西瓜后綠突變體光合特性分析

徐 銘，高美玲,2，郭 宇，包秀萍，劉秀杰，劉繼秀，高 越

(1 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 齊齊哈爾 161006；3齊齊哈爾市園藝研究所, 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

葉色突變是植物最常見的突變之一,現(xiàn)已在多種植物中被發(fā)現(xiàn)，目前報(bào)道的葉色突變體有白化、黃化、淺綠、白翠、綠白、黃綠、綠黃和條紋共8種類型[1]。

關(guān)于葉色突變體的大部分報(bào)道集中在大田作物中，其中除少部分葉色突變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)遺傳外，大部分葉色突變?yōu)榧?xì)胞核遺傳[2]。如已在水稻中發(fā)現(xiàn)了140種葉色突變體，分布在12個(gè)染色體上，其中有少部分葉色突變體已被克隆[3-5]。在葫蘆科作物黃瓜中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了17種葉色突變體，其中有4種致死性的葉色突變(al、cd、gc和pl)和13種能穩(wěn)定遺傳的葉色突變(yp、yf、g、yc-1、yc-2、ygl、lg-1、lg-2、v、v-1、vvi、vyl、YL)[6-10]，甜瓜(ypl、MT)[11-12]、西瓜(YL、I-dg、dg)[13-17]也陸續(xù)出現(xiàn)葉色突變體的報(bào)道。葉色突變的形成原因不一，主要原因包括葉綠體發(fā)育受阻、葉綠素合成途徑受阻、葉綠素降解等，這都可以導(dǎo)致植物葉片葉綠素含量降低，從而使葉片顏色無法呈現(xiàn)綠色[18]。葉色突變已應(yīng)用在雜種鑒定中，可作為葉色標(biāo)記分辨出雜交品系中的自交種[13]。后綠突變體具有轉(zhuǎn)綠特性，對(duì)植株光合能力影響較小，因此后綠性狀也適合作為葉色標(biāo)記應(yīng)用于雄性不育系和優(yōu)良品系[19]。

齊齊哈爾大學(xué)西甜瓜育種課題組于田間發(fā)現(xiàn)一個(gè)后綠突變西瓜品系(命名為63)，田間種植表明該葉色突變能穩(wěn)定遺傳。本研究以該后綠突變品系63為試驗(yàn)材料，由于缺少該突變體的野生型品系，故選用綠葉品系Liu-2作為對(duì)照，通過測(cè)定其光合色素含量、光合參數(shù)及熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)并進(jìn)行比較分析，以期初步了解此后綠突變體的光合特性，為進(jìn)一步探究西瓜的葉色后綠機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選用田間發(fā)現(xiàn)的西瓜后綠突變體63，以正常綠葉品系Liu-2為對(duì)照，取2個(gè)品系各20粒完整飽滿的種子，溫湯浸種并催芽，播種于育苗穴中，待兩葉一心時(shí)定植于黑龍江齊齊哈爾市曙光村大棚，株距14 cm，行距20 cm，常規(guī)田間管理。如圖1所示，在植株伸蔓期時(shí)，以西瓜葉色后綠突變體63第三節(jié)位(Ⅰ時(shí)期)黃化葉片、第九節(jié)位(Ⅱ時(shí)期)綠色葉片為試驗(yàn)材料，用于后綠突變體轉(zhuǎn)綠前后光合色素含量、光合參數(shù)、熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。

a.63第三節(jié)位葉片；b.63第九節(jié)位葉片；c.Liu-2第三節(jié)位葉片；d.Liu-2第九節(jié)位葉片；e.63植株生長(zhǎng)形態(tài)，其中Ⅰ、Ⅱ分別表示63植株第三節(jié)位和第九節(jié)位葉片。比例尺=1 cma.63 3rd node;b.63 9th node;c.Liu-2 3rd node;d.Liu-2 9th node.e.63 Plant growth pattern,Ⅰ and Ⅱ indicate the 3rd node leaf and 9th node leaf of 63 plant.Scale:1 cm

63子葉出土?xí)r呈淡黃色，隨后萌生的真葉也呈淡黃色，第二片真葉展平后，原本黃化的子葉整體轉(zhuǎn)綠。隨著植株生長(zhǎng)發(fā)育，后續(xù)萌生出的所有新葉均呈淡黃色，但隨著葉片生長(zhǎng)發(fā)育自葉緣向內(nèi)轉(zhuǎn)綠，這種后綠的特征伴隨該品系的整個(gè)生長(zhǎng)期，并且該突變體能夠正常結(jié)實(shí)。2019和2020年其果實(shí)品質(zhì)性狀見表1。

