護肝布祖熱顆粒對酒精誘導小鼠急性肝損傷的保護作用和作用機制

徐皓月，張珂，高旭杰，郭雪麗，徐修軍，李國玉，王航宇，王金輝,2*

(1 石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,新疆 石河子 832002;2 哈爾濱醫(yī)科大學藥學院,黑龍江 哈爾濱 150081)

酒精性急性肝損傷(Acute alcoholic liver injury)是一種因乙醇代謝產(chǎn)生乙醛進而對肝細胞產(chǎn)生損害，引發(fā)肝細胞出現(xiàn)氧化應激，炎癥以及細胞凋亡反應的疾病，該疾病在發(fā)病后期容易引發(fā)酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化以及肝癌[1]。在目前酒文化盛行的社會中，酒精性急性肝損傷的發(fā)病率一直居高不下，所以開發(fā)可減輕酒精對肝細胞的損害的藥物變得十分重要。

絕大部分乙醇進入人體后在上消化道被吸收進入體內(nèi)循環(huán)并主要在肝臟中進行代謝[2]，在肝臟中乙醇可直接進入細胞中通過多種反應系統(tǒng)代謝成水和二氧化碳[3-4]，但在其代謝過程中產(chǎn)生的乙醛會對肝臟的功能以及細胞生理結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。乙醛可進入肝細胞內(nèi)對細胞的代謝功能產(chǎn)生影響，使得肝臟中的脂質(zhì)代謝出現(xiàn)障礙，促進脂肪酸的合成，抑制脂蛋白的表達，使大量脂肪堆積在肝組織內(nèi)，導致脂肪性肝炎的發(fā)生[5]，因其破壞了細胞的線粒體，使細胞產(chǎn)生大量的活性氧，破壞細胞內(nèi)的氧化/抗氧化平衡，引發(fā)機體的氧化應激進而激發(fā)炎癥反應[6]，并使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程出現(xiàn)錯誤，使細胞器出現(xiàn)損傷進而導致細胞凋亡，從而加重肝損傷[7]。在乙醛刺激肝細胞產(chǎn)生炎癥反應后，不僅被激活的免疫炎性細胞分泌大量細胞因子對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，促進細胞發(fā)生凋亡，進而損傷肝功能[8]，還會促使細胞產(chǎn)生大量膠原，使酒精性脂肪肝和酒精性肝炎的發(fā)病率上升[9]，長期會導致肝纖維化和肝癌的發(fā)生[10]。

護肝布祖熱顆粒是民族藥中的一種復方，該復方由茴香根皮、芹菜籽、芹菜根、菊苣子、菊苣根、菟絲子以及小茴香組成，有著補益肝，胃，利肝，利膽的功效。有研究表明，護肝布祖熱顆粒對脂肪肝患者有著較好的治療作用[11]，并且其對四氯化碳引發(fā)的肝損傷有著抑制細胞凋亡、減輕肝細胞損傷的作用[12]。

本研究對護肝布祖熱顆粒對酒精導致的急性肝損傷保護作用機制進行了一定的研究，為護肝布祖熱顆粒后續(xù)的藥物開發(fā)提供了一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇6-8周齡雄性昆明小鼠共72只，體重18～22 g。購自新疆醫(yī)科大學，合格證號：SCXK(新)2019-0001。小鼠適應環(huán)境后，在實驗周期內(nèi)正常喂養(yǎng)。實驗動物飼養(yǎng)于新疆石河子大學動物實驗室，室溫22 ℃±2 ℃，每天保持2 h空氣暢通。實驗由石河子大學倫理委員會批準，動物福利和實驗程序符合石河子大學實驗動物護理和使用條例。

1.2 實驗儀器

JBA2002分析天平(上海浦春計量儀器有限公司)，Therrno 3001全自動多功能酶標儀(Thermo公司)，Axio Imager A蔡司正置熒光顯微鏡(北京冠普佳科技有限公司)，DYCZ-40D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，DYCZ-24DN型制膠器(北京六一生物科技有限公司)

