外源性agomir-133在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)改善心臟病理性重塑中的作用

邢 正，陳雪飛，張玉寒，張靖博，張 靚

（北京師范大學(xué) 體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京 100089）

miR-133 由Chen 等（2006）在《自然》雜志（Nature）上首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)其在成年人心肌和骨骼肌組織中特異性的高表達(dá)，被稱(chēng)為肌源性miRNA（myo-miR）。miR-133在肌肉的增殖分化、細(xì)胞凋亡、血管生成、脂肪組織褐色化等過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，廣泛參與多種疾病的病理生理過(guò)程。有研究提示，miR-133 與心肌肥大、心肌梗死和心衰等多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在人和動(dòng)物模型中均觀(guān)察到病理性心臟重塑以及心肌肥大時(shí)，心肌miR-133 的表達(dá)水平顯著降低。當(dāng)心臟重塑發(fā)展成心力衰竭后，有臨床研究表明心肌中miR-133a 的表達(dá)水平與心衰的嚴(yán)重程度呈反比（Danowski et al.，2013）。miR-133 可通過(guò)抑制其靶蛋白ras 同源物家族成員A（ras homolog family member A，RhoA）、細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，Cdc42）和活化T 細(xì)胞核因子c4（nuclear factor c4 of activated T cells，NFATc4）等表達(dá)，發(fā)揮強(qiáng)大的抑制心肌肥大的作用（Li et al.，2010）。miR-133 還能通過(guò)抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor， CTGF）（Duisters et al.，2009）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail（zinc finger transcription factor snail）（Muraoka et al.，2014）、I型膠原A1（collagen I A1，Col1A1）（Castoldi et al.，2012）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）（Shan et al.，2009）的表達(dá)進(jìn)而抑制心肌纖維化，改善心臟重塑。miR-133 抑制心肌細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的主要機(jī)制。Xu等（2007）研究證實(shí)miR-133 能夠使大鼠H9c2 心室細(xì)胞凋亡基因天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9（Cysteinyl aspartate specific protease-9，Caspase-9）的總蛋白水平降低89%，降低基礎(chǔ)Caspase-9 的活性，阻止了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Caspase-9 活性的增加，并通過(guò)抑制Caspase-9 間接下調(diào)Caspase-3 活性，提高了細(xì)胞活力和生存能力，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效降低心血管疾病的發(fā)病率，減輕疾病癥狀，對(duì)心血管疾病具有良好的預(yù)防和治療作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA 的表達(dá)，發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)。在心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死、糖尿病性心肌病、心衰等心臟疾病中，均發(fā)現(xiàn)有miRNA 參與了運(yùn)動(dòng)的心肌保護(hù)作用（Fernandes et al.，2018；Liu et al.，2015）。

有氧運(yùn)動(dòng)及抗阻運(yùn)動(dòng)均能調(diào)節(jié)miR-133 的表達(dá)。研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可提高循環(huán)中miR-133a 的表達(dá)以及心肌中miR-133b 的表達(dá)（Melo et al.，2014；Ramasamy et al.，2015），而抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)miR-133 前體的表達(dá)有顯著影響（Drummond et al.，2008）。但運(yùn)動(dòng)對(duì)病理性心肌肥大時(shí)內(nèi)源性miR-133 表達(dá)的影響以及miR-133 在運(yùn)動(dòng)改善心臟重塑中發(fā)揮的作用均鮮見(jiàn)報(bào)道。綜上，本研究通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄（abdominal aortic coarctation，AAC）建立大鼠病理性心臟重塑模型，進(jìn)行4 周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)和agomir-133給藥后，觀(guān)察病理性心臟重塑和心肌細(xì)胞凋亡的變化，檢測(cè)心肌和循環(huán)中miR-133 表達(dá)情況，探討miR-133 在運(yùn)動(dòng)改善心臟重塑中的作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

