巨桉幼樹對鎘脅迫的光合生理響應

文 靜，胡紅玲，陳 洪，劉喜建，代大川，張如義

(1 四川農(nóng)業(yè)大學 林學院，四川 成都 611130；2 西昌學院 農(nóng)業(yè)科學學院，四川 西昌 615000；3 內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學院，四川 內(nèi)江 641000)

由于工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，土壤重金屬污染速度加快，同時土壤中重金屬的有效性進一步提高[1]。對植物而言，鎘(Cd)雖然不是其生長所需的營養(yǎng)元素，但Cd的移動性較強，易被植物根系吸收，土壤中鎘過量會嚴重影響植物的生長發(fā)育[2]，導致植物及其產(chǎn)品品質(zhì)下降[3]，并通過食物鏈直接威脅人類的健康[4]。鎘進入植物體后通常會改變其細胞膜透性，使植物的光合作用、呼吸作用及氮同化能力等受到抑制，引起植物體內(nèi)的生理生化過程紊亂，植物生長發(fā)育受阻，嚴重時會導致植株死亡[5]。四川省礦產(chǎn)豐富，重金屬污染形勢也較為嚴峻，如李志濤等[6]研究發(fā)現(xiàn)，江安縣某硫鐵礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤鎘超標率達99%。

巨桉(Eucalyptusgrandis)為桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)的一個種，具有適應性強、速生、高產(chǎn)等特點，是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦的三大速生造林樹種之一[7]，為當今世界栽培面積最大的一種桉樹[8]。巨桉在我國南方地區(qū)已成為營造短周期工業(yè)原料林的重要樹種，也是四川栽培的主要樹種之一，廣泛分布在川中、川南、川東南、川西南邊緣地帶。因其特殊的材質(zhì)、紋理特征和藥用成分，被廣泛應用于造紙、人造板、農(nóng)藥和醫(yī)藥等行業(yè)，對解決我國木材供需矛盾、農(nóng)林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及地方經(jīng)濟的提升具有重要作用[9-11]。目前對于巨桉的研究多集中在栽培經(jīng)營技術(shù)、耗水特性、干旱脅迫響應等方面[12-14]，而有關(guān)巨桉對重金屬脅迫耐受機制的相關(guān)研究并不多見，特別是從光合生理特性方面進行的探索更少。植物的光合作用對重金屬較為敏感，而葉綠素熒光是研究植物光合性能的理想探針，其參數(shù)的變化不僅可以直觀反映脅迫對植株的影響，還可用于評價植株的抗逆性能[15]。

本研究以巨桉幼樹為材料，通過盆栽試驗探討了其光合速率、光響應、葉綠素熒光等對不同水平鎘脅迫的響應，以期為巨桉適宜立地條件的選擇以及鎘污染生境修復的可行性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于四川農(nóng)業(yè)大學(成都校區(qū))教學科研試驗基地，地處東經(jīng)103°51′29″，北緯30°42′18″，屬亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，四季分明，氣候溫和濕潤，夏季高溫多雨。年均總?cè)照諘r數(shù)840.2 h，年均降水量759.1～1 155.0 mm；年均氣溫16.8 ℃，月平均最高溫為25.9 ℃(7月)，月平均最低溫為6.9 ℃(12月)，極端高溫38 ℃(7月)，極端低溫-2 ℃(1月)；年均相對濕度84%。

1.2 試驗材料

1.2.1 栽植土壤與容器 土壤取自雅安坡積土，使用前除去土壤中過大的植物殘體和石礫。土壤理化性質(zhì)為：pH 6.5，全氮15.06 g/kg，全磷1.69 g/kg，全鉀12.10 g/kg，鎘0.72 mg/kg。栽植容器采用規(guī)格一致的塑料盆(盆口直徑30 cm、高26 cm、底徑25 cm)，每盆等量裝土8 kg(干土質(zhì)量)。