1.3 實驗試劑

護肝布祖熱顆粒(批號：140334)：新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司；復方益肝靈片(批號：20051201)：吉林博維藥業(yè)有限公司；AST檢測(批號：20200323)：南京建成；ALT檢測(批號：C009-2-1)：南京建成；SOD檢測(批號：A001-1)：南京建成；MDA檢測(批號：A003-1)：南京建成；總膽紅素檢測(批號：C019-1)：南京建成；Bax(批號：BA0315)：武漢博士德公司；Bcl-2(批號：BA0412)：武漢博士德公司；NF-κB p65 Antibody(批號：#8242)：Cell Signaling technology；p-IκB α(批號：9246S)：Cell Signaling technology；β-actin Antibody：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白：北京索萊寶科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥

將72只昆明小鼠隨機均分為6組，分別為：空白組，模型組，護肝布祖熱顆粒低、中、高劑量組(1.25、2.5、5.0 g·kg-1)和陽性藥復方益肝靈組(0.2 g·kg-1)。使用生理鹽水溶解護肝布祖熱顆粒并配制成不同濃度，對每組小鼠灌胃給予治療藥物，對于空白組給與生理鹽水灌胃處理，持續(xù)14 d，在給藥第13天時，對除空白組以外的小鼠給予無水乙醇灌胃(12 mL·kg-1)，建立酒精性急性肝損傷模型，空白組小鼠給予等體積的生理鹽水灌胃處理。

1.4.2 樣本收集

在末次給藥12 h后，稱重，麻醉，取小鼠肝組織，生理鹽水洗凈，吸去多余水分，稱重，取左肝外葉組織放入10%甲醛中固定，其余肝組織存放入-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對護肝布祖熱顆?；瘜W成分進行活性篩選，使用CTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選酒精性急性肝損傷相關(guān)靶點，并與護肝布祖熱顆粒相關(guān)靶點進行比較，選出護肝布祖熱顆粒治療酒精性急性肝損傷的潛在靶標基因，通過String數(shù)據(jù)庫篩選出護肝布祖熱顆粒治療酒精性急性肝損傷蛋白的相互作用關(guān)系，并使用Cytoscape 3.8.1軟件，繪制出活性成分-靶點圖以及相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并進行分析。

1.4.4 指標檢測

將左肝外葉放入10%甲醛中固定48 h后對肝組織進行石蠟包埋，切片，進行HE染色，觀察肝組織病理學改變；將肝組織左內(nèi)葉制成10%的組織勻漿液，離心后取上清，進行ALT和AST活性，MDA，SOD以及總膽紅素的含量的檢測。

取肝右前葉，稱取適量組織，提取肝組織內(nèi)蛋白，使用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測肝組織中NF-kb p65，Bax，Bcl-2及p-Ikb ɑ蛋白表達水平，顯色曝光后，用Image軟件檢測蛋白質(zhì)條帶的灰度值，并且將目的條帶與相應的內(nèi)參的灰度值相比后作圖。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件和GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(SD)表示。兩組間采用單因素方差分析確定組間差距，并進行LSD檢驗。P<0.05有統(tǒng)計學意義，P<0.01為有極顯著性差異，P>0.05為無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 護肝布組熱顆粒通過抗炎和抗凋亡調(diào)節(jié)治療酒精性急性肝損傷潛在靶點預測與分析

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選出護肝布祖熱顆粒治療酒精性急性肝損傷的潛在靶標938個，使用String數(shù)據(jù)庫并使用Cytoscape 3.8.1軟件，通過degree值的大小篩選出前50個相關(guān)靶點(圖1)。

黃色：護肝布祖熱顆粒治療酒精性急性肝損傷相關(guān)靶點：藍色：護肝布祖熱顆?；钚猿煞諧AS號；綠色：單味藥材。圖1 護肝布祖熱顆粒治療酒精性急性肝損傷的活性-靶點相互作用網(wǎng)路