所有的動(dòng)物維持和實(shí)驗(yàn)方案均符合北京師范大學(xué)倫理與動(dòng)物委員會(huì)的要求（批準(zhǔn)號(hào)CLS-EAW-2015-002）。5 周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量190～230 g，共24只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0001。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±5）℃，濕度50%±10%，明暗交替周期為12 h，自由進(jìn)食和飲水。所有動(dòng)物飼料及墊料均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，蘇木素-伊紅染液和天狼星紅染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，agomir-133過(guò) 表 達(dá)試劑（micrON rno-miR-133a-3p agomir，產(chǎn)品編號(hào)miR40000839-4-5）及agomir 陰性對(duì)照（micrON agomir NC#22，產(chǎn)品編號(hào)miR4N0000001-4-5）購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，TUNEL 試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，血漿肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN）濃度測(cè)定酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購(gòu)自R&D（美國(guó)）。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與心臟病理性重塑模型制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（CON 組，n=6）、腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)（abdominal aortic coarctation，AAC）組（AAC 組，n=6）、AAC＋運(yùn)動(dòng)＋agomir-NC 組（A＋E＋NC組，n=6）以及AAC＋運(yùn)動(dòng)＋agomir-133 組（A＋E＋agomir-133 組，n=6）。

心臟病理性重塑模型制備：使用腹主動(dòng)脈縮窄構(gòu)建大鼠心臟病理性重塑模型。5 周齡SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后準(zhǔn)備手術(shù)，術(shù)前禁食12 h，并在手術(shù)前自由飲水。通過(guò)腹腔注射50 mg/kg 的戊巴比妥鈉（Sigma，美國(guó)）進(jìn)行麻醉，然后仰臥位固定。大鼠左腹部備皮，3%碘伏消毒；在左肋弓下緣和腹部中線(xiàn)旁各0.5 cm 處縱向切開(kāi)1.5～2.0 cm，逐層分離皮下組織、進(jìn)入腹腔；在左腎動(dòng)脈上方分離腹主動(dòng)脈，用銀夾造成腹主動(dòng)脈部分狹窄（銀夾內(nèi)徑0.7 mm）；在縫合傷口前，將適量的青霉素（400 000 U/mL）滴入腹腔，然后逐層縫合、關(guān)腹。假手術(shù)組僅打開(kāi)腹腔，分離腹主動(dòng)脈，不用銀夾縮窄，所有其他步驟與手術(shù)組相同。術(shù)后正常飲食，密切觀(guān)察動(dòng)物反應(yīng)。

1.3 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案及agomir-133注射方案

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案：AAC 手術(shù)4 周后，A＋E＋NC 組及A＋E＋agomir-133 組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練。第1 周，大鼠每天以5 m/min 的速度運(yùn)動(dòng)15 min，進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練；第二周開(kāi)始，大鼠以12 m/min 的速度跑步40 min。所有訓(xùn)練均在下午（15∶00—18∶00）進(jìn)行，每周進(jìn)行5 天訓(xùn)練（周一至周五），共進(jìn)行4 周訓(xùn)練。

agomir-133 注射方案：AAC 手術(shù)4 周后，在每周一和周四進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練前1 h 進(jìn)行注射，A＋E＋agomir-133 組大鼠于右后肢腓腸肌多點(diǎn)注射agomir-133，A＋E＋NC 組大鼠在相同部位注射agomir-NC，每只每次注射量均為20 μL，濃度12.5 nmol/mL，共注射4 周。

1.4 超聲心動(dòng)檢測(cè)