1.2.2 供試植株及其栽培管理 2017年12月，選取長勢良好、健康無病蟲害的巨桉幼苗(組培苗，苗齡近4個月，平均高15 cm)，每盆栽植1株，移栽后常規(guī)水肥管理，進行5個月的適應性培養(yǎng)。在此期間采用HH2土壤水分測定儀(ML2x，GBR)定期監(jiān)測土壤水分狀況，使土壤體積含水量保持在18%左右(即該試驗用土田間持水量的70%～80%)。試驗開始前15 d，將所有待處理植株移入通風透氣的大棚內(nèi)并停止施肥，以避免肥料對鎘效應的干擾。施鎘時苗齡約9個月(2018年5月)，平均株高(86.3±4.2) cm，平均地徑(7.98±0.96) mm，植株健康整齊。

1.3 試驗設計

本試驗采用單因素完全隨機試驗設計。參照國家環(huán)境質(zhì)量標準(GB 15618-2018)[16]以及四川省農(nóng)村土壤鉛、鎘含量調(diào)查[17]結(jié)果，試驗共設置5個鎘處理水平，分別為CK(0 mg/kg)、T1(12.5 mg/kg)、T2(25 mg/kg)、T3(50 mg/kg)和T4(100 mg/kg)，每個處理重復3次，添加鎘的形態(tài)為CdCl2·2.5H2O，對應于5個處理的添加量依次為0.00，25.39，50.78，101.56和203.11 mg/kg，均以溶液的形式添加到土壤中。為方便分析闡述，本研究將處理T1、T2稱為低水平， T3、T4稱為高水平。

試驗于2018年5月8日開始，為符合鎘在自然條件下逐漸排放的實際，將各處理鎘施入量等分為5份，于2018年5-9月分5次施入。每盆用500 mL去離子水與CdCl2·2.5H2O配制成溶液，以植株根頸處為中心逐步向外圍均勻施入，避免溶液濺到植物表面。CK澆等量的去離子水，試驗期間的水分管理亦使用去離子水。2018年10月底，每處理選取3～4個植株上相同葉位(樹冠上2/3處)的成熟功能葉，采用Li-6800便攜式光合測定儀(Li-Cor Inc., USA)分別測定氣體交換參數(shù)、光合-光響應特征曲線以及葉綠素熒光參數(shù)；隨后采集功能葉，裝入密封袋(不封口)，標記好后置于冰盒中，即刻帶回實驗室測定葉綠素含量。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 光合色素含量 葉綠素含量參照熊慶娥[18]的方法，采用直接浸提法測定。采集葉片后，將其擦凈、剪碎，置于V(丙酮)∶V(無水乙醇)∶V(水)=4∶5∶1的提取液中提取光合色素，再用分光光度計分別在波長665，649和470 nm下測定吸光度，然后計算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量。

1.4.2 光合特性 凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)使用Li-6800便攜式光合測定儀測定。參照李辛等[19]的測定方法并進行適當調(diào)整。于2018年10月選取晴天上午9:00-11:30時段，選取完全展開的成熟功能葉，每個處理重復測定3株，每株測定3個葉片。測定時設定參比室CO2含量為400 μmol/mol，葉室溫度為30 ℃，葉室相對濕度為50%，光照強度設定為環(huán)境光強(1 000 μmol/(m2·s))。

1.4.3 光合-光響應曲線 通過預試驗測得巨桉幼樹的光飽和點在800 μmol/(m2·s)左右，故首先將巨桉幼樹葉片在800 μmol/(m2·s)的光強下進行光誘導直至Pn穩(wěn)定(約需30 min)，然后使用Li-6800便攜式光合測定儀的光響應曲線自動測定程序進行測定，測定時間和各參數(shù)設置同上，光強梯度設定為1 800,1 500,1 200,1 000,800,600,400,200,150,100,75,50,25和0 μmol/(m2·s)。