表1 后綠突變西瓜63果實(shí)的相關(guān)性狀Table 1 Fruit related traits of virescent mutant 63

1.2 光合色素含量測(cè)定

用乙醇提取法[20]進(jìn)行葉綠素提取。在63和Liu-2的Ⅰ、Ⅱ兩時(shí)期各取10片葉片為1組(共4組)，將每組葉片剪碎混勻，稱取0.2 g加入10 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇避光浸泡48 h，期間進(jìn)行多次振蕩，重復(fù)3次。

采用可見光分光光度計(jì)測(cè)量663，645 和470 nm波長(zhǎng)的吸光值并計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、總?cè)~綠素(Chl)和類胡蘿卜素(Caro)含量，計(jì)算公式為:

Chl a=(12.7A663 nm-2.69A645 nm)×V/(W×1 000)；

Chl b=(22.9A645 nm-4.68A663 nm)×V/(W×1 000)；

Caro=(1 000A470 nm-3.27 Chl a-104 Chl b)×V/(229×1 000×W)；

Chl=Chl a+Chl b。

式中：Chl a、Chl b、Caro、Chl分別表示葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、總?cè)~綠素含量(mg/g)，A663nm、A645nm、A470nm分別表示相應(yīng)波長(zhǎng)下的OD值，V表示提取液體積(mL)，W表示葉片質(zhì)量(g)。

1.3 光合參數(shù)測(cè)定

使用Li-6400測(cè)定光合參數(shù)。選擇晴朗上午測(cè)定63和Liu-2 Ⅰ、Ⅱ兩時(shí)期的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.4 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

使用Li-6400測(cè)定熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)63和Liu-2 Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)時(shí)期的葉片進(jìn)行標(biāo)記，并使用錫箔紙嚴(yán)密包裹，經(jīng)過30 min以上暗處理后，測(cè)定初始熒光產(chǎn)量(F0)、最大熒光產(chǎn)量(Fm)及最大光化學(xué)效率(Fv/Fm，F(xiàn)v=Fm-F0)，隨后對(duì)標(biāo)記葉片進(jìn)行30 min以上的光活化，測(cè)定或計(jì)算光下最小熒光產(chǎn)量(F0′)、光下最大熒光產(chǎn)量(Fm′)、實(shí)際光化學(xué)效率(Fv′/Fm′，F(xiàn)v′=Fm′-F0′)、實(shí)際光化學(xué)量子效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和電子傳遞效率(ETR)。重復(fù)3次取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Execl表格進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并使用SPSS工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用One-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 后綠突變體63光合色素含量的變化

由表2可知，在西瓜葉片的Ⅰ和Ⅱ時(shí)期，正常綠葉品系Liu-2葉片中的Chl a、Chl b、Caro、Chl及Chl a/Chl b差異不顯著，Caro/Chl顯著降低了2.7%；而后綠突變體63葉片中的Chl a、Chl b、Caro及Chl在兩個(gè)時(shí)期間均存在極顯著差異，Ⅱ時(shí)期較Ⅰ時(shí)期分別增加177.7%，251.9%，92.0%和171.1%，而Caro/Chl極顯著降低了29.2%。可見光合色素含量在正常綠葉品系的幼葉和功能葉之間無明顯差異，而在后綠突變體中卻有極顯著變化。

表2 Ⅰ和Ⅱ時(shí)期正常綠葉品系Liu-2及后綠突變西瓜63生長(zhǎng)過程中光合色素的變化Table 2 Changes in photosynthetic pigments during growth of normal green leaf inbred line Liu-2 and virescent mutant watermelon 63 in periods Ⅰ and Ⅱ

