一種改良后的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型建立及鑒定

張磊，韓延峰，戴朝，李陽，胡玉奇，陳富雷，趙冬*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 石河子 832000；2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十師疾病預(yù)防控制中心，新疆 北屯 836000；3 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十師北屯醫(yī)院,新疆 北屯 836000)

原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞已經(jīng)成為科研人員研究神經(jīng)科學(xué)的必備實(shí)驗(yàn)工具[1-2]，被廣泛應(yīng)用到神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥物作用的研究機(jī)制中[3]。然而，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[4]雖然國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的培養(yǎng)神經(jīng)元的模型很多，方法也漸進(jìn)成熟，但是大多還是采用胰酶消化皮層組織。神經(jīng)元與其它細(xì)胞相比，培養(yǎng)技術(shù)要求更高，實(shí)驗(yàn)過程操作更為繁瑣，神經(jīng)元嬌嫩脆弱易受多重因素影響而死亡，現(xiàn)行的方法還存有些許的瑕疵，導(dǎo)致神經(jīng)元生長(zhǎng)環(huán)境中混有較多的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)細(xì)胞，使得培養(yǎng)板背景模糊，視野不明朗，嚴(yán)重干擾后續(xù)顯微觀察和熒光拍照等實(shí)驗(yàn)的有序進(jìn)行。因此，我們實(shí)驗(yàn)室吸取了前輩們的大量經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)摸索，參考Beaudoin等人[5]、Giordano等人[6]和楊傳豪等人[7]的試驗(yàn)方法，選用新生SD乳鼠皮質(zhì)，在原有方法基礎(chǔ)上將Trypsin替換為Tryple Express和DnaseI混合消化液，將吸管吹打法置換成彈撥分散、手法震蕩的方式，并經(jīng)過提前一次離心后獲得單細(xì)胞懸浮液，發(fā)現(xiàn)改良后獲取的細(xì)胞純度更高(>95%)，存活率更高，背景更干凈，雜質(zhì)及細(xì)胞碎片含量更少，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好，雙極神經(jīng)元形態(tài)典型。此外，改良后的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥物作用的研究提供參考保障。

1 材料與方法

1.1 材料

原代皮質(zhì)神經(jīng)元來源于健康新生24 h內(nèi)出生的SD乳鼠，購自于新疆動(dòng)物中心。多聚賴氨酸(Sangon,ShangHai)，Neurobasal (Gibco,USA),2% B27 (Gibco,USA),Glutamax (Gibco,USA)，青鏈霉素(Hyclong,USA)，10% FBS(Gibco,USA)，NSE(Abcam,USA)，F(xiàn)ITC(Zsbio,BeiJing)，PI(Sigma,USA)，Tryple Express(Gibco,USA) DnaseI(Sigma,USA)LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HBSS緩沖液，PBS緩沖液，常規(guī)顯微解剖器械兩套，解剖顯微鏡，熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73 Japan)。

1.2 方法

1.2.1 六孔板的包被

用雙蒸水將多聚賴氨酸配制成0.1 mg·mL-1，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后加入到六孔板中，以完全覆蓋六孔板為準(zhǔn)，37 ℃溫箱內(nèi)放置6～8 h或4℃過夜，用之前用PBS沖洗2遍，晾干后避光待用。

1.2.2 溶液的配制

皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)液：Neurobasal+2% B27+10% FBS+ 1% Glutamax+青鏈霉素，混勻后4 ℃保存?zhèn)溆?。混合消化?1×Tryple Express+0.2 mg·mL-1DnaseI。

1.2.3 SD乳鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元提取及培養(yǎng)

取24 h內(nèi)出生的健康SD乳鼠6～8只，-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍麻醉15 min后，75%乙醇梯度消毒3遍后用PBS梯度沖洗3遍，在超凈臺(tái)內(nèi)取出乳鼠的端腦，放置在預(yù)冷的HBSS液中(所有操作都在冰板上操作)。在顯微解剖鏡下分離出大腦皮質(zhì)并去除血管和軟腦膜，將剔除干凈的皮層組織放入盛有預(yù)冷的HBSS液中，顯微剪刀快速碎裂成0.5 mm3大小的顆粒后裝入15 mL的離心管中，以1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清后加入5 mL預(yù)冷的HBSS液，同時(shí)加入等體積的1×Tryple Express 5 mL，和1 mL的DnaseI，混勻后放入37 ℃溫箱內(nèi)消化20 min，期間輕搖晃動(dòng)3次。20 min后組織細(xì)胞渾濁呈現(xiàn)為稀薄的米湯狀，用70 μm的細(xì)胞過濾器過濾兩遍，收集濾液后再次以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清后加入適量的神經(jīng)元培養(yǎng)液。用彈撥分散、手法震蕩的方式混勻細(xì)胞后，以4×106的密度種植在預(yù)先用多聚賴氨酸(PLL)包被的六孔板內(nèi)，種植后的第4 h全量換液1次，以后每隔1日1次全量換液(全量換液均為事先配制好的神經(jīng)元培養(yǎng)液)。