1.4.4 葉綠素熒光參數(shù) 選擇與光合特性測定相同的巨桉葉片，使用Li-6800便攜式光合測定儀進行測定，測定時間和各參數(shù)設置同上。參照Ali等[20]的方法并進行適當調(diào)整。測定前首先對葉片進行暗適應(用錫箔紙包裹待測葉片)，待暗適應一整夜后，第2天測定初始熒光(F0)和最大熒光(Fm)，然后根據(jù)各遮陰處理的環(huán)境光強設定活化光，光活化50 min以上后，再測定任意時間實際熒光產(chǎn)量(F)、光下最小熒光F0′和光下最大熒光Fm′，每處理測定3片葉子。根據(jù)測定數(shù)據(jù)，計算可變熒光Fv(Fm-F0)、PSⅡ潛在活性(Fv/F0)、PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光化學量子產(chǎn)量ΦPSⅡ((Fm′-F)/Fm′)、電子傳遞速率ETR(ΦPSⅡ×0.5×PPFD)(其中PPFD表征吸收光的光量子通量，單位為μmol/(m2·s))、光化學淬滅系數(shù)qP((Fm′-F)/(Fm′-F0′) )和非光化學淬滅系數(shù)NPQ(Fm/Fm′-1)[21]。參照Demmig-Adams等[22]提出的方法計算PSⅡ吸收光能的分配比例，光化學反應耗散的能量可用公式P=qP×Fv′/Fm(其中Fv′指光下可變熒光產(chǎn)量，F(xiàn)v′=Fm′-F0′)求得，根據(jù)D=1-Fv′/Fm′可求出用于天線熱耗散的能量；通過Ex=(1-qP)×Fv′/Fm′可求得反應中心非光化學反應耗散的能量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 22.0(SPSS Inc., USA)統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著水平α設定為0.05，用Duncan’s新復極差法進行多重比較，用Origin 2018軟件(Origin Lab.,USA)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對巨桉幼樹葉片光合色素含量的影響

由表1可以看出，隨著鎘處理水平的提高，巨桉幼樹葉片葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、總?cè)~綠素(Chl(a+b))和類胡蘿卜素(Car)含量均呈下降趨勢，但Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量僅以T4處理較CK下降顯著(P<0.05)，降幅分別達34.2%，31.0%和33.2%；而Car含量從T2處理開始顯著下降(P<0.05)。此外，各處理葉綠素a與b的比值(Chl a/b)與對照間均無顯著差異。上述結(jié)果表明，巨桉幼樹葉片類胡蘿卜素含量對鎘處理的反應較葉綠素更加敏感，而葉綠素a對鎘處理的敏感程度與葉綠素b相似。

表1 不同水平鎘處理下巨桉幼樹葉片的光合色素含量Table 1 Changes of photosynthetic pigment contents in E. grandis saplings under different cadmium treatments

2.2 鎘脅迫對巨桉幼樹光合特性的影響

由表2可知，隨著鎘處理水平的提高，巨桉幼樹葉片的Pn和Gs均呈下降趨勢，到高水平處理(T3、T4)時與CK差異均達顯著水平(P<0.05)；Tr表現(xiàn)出相同的變化趨勢，但從T2處理開始較CK顯著降低；而Ci隨鎘處理水平的提高呈上升趨勢，且從T2處理開始顯著高于CK(P<0.05)。這說明巨桉幼樹葉片光合作用能力下降的主要原因是非氣孔限制因素所致。

表2 鎘脅迫對巨桉幼樹光合特性的影響Table 2 Effects of cadmium stress on photosynthetic characteristics of E. grandis saplings

2.3 鎘脅迫對巨桉幼樹葉片光合-光響應特征的影響

由圖1可以看出，不同水平鎘處理巨桉幼樹光合-光響應曲線的變化趨勢基本相似，即在低PAR(≤150 μmol/(m2·s))條件下，巨桉Pn隨PAR的增強而迅速增加；之后隨著PAR的持續(xù)增強，各處理植株P(guān)n增長變緩，逐漸接近最大凈光合速率Pmax；而當PAR≥1 000 μmol/(m2·s)時，Pn則緩慢下降。在同一PAR下，隨著鎘水平的提高，Pn呈下降趨勢，且始終表現(xiàn)為CK>T1>T2>T3>T4。