分析篩選后發(fā)現(xiàn)其中相關(guān)的炎性靶點AKT1、MAPK1、MAPK14、TLR4、MMP9這5個靶標與護肝布祖熱顆粒治療酒精性急性肝損傷關(guān)系最密切，其主要涉及的通路有TLR4/NF-κB、PI3K-Akt、MAPK、FoxO、Ras信號通路等(圖2)，這些通路主要與細胞內(nèi)的氧化應激，炎癥反應和細胞凋亡活動有關(guān)?？梢娮o肝布祖熱顆?？赏ㄟ^影響細胞的氧化應激反應，降低炎癥反應以及減少細胞凋亡，從而對酒精性急性肝損傷起到保護作用。

圖2 護肝布祖熱顆粒治療酒精性急性肝損傷的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)路

2.2 護肝布祖熱對酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響

對各組小鼠的肝組織進行稱重，并計算小鼠的肝臟系數(shù)=肝重量(mg)/ 體重(g)。對各組的肝臟系數(shù)進行統(tǒng)計后，從圖3可看出，在給予大量乙醇灌胃建立急性肝損傷模型后，模型組小鼠的肝臟指數(shù)相比于空白組出現(xiàn)明顯的上升(P<0.01)，在給予護肝布祖熱顆粒治療后，各治療組的小鼠肝臟系數(shù)相較于模型組均出現(xiàn)下降，呈現(xiàn)出劑量依賴性，其中高劑量治療組小鼠肝臟系數(shù)下降最為明顯(P<0.01)。此結(jié)果說明，護肝布祖熱顆?？蓽p輕酒精性肝損傷中肝細胞的水腫。

##P<0.01表示與模型組比較。*P<0.05表示與模型組比較。**P<0.01表示與模型組比較。圖3 護肝布祖熱顆粒對小鼠肝臟系數(shù)的影響

2.3 護肝布祖熱顆粒對小鼠肝組織損傷程度的影響

為了進一步探討護肝布祖熱顆粒對急性肝損傷小鼠肝組織的影響，對小鼠肝組織的病理學指標進行檢測，首先通過HE染色觀察肝臟組織中炎性細胞浸潤的情況以及肝細胞的損傷狀況。從HE染色的結(jié)果可以看出：與空白組相比，模型組肝細胞出現(xiàn)部分腫脹，空泡型變性以及部分壞死，且網(wǎng)狀支架坍塌，肝細胞索排列紊亂。而經(jīng)過護肝布祖熱顆粒給藥治療后，肝細胞空泡減少，細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改善，肝細胞索排列恢復，呈現(xiàn)放射狀。其中高劑量護肝布祖熱顆粒治療組變化最為明顯。表明護肝布祖熱顆?？蓽p少酒精性急性肝損傷中肝細胞的空泡性，減輕脂肪沉積，抑制肝細胞凋亡(圖4)。

A：空白對照；B：模型；C：低劑量治療組；D：中劑量治療組；E：高劑量治療組；F：陽性藥組圖4 HE染色(400×)

2.4 護肝布祖熱顆粒對小鼠肝功能的影響

肝組織檢測結(jié)果如圖5所示，與空白組小鼠相比模型組小鼠肝組織中的ALT、AST活性均出現(xiàn)明顯增加，且總膽紅素含量增加(P<0.01)，在給予不同劑量的護肝布祖熱顆粒后，ALT、AST以及總膽紅素的含量相較于模型組均出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。結(jié)果表明，護肝布祖熱顆?？蓽p輕酒精性急性肝損傷造成的肝功能損傷。

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比*P<0.05；與模型組相比**P<0.01圖5 護肝布祖熱顆粒對急性肝損傷小鼠肝組織中ALT，AST以及總膽紅素的影響

2.5 護肝布祖熱顆粒對小鼠肝臟抗氧化能力的影響

為了研究護肝布祖熱顆粒對小鼠抗氧化能力影響，對小鼠的肝臟進行了SOD，MDA含量的檢測。結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織中的SOD活力相較于空白組顯著下降，與之相反MDA含量顯著上升(P<0.05)。而在給予護肝布祖熱顆粒治療后，和模型組相比治療組的SOD值隨著給藥劑量的增加呈劑量依賴性增加，并有顯著性差異(P<0.01)，而MDA含量則隨著給藥劑量的增加而出現(xiàn)明顯的下降(P<0.05)。此結(jié)果表明，護肝布祖熱顆?？捎绊懢凭约毙愿螕p傷的氧化/抗氧化平衡(圖6)。