1.2.4 免疫熒光鑒定

將培養(yǎng)第7 d生長(zhǎng)狀態(tài)良好的皮層神經(jīng)元從培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)液用PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗3遍后，用0.1% Triton-x100透化皮層神經(jīng)元20 min，用PBS洗3遍，用5%的脫脂牛奶封閉緩沖液30 min，棄去封閉液后加入一抗NSE(1∶100)抗體4 ℃孵育過夜，第2 d用PBS洗3遍后，與FITC偶聯(lián)的二抗孵育2 h，細(xì)胞核用PI染色，抗熒光淬滅劑封閉蓋玻片后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定

按照LDH試劑盒說明書對(duì)LDH釋放量進(jìn)行檢測(cè)，神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，收集六孔板內(nèi)的培養(yǎng)液按說明書上的加樣順序，在酶標(biāo)儀上測(cè)量吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算LDH的漏出率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算均使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P值小于0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞提取方法改良前后收獲細(xì)胞數(shù)量的對(duì)比

在選取分離大腦皮質(zhì)組織總量基本一致的條件下，相比傳統(tǒng)方法(Method 1)改良后的方法(Method 2)能明顯減少神經(jīng)元細(xì)胞受損，從而使皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖1A～D、F)。

2.2 皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)

皮質(zhì)神經(jīng)元接種到六孔板后，大部分神經(jīng)元細(xì)胞迅速沉底，約15 min左右，幾乎所有神經(jīng)元已沉底但貼壁不牢。接種4 h后顯微鏡下可見神經(jīng)元均勻地生長(zhǎng)在六孔板中，神經(jīng)元體積較小，少數(shù)神經(jīng)元突起變長(zhǎng)；第1 d后，胞體變大呈圓形，大部分細(xì)胞顯示出了典型的雙極神經(jīng)元形態(tài)，1個(gè)細(xì)長(zhǎng)的軸突和1個(gè)短粗的樹突；第3 d，神經(jīng)元形態(tài)基本成熟，變成了梭形或錐形，體積明顯增大，突起變長(zhǎng)逐漸彎曲，彼此相互連接交織成復(fù)雜的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)；第5 d時(shí)，神經(jīng)元飽滿透亮，立體感增強(qiáng)，突起交聯(lián)充分，形成更大且更復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)縱橫交錯(cuò)促使胞體緊密聚攏，可以看到部分神經(jīng)元緊密抱團(tuán)的現(xiàn)象。第6、7 d細(xì)胞狀態(tài)更加成熟，形態(tài)變化不明顯，可用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)(圖1A～D、F)。而采用原方法培養(yǎng)后觀察：第1 d后，約有半數(shù)細(xì)胞顯示出了神經(jīng)元的形態(tài)，但是典型的雙極形態(tài)特征較為模糊；第3 d,神經(jīng)元形態(tài)變成了梭形或錐形，彼此間相互連接交織形成的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)不夠緊密，還有部分相對(duì)孤立的神經(jīng)元存在；第5 d，神經(jīng)元立體感增強(qiáng)飽滿透亮，形成了較為復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，典型的神經(jīng)元緊密抱團(tuán)現(xiàn)象數(shù)量不多，交聯(lián)不夠充分，縱橫交錯(cuò)緊密聚攏度不夠強(qiáng)烈；第7 d，細(xì)胞形態(tài)略顯成熟，形態(tài)變化不明顯，視野下觀察網(wǎng)絡(luò)交織緊湊茂密充盈度上存有些許間隙。原方法(Method 1)的缺點(diǎn)表現(xiàn)是：接種細(xì)胞的六孔板背景模糊，細(xì)胞周圍環(huán)境中存有過多的碎片雜質(zhì)，細(xì)胞形態(tài)相貌不規(guī)整，整體分布不均一，神經(jīng)元的典型特征不突出(圖1E)。而改良后(Method 2)接種細(xì)胞的六孔板背景干凈透徹，碎片雜質(zhì)少，神經(jīng)元形態(tài)飽滿立體感強(qiáng)，生長(zhǎng)分布均勻，神經(jīng)元典型的雙極形態(tài)特征明顯，還可見到神經(jīng)元抱團(tuán)現(xiàn)象(圖1A～D、F)。