圖1 鎘脅迫對巨桉幼樹光合-光響應曲線的影響Fig.1 Effect of cadmium stress on photosynthetic-light response of E. grandis sapling

由表3可見，隨著鎘處理水平的提高，巨桉幼樹葉片的Pmax呈下降趨勢，各處理均顯著低于CK(P<0.05)，T3與T4處理之間差異不顯著(P>0.05)。AQY、LSP和Rd也隨著鎘脅迫加重而逐漸降低，并從T2開始顯著低于CK(P<0.05)。LCP則隨著鎘脅迫加重逐漸升高，并從T3處理開始顯著高于CK(P<0.05)。該結(jié)果表明，在鎘脅迫下，巨桉幼樹光合機構(gòu)遭受到一定程度的破壞，使得有機物合成、光轉(zhuǎn)化效率、弱光利用能力均有不同程度的下降。

表3 鎘脅迫對巨桉幼樹光響應曲線特征參數(shù)的影響Table 3 Effects of cadmium stress on characteristic parameters of photosynthetic light response of E. grandis saplings

2.4 鎘脅迫對巨桉幼樹葉綠素熒光參數(shù)的影響

由表4可知，巨桉幼樹葉片F(xiàn)0、Fm和Fv/Fm均隨著鎘處理水平提高而逐漸降低，F(xiàn)v/F0隨著鎘處理水平提高先升高后降低，但均僅在T4處理下與CK達到差異顯著水平(P<0.05)，分別較CK下降23.7%，33.0%，10.2%和6.7%；ΦPSⅡ在T2～T4處理下顯著低于CK(P<0.05)，ETR則表現(xiàn)為所有鎘處理均顯著低于CK(P<0.05)，而qP和NPQ在各處理間無顯著變化(P>0.05)。這表明，過量的鎘導致巨桉幼樹葉片PSⅡ受損，并出現(xiàn)明顯的光抑制現(xiàn)象。

表4 鎘脅迫對巨桉幼樹熒光參數(shù)的影響Table 4 Effects of cadmium stress on fluorescence parameters of E. grandis saplings

2.5 鎘脅迫對巨桉幼樹吸收光能分配的影響

巨桉幼樹葉片對吸收光能分配的耗散情況如表5所示。由表5可知，對照(CK)巨桉幼樹將吸收光能的66.2%用于天線熱耗散(D)，6.1%用于光化學反應耗散(P)，29.8%用于非光化學反應耗散(Ex)。隨著鎘處理水平的提高，用于天線熱耗散的光能比例逐漸減小，在T4處理時與CK差異達到顯著水平(P<0.05)，降幅為3.9%；用于光化學反應耗散的比例也逐漸下降，且其對鎘脅迫的反應更敏感，從T2處理時就有顯著下降(P<0.05)；而用于非光化學反應耗散的比例逐漸增加，在T4處理時與CK差異達到顯著水平(P<0.05)，增幅為12.1%。該結(jié)果表明，隨著鎘脅迫的加重，巨桉葉片光合保護和清除功能逐漸減弱，過剩光能增加。

表5 鎘脅迫對巨桉幼樹葉片吸收光能分配的影響Table 5 Effect of cadmium stress on distribution pattern of absorbed light in leaves of E. grandis saplings %