2.2 后綠突變體63光合參數(shù)的變化

由表3可知，與Ⅰ時(shí)期相比，正常綠葉品系Liu-2 Ⅱ時(shí)期葉片的Pn增加了133.1%；差異達(dá)極顯著水平;Ci含量降低16.0%，差異達(dá)顯著水平；Gs增加41.0%，差異也達(dá)顯著水平；Tr增加7.3%,差異不顯著。說明對(duì)正常綠葉品系而言，西瓜幼葉至功能葉的轉(zhuǎn)變，能夠在一定程度上提高葉片的光合能力。表3表明，與Ⅰ時(shí)期相比，后綠突變西瓜63 Ⅱ時(shí)期葉片的Pn、Gs和Tr分別增加了1 213.7%，49.6%和17.3%，差異均達(dá)極顯著或顯著水平；而Ci含量降低19.3%，二者間也存在極顯著差異。上述結(jié)果說明，在Ⅱ時(shí)期，正常綠葉品系Liu-2和后綠突變體63的功能葉較幼葉光合能力均有所提升，但后綠突變體63的Pn提升了1 213.7%，正常綠葉植株增加相對(duì)較小。

表3 Ⅰ和Ⅱ時(shí)期正常綠葉品系Liu-2及后綠突變西瓜63光合特性的變化Table 3 Changes in photosynthetic characteristics of green leaf inbred line Liu-2 and virescent mutant watermelon 63 in periods Ⅰ and Ⅱ

2.3 后綠突變體63熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

由表4可知，與Ⅰ時(shí)期相比，Ⅱ時(shí)期正常綠葉品系Liu-2的F0減小了5.2%，二者差異不顯著，而Fm、Fv/Fm、Fv′/Fm′、ΦPSⅡ、qP、ETR分別增加了8.0%，3.1%，34.0%，77.2%，32.4%和77.2%，差異均達(dá)到極顯著水平。與Ⅰ時(shí)期相比，Ⅱ時(shí)期后綠突變西瓜63的F0、Fm分別增加78.1%和124.1%，差異均達(dá)到極顯著水平，且增加幅度均明顯大于Liu-2，同時(shí)Fv/Fm、Fv′/Fm′、ΦPSⅡ、qP、ETR較轉(zhuǎn)綠前分別增加6.6%，25.3%，70.0%，34.5%和68.5%，差異也均達(dá)到極顯著水平。

表4 Ⅰ和Ⅱ時(shí)期正常綠葉品系Liu-2及后綠突變西瓜63熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化Table 4 Changes in chlorophyll fluorescence parameters of green leaf inbred line Liu-2 and virescent mutant watermelon 63 in periods Ⅰ and Ⅱ

3 討 論

實(shí)際觀察發(fā)現(xiàn)，后綠突變體63子葉出土后呈淡黃色，第一片真葉也呈淡黃色，當(dāng)?shù)诙嫒~展平后，子葉整體轉(zhuǎn)綠。隨著植株生長(zhǎng)發(fā)育，后續(xù)萌生出的所有新葉均呈淡黃色，這種后綠的特征伴隨該品系的整個(gè)生長(zhǎng)期。目前在西瓜作物中，關(guān)于葉色突變體的報(bào)道較少。任藝慈等[10]發(fā)現(xiàn)一株西瓜黃化突變體YL，該突變體葉色黃化特性伴隨其整個(gè)生長(zhǎng)期。王鳳辰等[14]發(fā)現(xiàn)一株“芽黃”西瓜突變體，該突變體嫩芽為淡黃色，第一片真葉呈淡黃色，隨葉片生長(zhǎng)發(fā)育自葉柄至全葉由黃轉(zhuǎn)綠，當(dāng)?shù)诙嫒~展平時(shí)，第一片真葉已經(jīng)基本轉(zhuǎn)綠。而與其相比，本試驗(yàn)的后綠突變體63的轉(zhuǎn)綠速度較慢。Haileslassie[17]報(bào)道了一個(gè)西瓜后綠突變體“后綠”，該突變株葉型較后綠突變體63寬大，同時(shí)萌生出的新葉呈現(xiàn)淡綠色，隨著葉片生長(zhǎng)發(fā)育，葉片逐漸完全轉(zhuǎn)綠。而后綠突變體63轉(zhuǎn)綠后葉片中的Chl及Caro含量仍低于對(duì)照植株。綜上所述，63是一株新發(fā)現(xiàn)的西瓜后綠突變體。