A：第1天；B:第3天；C:第5天；D:第6天 (Method 2)；E:第6天 (Method 1)；F:第7天圖1 原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元在不同培養(yǎng)時(shí)間的形態(tài)學(xué)(× 200)

2.3 皮質(zhì)神經(jīng)元的純度鑒定

采用2種方法獲得皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，用相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)7 d，免疫熒光染色法對(duì)比，結(jié)果顯示：皮層神經(jīng)元的軸突和胞漿經(jīng)NSE染色后發(fā)綠色熒光，細(xì)胞核經(jīng)PI染色后發(fā)紅色熒光，兩種免疫熒光的共存表現(xiàn)皮層神經(jīng)元占所培養(yǎng)總數(shù)的比值，提示Method 2的細(xì)胞純度更高(>95%)(圖2D～F)，而Method 1方法獲得神經(jīng)元細(xì)胞純度明顯不如Method 2(圖2A～C)。而且，用免疫熒光法所拍攝到的圖片，Method 2中神經(jīng)元的典型雙極形態(tài)特征極為逼真，背景也極為干凈(圖2D～F)。

NSE和PI免疫熒光染色顯示皮質(zhì)神經(jīng)元占培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的比例,Method 1 (A、B、C)，Method 2(D、E、F)圖2 NSE雙重免疫熒光染色的典型顯微圖像(×400)

2.4 皮層神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)量和存活率

乳酸脫氫酶(LDH)會(huì)由受損的細(xì)胞中漏出到培養(yǎng)液中[8]，細(xì)胞受損程度與測(cè)得的LDH的值呈正比[9]。因此，我們應(yīng)用LDH活性的比色測(cè)定方法[10]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境下種植7 d后收取培養(yǎng)液測(cè)定LDH漏出率，Method 1與 Method 2相比較，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖3),再次證明Method 2方法培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)量和生存率高。

方法1與方法2對(duì)比*P<0.05圖3 兩種方法測(cè)得乳酸脫氫酶的釋放

3 討論

一只乳鼠的兩個(gè)皮層大約可收集到400萬個(gè)神經(jīng)元，它已成為科研人員研究神經(jīng)科學(xué)的必備實(shí)驗(yàn)工具[11-13]。本實(shí)驗(yàn)采用一種全新改良的神經(jīng)元提取方法，在原有方法基礎(chǔ)上對(duì)組織細(xì)胞分離消化，彈撥分散、手法震蕩，提前一次離心維持神經(jīng)元的活力等步驟進(jìn)行了改進(jìn)，獲得的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞總數(shù)量明顯增多，通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和對(duì)純度的鑒定以及細(xì)胞質(zhì)量和存活率的綜合評(píng)定后發(fā)現(xiàn)，改良后的提取方法能幫我們獲得高收率、高純度、高質(zhì)量、低死亡率、背景干凈的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，為后續(xù)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供了理想的模型工具。

目前，對(duì)原代神經(jīng)元提取的方法主要是采用傳統(tǒng)的含EDTA的 Trypsin對(duì)腦組織進(jìn)行消化處理[14]。獲得的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少，質(zhì)量和純度不高，細(xì)胞存活率相對(duì)較低，背景模糊不清，含有較多的雜質(zhì)和碎片。這些均對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究造成了一定的影響，尤其是需要拍照的免疫熒光和免疫組化的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。另外，Trypsin是一種動(dòng)物源性的消化酶，制造生產(chǎn)的批次規(guī)格不同，穩(wěn)定性很難得到規(guī)整性的統(tǒng)一，而且它還需要特異性的抑制劑使其滅活，這些都對(duì)神經(jīng)元的提取和消化過程中產(chǎn)生影響，對(duì)神經(jīng)元造成損傷，給實(shí)驗(yàn)帶來干擾。改良后我們用Tryple Express代替Trypsin，同時(shí)在其中加入DnaseI酶，Tryple Express是非動(dòng)物源性的重組酶，純度比Trypsin更高，明顯減少了Trypsin提取物中其它酶引起的細(xì)胞損傷，也是Trypsin的最佳替代品[15]。DnaseI酶可以輔助消化纏繞的DNA碎屑，利于神經(jīng)元從團(tuán)塊中分散并由粘稠絮狀鼻涕樣的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄”〉拿诇珷?，方便后續(xù)的過濾和離心。這種混合液也明顯減少了壞死細(xì)胞經(jīng)裂解后釋放出的DNA聯(lián)系的纏繞，增加了皮層組織與混合物的接觸面積，極大地提高了消化速率，終究獲得了損傷較小數(shù)量較多純度較高的神經(jīng)元細(xì)胞。