3 討 論

3.1 鎘脅迫對巨桉幼樹光合色素含量的影響

葉綠素含量是衡量植物光合作用的重要指標，在光合作用中發(fā)揮著吸收、傳遞及轉(zhuǎn)化光能的作用，可在一定程度上反映植物的光合作用水平[23]。本研究中，巨桉葉片Chl a、Chl b含量隨鎘水平升高呈下降趨勢，這與賴秋羽等[24]的研究結(jié)果相似。鎘脅迫造成巨桉幼樹葉綠素含量減少，可能是因為鎘與葉綠體蛋白上的巰基結(jié)合破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)[25]，也有可能是鎘與葉綠素的某些酶，如膽色素原脫氨酶結(jié)合，造成酶失活，導致葉綠素合成受阻[26]，還有可能是鎘脅迫造成內(nèi)囊體數(shù)量減少所致[27]。Car是葉綠體光合天線的輔助色素，能吸收過剩光能，以保護葉綠素和光合機能[28]。本研究中，巨桉幼樹葉片Car含量隨鎘水平升高顯著降低，佐證了葉綠素和光合機能受損的推斷，因而其光合效率降低。Chl a/b值反映了葉綠體中類囊體的垛疊程度[29]，逆境脅迫下植物Chl a/b值變化越小，表明其對逆境的適應性越強[30]。本研究中，巨桉幼樹葉片Chl a/b在鎘處理水平≥25 mg/kg時較對照明顯降低，可能是鎘水平過高時誘發(fā)的活性氧引起了葉綠素的破壞，致使葉綠素含量下降，同時Chl a/b也有所降低，但與對照差異不顯著，表明巨桉對鎘有一定的耐受能力，這與張明生等[31]的研究結(jié)果相似。

3.2 鎘脅迫對巨桉幼樹光合特性和光合-光響應特征的影響

植物受到脅迫時，其Pn降低的主要原因有氣孔限制因素和非氣孔限制因素[32]，而判斷依據(jù)是Ci和Gs2個指標值的變化方向。本研究中，隨著鎘脅迫程度的加重，Pn逐漸降低，Ci增加，表明鎘脅迫環(huán)境中，限制巨桉幼樹光合速率的主要原因是非氣孔限制因素，這與107楊(Populus×euramericanacv‘74/76’)在鎘脅迫條件下的響應特征相似[33]。Ci增加的原因可能是在鎘脅迫下，巨桉幼樹葉片光合器官受損，色素合成受到抑制，進而影響碳固定，從而造成Ci積累。高會玲等[34]的研究也得到了類似的結(jié)果。

植物對光的利用效率是其生長發(fā)育的重要指標。光補償點LCP和光飽和點LSP分別反映植物對弱光和強光的適應能力，表觀量子效率AQY則體現(xiàn)植物對光的利用能力[35]。本研究顯示，鎘脅迫下巨桉幼樹葉片的AQY和LSP降低，LCP升高，這與張仁和等[36]的研究結(jié)果相似，表明鎘脅迫抑制了巨桉幼樹對光能的轉(zhuǎn)換效率，導致光合速率下降。LSP降低和LCP升高也說明，在高水平鎘脅迫下巨桉幼樹葉片固定CO2的能力有所降低。

從4個光合特性參數(shù)的變化趨勢可以看出，在T1處理時，巨桉幼樹的Pn、GS、Tr和Ci均與CK差異不顯著。從光合-光響應特征參數(shù)的變化趨勢也可以看出，除Pmax外，其他特征參數(shù)(AQY、LSP、LCP、Rd)在T1處理時均與CK差異不顯著，說明低水平鎘脅迫對巨桉幼樹光合生理特性影響不顯著，巨桉的生長也未受到明顯抑制。而在重度鎘脅迫(T3、T4)時，各參數(shù)均與CK差異顯著，表明受脅迫巨桉的生長受到明顯抑制，這與萬晉麟等[32]對辣椒(CapsicumannuumL.)的研究結(jié)果相似。

