超聲造影評(píng)價(jià)地塞米松治療大鼠腎臟缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究*

孫曉穎，鄺斌，羅志建，李明星

（1.德陽市人民醫(yī)院 超聲科，四川 德陽618000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 超聲科，四川 瀘州646000）

腎臟缺血再灌注損傷是指腎臟在經(jīng)過一段沒有或缺少有效血液循環(huán)的時(shí)間后重新獲得有效的血液循環(huán)，原本能恢復(fù)其正常的結(jié)構(gòu)和功能，但卻出現(xiàn)加重?fù)p傷的反常現(xiàn)象，這在臨床中常發(fā)生，發(fā)生率和病死率逐年增加[1-3]。地塞米松是一種強(qiáng)有效的人工合成的皮質(zhì)類固醇激素，能減輕腎臟缺血再灌注損傷[4-6]。超聲造影是指利用超聲造影劑微泡的強(qiáng)回聲散射來提高超聲對(duì)低速血流探測(cè)的敏感性，可以定量反映組織微循環(huán)的改變[7]。本研究擬用超聲造影監(jiān)測(cè)地塞米松治療大鼠腎臟缺血再灌注損傷，分析不同時(shí)間段內(nèi)及藥物干預(yù)后超聲造影時(shí)間-強(qiáng)度曲線（time-intensity curve, TIC）的各參數(shù)，探討各參數(shù)是否能反映TIC 的變化，以期為后續(xù)腎臟缺血再灌注損傷相關(guān)疾病治療的療效評(píng)估提供一個(gè)簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8 周齡健康雄性SD 大鼠72 只，體重180～220 g（由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、地塞米松組，每組24 只。3 組大鼠分別于再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次各6 只。

1.2 主要試劑及儀器

10%水合氯醛（規(guī)格1 mL∶100 mg，購(gòu)自武漢雙鶴公司），地塞米松（規(guī)格1 mL∶5 mg，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司），注射用六氟化硫微泡（聲諾維）（瑞士Bracco Imaging B.V.公司生產(chǎn)，上海博萊科信誼有限責(zé)任公司分裝，注冊(cè)證號(hào)H20080059，規(guī)格：59 mg 六氟化硫），10%的中性甲醛（購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。西門子ACUSON S3000 超聲診斷儀，配9L4 變頻線陣探頭（德國(guó)西門子公司）；美國(guó)貝克曼庫爾特AU5800 全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的復(fù)制 大鼠雙腎區(qū)剃毛，碘伏消毒，10%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉。假手術(shù)組：術(shù)前1 h 腹腔注射等量的0.9%的生理鹽水，采用2.0 mm 手術(shù)線結(jié)扎大鼠右側(cè)腎蒂后切除右側(cè)腎臟，分離左側(cè)腎蒂但不進(jìn)行鉗夾處理；缺血再灌注組：術(shù)前1 h 腹腔注射等量的0.9%的生理鹽水，切除右側(cè)腎臟，動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，缺血45 min 后松開動(dòng)脈夾進(jìn)行再灌注，恢復(fù)血液供應(yīng)后再將其還納至腹腔并縫合切口；地塞米松組：術(shù)前1 h 腹腔注射地塞米松（4 mg/kg），再按缺血再灌注組處理。

1.3.2 超聲造影檢查 分別于再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)麻醉3 組大鼠，獲取大鼠左側(cè)腎臟最大冠狀切面，進(jìn)入造影模式，設(shè)定相關(guān)參數(shù)：頻率4.0 MHz、深度4 cm、機(jī)械指數(shù)（MI）0.1。經(jīng)大鼠尾靜脈快速注入聲諾維0.4 mL/kg，隨即立刻注射0.2 mL 的生理鹽水沖洗，同時(shí)啟動(dòng)超聲診斷儀內(nèi)置的計(jì)時(shí)器及錄像，同步連續(xù)采集3 min 動(dòng)態(tài)圖像。選擇腎門正對(duì)處最外層的皮質(zhì)作為感興趣區(qū)域（region of interest, ROI），設(shè)置面積為0.05 mm2的橢圓形放置于此，繪制TIC 曲線，觀察和分析TIC曲線中峰值強(qiáng)度（peak intensity, Peak）、達(dá)峰時(shí)間（time to peak, TP）、平均通過時(shí)間（mean transit time,MTT）及曲線下面積（area under the curve, AUC），所有參數(shù)均測(cè)量3 次取平均值。

1.3.3 血肌酐、尿素氮水平檢測(cè) 超聲造影檢查結(jié)束后，真空采血管取大鼠下腔靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液，送西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用貝克曼庫爾特AU5800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐及尿素氮水平。