葉綠素是植物光合作用中的重要色素，葉綠素可以捕捉光能并轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[21]。Haileslassie[17]研究表明，西瓜后綠突變體“后綠”新葉的光合色素缺失，隨著植株生長(zhǎng)發(fā)育光合色素快速積累，完全轉(zhuǎn)綠后葉片中的光合色素含量與對(duì)照正常綠葉品系一致。而63新葉光合色素大量缺失，轉(zhuǎn)綠后其Chl、Caro逐漸提高，但仍低于對(duì)照正常綠葉品系Liu-2。該結(jié)果表明，西瓜后綠突變體63的轉(zhuǎn)色機(jī)制不同于突變體“后綠”。大部分后綠突變體轉(zhuǎn)綠前，葉片中的Chl a/Chl b值低于轉(zhuǎn)綠后的Chl a/Chl b值，該類型后綠突變體轉(zhuǎn)綠前表現(xiàn)為Chl、Caro大量缺失，即為“總?cè)~綠素缺失型”[7,11,17,22]。另一種后綠突變體轉(zhuǎn)綠前葉片中的Chl a/Chl b值高于轉(zhuǎn)綠后的Chl a/Chl b值，該類型后綠突變體是由于Chl a向Chl b轉(zhuǎn)化的過程中受阻，造成Chl b缺失，從而導(dǎo)致Chl缺失，即為“葉綠素b缺失型”[23]。后綠突變體63轉(zhuǎn)綠前光合色素含量大量缺失，符合“總?cè)~綠素缺失型”的描述。正常綠葉品系葉片中的Caro/Chl約為1∶3，本研究表明，正常綠葉品系Liu-2 Ⅰ時(shí)期和Ⅱ時(shí)期的Caro/Chl分別為0.297和0.289，接近為1∶3，與前人研究結(jié)果[24]一致；后綠突變體63轉(zhuǎn)綠前的Caro/Chl為0.431，故葉片呈現(xiàn)淡黃色，轉(zhuǎn)綠后Chl a、Chl b的積累速度快于Caro的積累速度，完全轉(zhuǎn)綠后Caro/Chl為0.305，故葉色開始呈現(xiàn)綠色。

光合色素含量直接或間接影響著植物的光合能力，隨著后綠突變體63轉(zhuǎn)綠，葉片中的光合色素含量恢復(fù)，Pn提高，Ci降低，這也表明隨著光合色素的累積，后綠突變體63光合能力可以恢復(fù)，該結(jié)果與苗晗[25]的研究結(jié)果一致。后綠突變體63的Gs及Tr的提高程度大于正常綠葉品系，可能是氣孔部分關(guān)閉和光合色素缺失共同導(dǎo)致了植株的光合能力減弱，該規(guī)律與楊佳秀等[26]的研究結(jié)果一致。

F0為光系統(tǒng)Ⅱ的初始熒光產(chǎn)量，F(xiàn)m為光系統(tǒng)Ⅱ中通過的最大電子數(shù)量，F(xiàn)0和Fm與光合色素含量相關(guān)；Fv/Fm值可以反映光系統(tǒng)Ⅱ中光能的最大轉(zhuǎn)化效率，F(xiàn)v′/Fm′則反映了光系統(tǒng)Ⅱ原初光能的轉(zhuǎn)化效率[27]，ΦPSⅡ表示光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H的光化學(xué)量子效率，qP表示光化學(xué)淬滅，ETR表示電子傳遞速率[28]。后綠突變體63 Ⅰ時(shí)期熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定表明，其F0、Fm均小于同時(shí)期正常綠葉品系Liu-2，說明63轉(zhuǎn)綠前對(duì)光能的捕捉能力較弱，從而導(dǎo)致63的凈光合速率低于同時(shí)期的正常綠葉品系，這與林秋云等[29]的研究結(jié)果相一致。后綠突變西瓜63及正常綠葉品系Liu-2兩品系Fv/Fm、Fv′/Fm′、ΦPSⅡ、qP、ETR的變化程度比較接近，說明后綠突變西瓜63及正常綠葉品系Liu-2的光化學(xué)效率、光能實(shí)際利用率、光能轉(zhuǎn)換率和電子轉(zhuǎn)遞效率逐漸提高，是葉片發(fā)育由幼葉發(fā)育為功能葉所致，與其光合色素含量的增加并不相關(guān)。因此筆者推測(cè)，后綠突變體63轉(zhuǎn)綠后，由于葉片光合色素含量的提高，其對(duì)光的捕捉能力和熒光產(chǎn)量也隨之提高，這是凈光合速率提高的主要原因。