3.3 鎘脅迫對巨桉幼樹葉綠素熒光參數(shù)的影響

由于常溫下葉綠素熒光主要來源于光系統(tǒng)Ⅱ的葉綠素a，而光系統(tǒng)Ⅱ處于整個光合作用的最上游，因此包括光反應和暗反應在內(nèi)的多數(shù)光合過程的變化，都會反饋給光系統(tǒng)Ⅱ，進而引起葉綠素a熒光的變化，幾乎所有光合作用過程的變化都可以通過葉綠素熒光反映出來[37]。因此葉綠素熒光參數(shù)的變化可以反映出植物光合機構(gòu)在重金屬脅迫下所表現(xiàn)的適應性[38]。本研究中，在鎘脅迫程度最重(T4)時，巨桉幼樹葉片光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、PSⅡ潛在活性(Fv/F0)值減小，說明鎘脅迫導致巨桉幼樹葉片PSⅡ潛在活性中心受損，從而使原初光能捕獲效率降低，這可能是由于葉綠體超微結(jié)構(gòu)的改變所致[39]；PSⅡ?qū)嶋H光化學量子產(chǎn)量(ΦPSⅡ)的下降則表明植物的光合磷酸化受阻，也可能與鎘引起的葉綠體膜系統(tǒng)紊亂有關(guān)[40]；電子傳遞效率ETR反映了實際光強條件下的表觀電子傳遞效率，其數(shù)值降低表明光合電子傳遞受到抑制，進而導致ΦPSⅡ的下降。光化學淬滅系數(shù)qP反映PSⅡ反應中心的開放程度，非光化學淬滅系數(shù)NPQ是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分，反映了光系統(tǒng)對過剩光能的耗散能力[41]。本研究表明，鎘脅迫處理巨桉幼樹葉片的qP和NPQ與對照均無顯著差異，NPQ無顯著變化可能與此時鎘脅迫使巨桉幼樹熱耗散機制受到損壞、PSⅡ原初光化學反應也受到了鎘的傷害有關(guān)，這與前人研究的鎘脅迫對黃瓜(Cucumissativus)[42]、龍葵(Solanumnigrum)[43]和滇苦菜(Picrisdivaricata)[44]的影響結(jié)果類似。

3.4 鎘脅迫對巨桉幼樹吸收光能分配的影響

在逆境條件下，植株為減輕過剩光能對葉片光合機構(gòu)造成的損傷，會主動降低對光能的吸收，通過多種光能耗散機制調(diào)節(jié)光能的轉(zhuǎn)換和分配[45]。植物葉片吸收的光能分為3部分，即天線熱耗散的能量(D)、光化學反應的能量(P)、反應中心由非光化學反應耗散的能量(Ex)[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫會使巨桉幼樹PSⅡ葉綠素熒光能量分配發(fā)生改變，導致Ex比例增加而引起P和D比例降低，造成植物光合機構(gòu)的可逆失活甚至破壞。D的變化與天線色素變化有關(guān)[47]，而天線色素主要由Chl a、Chl b和Car組成，Chl a、Chl b含量的減少導致D降低；Ex是吸收光能中通過光呼吸、Mehler反應等非光化學反應進行耗散或?qū)㈦娮觽鬟f給氧而使其形成單線態(tài)氧的部分，Ex的上升反映過剩光能對光合結(jié)構(gòu)的破壞程度加重。

4 結(jié) 論

鎘脅迫導致巨桉幼樹光合色素含量及光合特性和光合-光響應特征中的大多數(shù)指標或參數(shù)明顯下降，光合電子傳遞活性減弱，造成兩個光系統(tǒng)之間激發(fā)能分配不平衡、光化學效率降低、CO2同化能力下降；同時在光能分配受到影響后，引起PSⅡ反應中心的光能轉(zhuǎn)化效率降低，導致巨桉幼樹葉片光合效率下降，因此應當盡量避免在鎘污染嚴重地區(qū)發(fā)展巨桉人工林，也不宜選擇巨桉作為鎘富集植物用于鎘污染區(qū)的生態(tài)修復。但在鎘污染程度較輕的地區(qū)，如土壤中鎘含量在12.5 mg/kg以下時，種植巨桉還是可行的。