1.3.4 腎臟病理檢測(cè) 取血結(jié)束后，行脊椎脫臼法處死大鼠，快速取大鼠左腎臟，切取1/2 腎臟組織，石蠟包埋，石蠟切片（厚度4 μm）后HE 染色進(jìn)行病理檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析和單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠腎皮質(zhì)TIC曲線各參數(shù)比較

假手術(shù)組TIC 曲線表現(xiàn)為迅速達(dá)到高峰后又迅速下降至基礎(chǔ)水平，缺血再灌注組與假手術(shù)組相比上升和下降速度均有減慢，其中以下降速度減慢最為明顯，而地塞米松組TIC 曲線上升和下降速度均加快（見圖1）。3 組大鼠的腎皮質(zhì)TIC 曲線各參數(shù)比較，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的Peak、TP、MTT、AUC 有差異（F=5.285、166.015、76.977 和54.733，P=0.003、0.000、0.000 和0.000）；②3 組大鼠的Peak、TP、MTT、AUC 有差異（F=17.422、1 034.731、217.961 和170.200，均P=0.000）；③3 組大鼠的Peak、TP、MTT、AUC 隨再灌注后不同時(shí)間的變化趨勢(shì)有差異（F=3.624、35.752、16.400 和28.800，P=0.004、0.000、0.000 和0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD-t檢驗(yàn)，結(jié)果：缺血再灌注與假手術(shù)組比較，再灌注后1 d、3 d 缺血再灌注組Peak、AUC 均大于假手術(shù)組，TP、MTT 長(zhǎng)于假手術(shù)組（P＜0.05），再灌注后5 d、7 d 缺血再灌注組Peak 值與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），AUC 均大于假手術(shù)組，TP、MTT 長(zhǎng)于假手術(shù)組（P＜0.05）；地塞米松組與缺血再灌注組比較，再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 地塞米松組的TP 短于缺血再灌注組（P＜0.05），再灌注后1 d、3 d、7 d 地塞米松組的MTT短于缺血再灌注組（P＜0.05），再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 地塞米松組的AUC 小于缺血再灌注組（P＜0.05）；缺血再灌注組Peak、TP、MTT、AUC均在再灌注后3 d 達(dá)到最大值，隨后逐漸降低，再灌注后7 d 達(dá)到最低值，但僅4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TP 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），再灌注后5 d、7 d 的Peak、TP、MTT、AUC 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；假手術(shù)組組內(nèi)4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Peak、TP、MTT、AUC 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠腎皮質(zhì)血流灌注TIC曲線

表1 各組大鼠腎皮質(zhì)TIC曲線各參數(shù)比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠腎皮質(zhì)TIC曲線各參數(shù)比較 （n=6，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與缺血再灌注組比較，P ＜0.05；③與缺血再灌注組再灌注后1 d比較，P ＜0.05；④與缺血再灌注組再灌注后3 d比較，P ＜0.05；⑤與缺血再灌注組再灌注后5 d比較，P ＜0.05。

組別假手術(shù)組再灌注后1 d Peak/%48.21±3.53 TP/s 16.38±0.76 MTT/s 35.46±4.42 AUC 2 316.00±325.27缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值55.58±2.36①57.50±7.99 5.284 0.018 30.78±1.25①24.30±0.62②371.554 0.000 106.1±10.87①76.77±13.97②68.250 0.000 8 034.24±1 063.61①5 962.89±711.06②86.570 0.000組別假手術(shù)組再灌注后3 d Peak/%51.73±5.54 TP/s 17.00±1.17 MTT/s 39.21±5.81 AUC 2 758.38±363.37缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值66.07±2.83①③50.87±6.34②16.628 0.000 34.83±0.68①③28.10±1.05②499.362 0.000 154.41±15.89①③102.4±12.90②132.326 0.000 13 593.68±1 616.49①③7 010.22±1 032.60②140.757 0.000組別假手術(shù)組再灌注后5 d Peak/%48.01±2.80 TP/s 16.74±1.35 MTT/s 39.97±5.81 AUC 2 630.95±452.73缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值52.41±6.02 48.27±7.42 1.102 0.358 26.28±0.88①④22.17±0.99②114.574 0.000 76.53±10.84①④64.25±17.36 13.760 0.000 5 499.37±1 053.63①④4 178.10±1 061.06②15.200 0.000組別假手術(shù)組再灌注后7 d Peak/%48.30±4.29 TP/s 16.15±1.01 MTT/s 38.43±6.97 AUC 2 553.12±529.72缺血再灌注組地塞米松組F 值P 值52.50±3.34 49.36±5.32 1.488 0.257 22.67±1.26①⑤20.45±1.19②49.240 0.000 63.58±22.95①45.96±5.18②4.977 0.022 4 471.07±1 411.11①3 120.43±576.76②6.709 0.008