大鼠末次運(yùn)動(dòng)24 h 后，進(jìn)行超聲心動(dòng)檢測(cè)，使用VisualSonics Vevo@2100 小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（Fujifilm Visual-Sonics，加拿大）。測(cè)定前，通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，胸部備皮，仰臥位將頭部及四肢固定在木板上，將探頭置于左前胸，與前正中線(xiàn)呈30°左右?jiàn)A角，顯示胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面，探頭順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°可顯示左室短軸切面圖像。于胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面二維測(cè)量左室室壁厚度等，通過(guò)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)探頭90°顯示左心室短軸截面圖像，在胸骨旁左心室縱軸上測(cè)量左心室壁厚度。在二維圖像的引導(dǎo)下，將取樣線(xiàn)置于左室健索水平，取M 型曲線(xiàn)，進(jìn)行心功能測(cè)量。超聲心動(dòng)圖測(cè)量指標(biāo)包括：左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular inner dimension diastolic，LVID；d）、左室舒張末期前壁厚度（left ventricular anterior wall diastolic，LVAW；d）、左室舒張末期后壁厚度（left ventricular posterior wall diastolic，LVPW；d）和左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）。所有測(cè)量數(shù)據(jù)為3 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.5 動(dòng)物取材

動(dòng)物禁食過(guò)夜，自由飲水，腹腔注射50 mg/kg 的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，用于各種生化指標(biāo)的測(cè)定，分離心臟組織和腓腸肌進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。

1.6 心肌病理組織學(xué)觀(guān)察

心肌、腓腸肌組織置于10%的多聚甲醛溶液，然后于20%蔗糖溶液中浸泡過(guò)夜，石蠟包埋，用于石蠟切片，切片厚度為5 μm。用蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色心肌細(xì)胞，切片脫蠟復(fù)水。蘇木素染色15 s，蒸餾水漂洗2 次，再用伊紅染色20 s，蒸餾水漂洗2 次。脫水，透明，封片，觀(guān)察結(jié)果。每組切片隨機(jī)選取5 個(gè)不重復(fù)視野，并使用Image J 1.8.0 軟件分析測(cè)定各視野中平均肌細(xì)胞橫截面積（cross-sectional area）。制備6 μm 的心肌石蠟切片用于膠原纖維的天狼星紅染色，切片脫蠟復(fù)水，天狼星紅染色液滴染1 h，流水稍沖洗，去除切片表面染液，Mayer蘇木素染色液染細(xì)胞核10 min，流水沖洗10 min。脫水，透明，封片，觀(guān)察結(jié)果。

1.7 Tunel檢測(cè)

心肌組織石蠟切片脫蠟至水，滴加Proteinase K 工作液，37 ℃孵育20 min，PBS溶液浸潤(rùn)清洗樣本3×5 min。滴加破膜液，室溫處理20 min，破膜處理完成后PBS 溶液潤(rùn)洗樣本35 min；滴加3%的H2O2（PBS 配制），室溫處理20 min，然后使用PBS 溶液潤(rùn)洗樣本3×5 min；滴加Equilibration Buffer，室溫孵育10 min，而后加入TdT 孵育緩沖液，37 ℃避光孵育1 h，立即用PBS 清洗4×5 min；滴加Streptavidin-HRP 反應(yīng)液，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗3×5 min。DAB 顯色10 min，純水洗滌；蘇木素染液染色15 s，純水洗滌。而后脫水，透明，封片，觀(guān)察結(jié)果。

1.8 ELISA法

腹主動(dòng)脈取血10 mL緩慢注入含有10% EDTA-2Na 100μL、抑酞酶50 μL（500 KIU/mL 血漿）（sigma，美國(guó)）的試管中，混勻后4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，分離血漿，按試劑盒步驟進(jìn)行如下測(cè)定。取出所需96 孔板，每孔加入50 μL 稀釋劑RD1-17；每孔加入50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品，膠條覆蓋，搖床室溫孵育2 h。每孔洗滌4 次，在最后一次洗滌后，去除剩余的洗滌液，晾干，每孔加入GDF-80 200 μL，用新的膠條覆蓋。搖床室溫孵育2 h，每孔洗滌4 次，每孔加200 μL 底物溶液，室溫避光孵育30 min，每孔加50 μL 終止液。在反應(yīng)結(jié)束后15 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值，并計(jì)算血漿中MSTN的濃度。MSTN的ELISA試劑盒靈敏度0.922～5.32 pg/mL，曲線(xiàn)范圍0～2 000 pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)＜1.8%，批間變異系數(shù)＜3.1%。