查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，極少有報(bào)道提取原代皮層神經(jīng)元過程中在組織消化前就進(jìn)行1次離心的操作，而在改良的提取操作中，我們?cè)谙皩?duì)已剪碎成0.5 mm3的皮層組織進(jìn)行了1次離心，目的是清除在剝離剪碎皮層組織流程中存留的細(xì)胞碎片、軟腦膜及滲入到腦組織的血細(xì)胞等雜質(zhì)，進(jìn)而獲得更高純度的皮層組織進(jìn)入下一消化環(huán)節(jié)。另外，改良后我們采用彈撥分散、手法震蕩的方式替代使用吸管吹打的方法。神經(jīng)元的提取培養(yǎng)中吹打和消化是兩個(gè)非常重要的因素，吹打力度因人而異不好掌控，吹打過度細(xì)胞受損嚴(yán)重，活力下降，死亡數(shù)量增多，組織碎片也會(huì)增多導(dǎo)致背景不干凈；吹打不足，因組織團(tuán)塊纏繞緊密，不能很好的解離疏散并被充分的消化，所獲細(xì)胞數(shù)量較少純度也不高，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生過多的干擾性氣泡。而我們利用食指和中指順時(shí)針性的彈撥盛有皮層組織的離心管時(shí)，可以使組織碎液從底部形成漩渦狀的水柱，這種水柱產(chǎn)生的渦旋性的外力柔和而平穩(wěn)能夠充分混勻漿液，對(duì)細(xì)胞的外力損傷明顯降低，氣泡產(chǎn)生的機(jī)會(huì)也得到了緩控，顯著提高了消化效率。經(jīng)過上述步驟的改良，也是我們實(shí)驗(yàn)過程中獲得高數(shù)量和高純度的神經(jīng)元細(xì)胞的重要因素。

當(dāng)然要想培養(yǎng)出理想的神經(jīng)元細(xì)胞，一些細(xì)節(jié)性的問題也是決定成敗的關(guān)鍵。比如我們提前用PLL包被六孔板使神經(jīng)元更好的貼壁，經(jīng)過多次嘗試我們發(fā)現(xiàn)分子量為7～15萬的PLL效果更好；在Neurobasal培養(yǎng)液中加入2% B27可明顯提高神經(jīng)元培養(yǎng)的純度[16]；選擇種植的第4 h作為換液的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)全量換液能夠最大程度的清除壞死細(xì)胞和組織碎片等雜質(zhì)，以后每隔一日一次全量換液并在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)拍照保存；另外大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，種植神經(jīng)元細(xì)胞的密度為≥7×105或≥1×106(6孔板)[17],在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)種植密度為≥4×106較為合適，因?yàn)樯窠?jīng)元在長(zhǎng)出軸突和樹突時(shí)容易抱團(tuán)聚集，密度稍高所形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加密集，這更有利于提供和傳遞神經(jīng)元存活的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和促進(jìn)神經(jīng)元良好的發(fā)育[18-19]，另外Western blot等試驗(yàn)本身對(duì)神經(jīng)元數(shù)量需求就比較多，以上細(xì)節(jié)均值得借鑒。

總之，本實(shí)驗(yàn)在組織細(xì)胞分離消化，彈撥分散、手法震蕩，提前1次離心，多重細(xì)節(jié)方面進(jìn)行了探索與改良，通過對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光鑒定、細(xì)胞數(shù)量、存活率、LDH實(shí)驗(yàn)等獲得了高收率、高純度、高質(zhì)量、低死亡率、背景干凈的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，也為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域提供了理想的模型。