2.2 3組大鼠腎臟病理變化

假手術(shù)組腎小管、腎小球清晰顯示，病理形態(tài)學(xué)未見明顯改變。與假手術(shù)組相比較，缺血再灌注組腎臟均有不同程度的病理損傷，且在再灌注后3 d 時(shí)損傷最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為腎小管管腔擴(kuò)張明顯，部分腎小管輪廓結(jié)構(gòu)消失，刷狀緣脫落，并可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隨后損傷逐漸減輕，在再灌注后7 d 時(shí)明顯減輕。而地塞米松組腎臟損傷均有不同程度的減輕。見圖2。

圖2 3組大鼠腎臟病理變化結(jié)果（HE 染色×200）

2.3 3組大鼠血肌酐、尿素氮水平比較

3 組大鼠血肌酐、尿素氮水平比較，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的血肌酐、尿素氮水平有差異（F=256.337 和152.052，均P=0.000）；②3 組大鼠的血肌酐、尿素氮水平有差異（F=352.433 和213.265，均P=0.000）；③3 組大鼠的血肌酐、尿素氮水平隨再灌注后時(shí)間的變化趨勢(shì)有差異（F=79.108 和46.941，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD-t檢驗(yàn)，結(jié)果：缺血再灌注組再灌注后3 d 的血肌酐、尿素氮水平與再灌注后1 d 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；再灌注后5 d 的血肌酐、尿素氮水平與再灌注后3 d 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；再灌注后7 d 的尿素氮水平與再灌注后5 d 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血肌酐、尿素氮比較 （n=6，±s）

表2 3組大鼠血肌酐、尿素氮比較 （n=6，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與缺血再灌注組比較，P ＜0.05；③與缺血再灌注組再灌注后1 d比較，P ＜0.05；④與缺血再灌注組再灌注后3 d比較，P ＜0.05；⑤與缺血再灌注組再灌注后5 d比較，P ＜0.05。

組別假手術(shù)組再灌注后1 d血肌酐/mol/L 27.60±1.65尿素氮/mmol/L 8.60±0.98再灌注后3 d血肌酐/mol/L 29.92±2.45尿素氮/mmol/L 9.47±1.34再灌注后5 d血肌酐/mol/L 29.10±1.91尿素氮/mmol/L 8.98±1.08再灌注后7 d血肌酐/mol/L 28.48±1.92尿素氮/mmol/L 9.00±1.02缺血再灌注組地塞米松組F 值P值69.33±12.02①41.10±7.83②39.160 0.000 29.11±6.08①14.18±1.28②51.123 0.000 154.28±12.24①③91.53±10.89②253.464 0.000 71.38±12.49①③40.38±5.58②91.304 0.000 52.35±3.75①④37.53±4.60②64.148 0.000 28.30±3.22①④11.08±1.65②141.599 0.000 44.33±6.27①33.75±2.24②24.424 0.000 12.43±1.15①⑤10.13±0.91②17.212 0.000

3 討論

圍手術(shù)期術(shù)中循環(huán)的暫時(shí)中斷會(huì)造成腎臟血流灌注量的減少，再灌注時(shí)不可避免的會(huì)導(dǎo)致腎臟的損傷[8-9]，對(duì)于此，臨床尚無確切有效的治療方法[10-11]。目前腎功能早期變化檢測(cè)方法的檢測(cè)費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)，易受外界因素影響[12]，因此，臨床迫切需要尋找一種有效的腎臟缺血再灌注損傷治療方法和簡(jiǎn)便、無創(chuàng)的腎功能早期變化檢測(cè)手段。既往研究證明地塞米松可減輕腎臟缺血再灌注損傷，但目前關(guān)于利用超聲造影來監(jiān)測(cè)藥物干預(yù)腎臟缺血再灌注損傷療效的研究相對(duì)較少，研究的時(shí)間點(diǎn)也較為局限，TIC 曲線中相關(guān)參數(shù)的參考價(jià)值尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究選擇再灌注后1 d、3 d、5 d、7 d 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，旨在分析不同時(shí)間點(diǎn)及地塞米松干預(yù)后TIC 曲線中的各參數(shù)的變化，以期為后續(xù)腎臟缺血再灌注損傷相關(guān)疾病的療效評(píng)估提供一個(gè)有效的檢測(cè)方法。