與空白組相比##P<0.01；與模型組相比*P<0.05；與模型組相比**P<0.01圖6 護肝布祖熱顆粒對急性肝損傷小鼠肝組織中SOD和MDA含量的影響

2.6 Western blot 實驗結(jié)果

依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學的結(jié)果，使用Western blot方法對炎性通路和凋亡通路相關(guān)蛋白NF-кB p65，p-IκB ɑ，Bcl-2，Bax蛋白表達含量進行檢測。

結(jié)果如圖7所示，相比于空白組，模型組的NF-кB p65，p-IκB ɑ以及Bax蛋白水平出現(xiàn)明顯升高，而Bcl-2蛋白表達下降，在護肝布祖熱低、中、高各劑量組中NF-кB p65，p-IκB ɑ以及Bax蛋白表達水平出現(xiàn)明顯下降，Bcl-2蛋白含量上升。結(jié)果表明，護肝布祖熱顆粒通過減輕細胞炎癥，抑制細胞凋亡從而對酒精性急性肝損傷起到一定的保護作用。

與空白組相比#P<0.05；與空白組相比##P<0.01；與模型組相比*P<0.05；與模型組相比**P<0.01圖7 護肝布祖熱顆粒對急性肝損傷小鼠肝組織中NF-кB p65，p-IκB ɑ，Bcl-2，Bax蛋白表達含量的影響

3 討論

酒精性急性肝損傷是一種酒精進入人體后對肝臟產(chǎn)生損害的疾病，其因乙醇進入肝臟后破壞了肝細胞中線粒體的功能，影響了肝臟代謝過程[13]，進而激活肝臟內(nèi)巨噬細胞并釋放炎性因子，促進機體的炎癥反應；刺激細胞線粒體激發(fā)氧化應激反應并且促使細胞凋亡。灌胃給藥法建立酒精性急性肝損傷模型穩(wěn)定性好，可重復性高，更接近人類飲酒模式[14]，所以本實驗采用這種方法建立肝損傷模型并對護肝布祖熱顆粒影響酒精性急性肝損傷的機制進行研究。

本研究探討了護肝布祖熱顆粒對酒精性急性肝損傷的肝功能的影響，測定了肝組織中ALT，AST以及總膽紅素的含量。AST，ALT以及總膽紅素是最常用的用于肝功能檢測的指標[15]，其在肝細胞中有大量分布，并且因乙醇對肝細胞通透性造成影響而進入血液循環(huán)，所以一般對血液中的AST，ALT以及總膽紅素含量進行測定以反映肝功能損傷程度。實驗結(jié)果顯示，護肝布祖熱顆?？擅黠@降低酒精性肝損傷中的ALT，AST以及總膽紅素的含量，表明護肝布祖熱可對酒精性急性肝損傷導致的肝功能下降起到抑制作用。為了更好的判斷護肝布祖熱顆粒對于急性肝損傷的治療效果，使用HE染色的方法觀察肝組織的病理學變化，結(jié)果顯示，護肝布祖熱顆?？擅黠@減輕肝臟細胞空泡性，減少壞死的肝細胞數(shù)量以及修復肝細胞的結(jié)構(gòu)。本研究對肝組織內(nèi)的SOD，MDA含量進行檢測，進一步研究護肝布祖熱顆粒對急性肝損傷中氧化應激反應的影響。因乙醇進入肝細胞影響肝細胞的代謝，從而產(chǎn)生了大量的活性氧(ROS)，大量的ROS會破壞細胞的生理狀態(tài)，并導致細胞凋亡。機體為了應對大量的ROS分泌激發(fā)了體內(nèi)的抗氧化酶以抑制因過量的活性氧而引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應[16]。MDA一般作為細胞氧化損傷程度指標，其主要由ROS引發(fā)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的，其與SOD的比值一般被用于判斷機體內(nèi)的氧化/抗氧化平衡[17]。本研究中結(jié)果顯示，護肝布祖熱顆?？赏ㄟ^促進抗氧化酶SOD活力上升，抑制MDA的含量調(diào)節(jié)氧化/抗氧化平衡，減輕酒精性急性肝損傷中的細胞氧化應激反應。

