多變的體內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定遞送和靶向吸收，更加詳細的分子互作機制需要進一步研究。

6 結(jié) 語

經(jīng)過科學(xué)工作者多年的研究，IgY抗體在人類被動免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用中的巨大潛力逐漸被發(fā)掘。IgY抗體穩(wěn)定性好、安全性高、免疫活性強、廉價、易獲得等特性為IgY的研究和應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。由于不會引發(fā)耐藥性，在病毒和細菌的防治過程中，IgY被視為抗生素的最佳替代品。另外，特異性IgY通過與相關(guān)代謝酶和炎癥因子等相互作用在營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)和腸道微生物菌群穩(wěn)態(tài)控制中顯示出巨大的潛力。更重要的是，IgY有望成為解決日益劇增的衛(wèi)生突發(fā)事件的新途徑。然而，人們對IgY在治療和預(yù)防生物性（病毒、細菌等微生物）疾病、調(diào)節(jié)營養(yǎng)吸收和能量代謝平衡、維持和微調(diào)控腸道微生物菌群和宿主免疫穩(wěn)態(tài)中的研究還處于初級階段，IgY發(fā)揮生物活性功能的作用途徑及作用方式仍不明確，就目前的了解遠遠滿足不了生活中預(yù)防和治療相關(guān)疾病的各種需求。為了應(yīng)對生物體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中出現(xiàn)的各種問題，大量未知領(lǐng)域有待進一步探索和研究，包括IgY與抗原之間、IgY降解產(chǎn)物之間或降解物與抗原之間及IgY與宿主細胞之間更加詳細的互作機制；IgY在腸道上皮細胞上的轉(zhuǎn)運行為及在生物體內(nèi)的作用方式；更加智能、強靶向性遞送體系的建立等。