超聲造影劑是一種理想的血流示蹤劑，具有良好的聲學(xué)效應(yīng)和穩(wěn)定性，隨呼吸運(yùn)動(dòng)經(jīng)肺排出，不具有腎毒性[13-14]。研究表明，超聲造影可以定量的反映腎臟血流灌注情況，因此被廣泛地應(yīng)用于各種腎臟疾病的診斷中[15-19]。腎皮質(zhì)血流灌注約占整個(gè)腎臟的90%，因此選擇腎皮質(zhì)作為ROI 可以反映整個(gè)血流腎臟的血流灌注情況[20]。本研究中，Peak 在腎臟損傷最嚴(yán)重時(shí)（再灌注后3 d）達(dá)到最大值，而地塞米松組再灌注后1 d、5 d、7 d 的Peak 值與缺血再灌注組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能是Peak 代表峰值濃度，是指所選擇ROI 內(nèi)超聲造影劑達(dá)到最大值時(shí)的強(qiáng)度，代表是瞬時(shí)效應(yīng)，這與LI 等[21]所得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此Peak值不能完全作為反映腎皮質(zhì)血流灌注變化的定量指標(biāo)。缺血再灌注組與假手術(shù)組相比，MTT、TP延長(zhǎng)，AUC 增加。分析其原因：TP 代表達(dá)峰時(shí)間，一定程度上取決于腎皮質(zhì)的血流速度，MTT 代表平均渡越時(shí)間，反映超聲造影劑的灌注速度和廓清速度。腎臟缺血再灌注后白細(xì)胞大量黏附、滯留，可導(dǎo)致微循環(huán)受損，白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，進(jìn)一步增加血管的通透性，引起組織的水腫[22-23]。此外，組織缺血缺氧時(shí)，體內(nèi)循環(huán)血量減少，興奮交感神經(jīng)，導(dǎo)致腎素的分泌增加，活化血管緊張素，使微循環(huán)收縮，外周阻力升高。這些改變導(dǎo)致腎皮質(zhì)血流速度延緩，超聲造影劑灌注速度與廓清速度降低，在TIC 曲線中表現(xiàn)為MTT、TP 的延長(zhǎng)。AUC 反映的是在一定時(shí)間內(nèi)所選取ROI 內(nèi)超聲造影劑的累積效應(yīng)，腎臟缺血再灌注后血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，使大量的炎癥細(xì)胞瘀滯于微血管和間質(zhì)中，瘀滯的炎癥細(xì)胞對(duì)超聲造影劑仍具有一定的吞噬作用，被吞噬了的微泡可以繼續(xù)保留其聲學(xué)活性，形成造影增強(qiáng)的累積效應(yīng)，最終使AUC 增大[24]。

外源性給予地塞米松后，病理分析發(fā)現(xiàn)地塞米松組腎臟組織病理損傷均有不同程度減輕，血肌酐、尿素氮水平降低，也進(jìn)一步說明了地塞米松可以減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。TIC 曲線中相關(guān)參數(shù)也表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)，分析原因可能是外源性給予地塞米松后，減緩了炎癥介質(zhì)的釋放及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)[25]，微循環(huán)阻力降低，腎皮質(zhì)血流灌注速度得到一定程度的改善，超聲造影劑的灌注和廓清速度加快，因此在TIC 曲線中表現(xiàn)為TP、MTT 的縮短。炎癥的抑制使得炎癥細(xì)胞對(duì)超聲造影劑的吞噬量減少，因此一定時(shí)間內(nèi)超聲造影劑累積量減少，在TIC 曲線上表現(xiàn)為AUC 的減小，進(jìn)一步從微循環(huán)的角度證明了地塞米松可以有效地減輕腎臟缺血再灌注損傷。腎臟在缺血再灌注后3 d 損傷最為嚴(yán)重，此期是一個(gè)“危險(xiǎn)期”，度過此期時(shí)腎臟功能可逐漸恢復(fù)，分析TIC 曲線參數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP、MTT 及AUC 與此表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)。但缺血再灌注組再灌注后5 d、7 d 的MTT、AUC 及血肌酐比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，腎功能逐漸恢復(fù)，MTT、AUC 及血肌酐可能并不能敏感地反映出這些微小的變化，因此還需擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)的樣本量來進(jìn)一步說明MTT、AUC 及血肌酐在評(píng)價(jià)腎臟皮質(zhì)微循環(huán)改變的參考價(jià)值。

綜上所述，超聲造影可以定量反映大鼠腎缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)及藥物干預(yù)后腎臟微循環(huán)的改變，其中TP 具有較大參考價(jià)值。但本研究樣本量相對(duì)較少，且分析的ROI 只是一個(gè)二維切面，只能代表腎臟血流灌注的基本情況。下一步將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量、研究時(shí)間點(diǎn)及利用三維立體超聲的檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，以期為臨床監(jiān)測(cè)腎臟缺血再灌注損傷相關(guān)疾病的療效提供一個(gè)簡(jiǎn)便有效的方法。