本研究為了進一步探討護肝布祖熱顆粒保護酒精性急性肝損傷的機制，使用網(wǎng)絡(luò)藥理學對相關(guān)的潛在靶點進行了分析，發(fā)現(xiàn)肝布祖熱顆粒保護酒精性急性肝損傷的機制與減輕細胞炎癥，抑制細胞凋亡通路有關(guān)，因此，我們根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學實驗結(jié)果使用Western blot方法重點對MAPK通路進行研究。MAPK通路主要有ERK，JNK，P38 3條途徑，影響了細胞的炎癥，分化以及增值。一方面，炎癥反應是肝損傷的重要反應之一，MAPK通路中的P38途徑可通過影響巨噬細胞的活化，影響NFκB p65蛋白以及IκB ɑ的磷酸化，從而對細胞炎癥產(chǎn)生影響，且NFκB p65的激活進一步影響巨噬細胞分泌細胞因子，加重炎癥反應，激活MAPK通路中的P38途徑。NF-κB p65主要參與炎癥和免疫反應的調(diào)節(jié)，未激活的NF-κB p65主要存在于細胞的細胞質(zhì)中，未被激活的NF-κB p65一般與NF-κB p65抑制劑(IκB)結(jié)合形成二聚體，主要通過NF-κB p65與其抑制劑(IκB)結(jié)合成的二聚體與IκB激酶結(jié)合所產(chǎn)生的生理信號激活[18]。當信號通路被激活時，IκB磷酸化，NF-κB p65進入細胞核并與DNA結(jié)合，促進多種信號分子的轉(zhuǎn)錄[19]，在NF-κB p65被激活后，促進巨噬細胞等炎性細胞加速分泌炎性細胞因子，進一步的加重機體的炎癥反應。因此，我們通過對NF-κB p65以及p-IκB ɑ蛋白的表達水平進行測定，從而探究護肝布祖熱顆粒對下游的炎癥通路的影響。另一方面，細胞炎癥反應也可影響細胞凋亡通路。MAPK通路中的JNK途徑可對細胞凋亡進行調(diào)節(jié)，其抑制細胞凋亡通路的上游蛋白Bcl-2的表達[20]，促進凋亡蛋白Bad，Bax的表達。Bcl-2和Bax蛋白是細胞凋亡通路重要的調(diào)控蛋白，兩者通過線粒體途徑參與細胞凋亡調(diào)節(jié)。Bax蛋白可通過影響細胞凋亡的線粒體途徑，使下游的細胞凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3激活，進而促使細胞凋亡。而Bcl-2蛋白可與Bax蛋白形結(jié)合形成二聚體，并通過影響細胞內(nèi)Ca2+的流動抑制Caspase-3的表達，從而抑制細胞凋亡。因此我們通過對Bcl-2以及其抑制蛋白Bax的表達水平進行測定，從而探究護肝布祖熱顆粒對下游的凋亡通路的影響。本實驗結(jié)果說明護肝布祖熱顆?？赏ㄟ^抑制NF-κB p65蛋白以及p-IκB ɑ蛋白的表達降低細胞炎癥反應以及促進Bcl-2蛋白的表達，抑制Bax蛋白，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的比例，進而減輕肝細胞的凋亡對酒精性急性肝損傷起到保護作用。

綜上所述，護肝布祖熱顆粒通過減輕細胞的炎癥反應，減少細胞凋亡從而對酒精導致的肝臟損傷起到保護作用，但更詳細的機制研究方面有待進一步深入研究。