1.9 Real-time PCR

使用動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取腓腸肌和心肌組織的總RNA，并使用天根FASTKING 一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑（天根生化科技有限公司，北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR 反應(yīng)體系共20 μL：Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）體系（全式金生物技術(shù)有限公司，北京）15 μL、10 mmol/L 的上下游引物各0.5 μL、cDNA 模板5 μL，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。經(jīng)94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，熱循環(huán)40 次，Real-time PCR 于Light Cycler 96 熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）中進(jìn)行，以GAPDH 作為內(nèi)參。所用引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR測(cè)定的基因表達(dá)引物序列Table 1 The Primer Sequence of Target Genes

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用PRISM 9.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），Newman-Keuls 檢驗(yàn)組間差異。檢驗(yàn)置信區(qū)間0.05，P＜0.05 表示差異具有顯著性，P＜0.01 表示差異具有非常顯著性，P＜0.001 表示差異具有極顯著性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)AAC大鼠的心臟病理性重塑的影響

與CON 組相比，AAC 大鼠的心臟質(zhì)量/體質(zhì)量顯著升高（圖1A，P＜0.001），二維超聲心動(dòng)圖（圖1B）及超聲心動(dòng)檢測(cè)數(shù)據(jù)表明AAC 大鼠的LVAW；d、LVPW；d 以及LVID；d均顯著增加（圖1C、D、E，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），LVEF呈降低趨勢(shì)（圖1F）。而運(yùn)動(dòng)后大鼠的心臟質(zhì)量/體質(zhì)量顯著降低（圖1A，P＜0.05）。與AAC 組相比，A＋E＋NC 組大鼠LVAW；d、LVPW；d 以及LVID；d 顯著降低（圖1C、D、E，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），LVEF 出現(xiàn)了升高的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異（圖1F）。提示AAC 導(dǎo)致大鼠心功能有所降低，心肌出現(xiàn)病理性肥大，而跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使心功能和心肌病理性肥大得到改善。

圖1 腹主動(dòng)脈縮窄及跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響Figure 1. Effects of Abdominal Aortic Coarctation and Treadmill Exercise on Cardiac Structure and Function in Rats

HE 染色結(jié)果（圖2A）表明，與CON 組相比，AAC 大鼠心肌細(xì)胞橫截面積顯著增大（圖2B，P＜0.000 1），天狼星紅陽(yáng)性染色（紅色）面積明顯增大（圖2A），心肌纖維化標(biāo)志物I型膠原蛋白（collagen I）（圖2C，P＜0.01）和Ⅲ型膠原蛋白（collagen Ⅲ）（圖2D，P＜0.01）mRNA 的表達(dá)均顯著升高。對(duì)心臟病理性重塑相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與CON 組相比，AAC 大鼠心肌心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）以及MSTN 的mRNA 表達(dá)均顯著升高（圖2E、F、G，均為P＜0.01）。4 周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后大鼠的心肌細(xì)胞橫截面積顯著降低（圖2B，P＜0.001），天狼星紅陽(yáng)性染色面積減?。▓D2A），collagen I（圖2C，P＜0.001）和collagen Ⅲ（圖2D，P＜0.05）的表達(dá)顯著降低，心肌ANP、BNP 和MSTN 的mRNA 表達(dá)顯著下降（圖2E、F、G，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）。以上結(jié)果表明，AAC 大鼠心肌發(fā)生了病理性肥大和纖維化，而跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后心肌病理性肥大和纖維化均得到了明顯改善。

圖2 腹主動(dòng)脈縮窄和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟病理性重塑的影響Figure 2. Effects of Abdominal Aortic Coarctation and Treadmill Exercise on Cardiac Pathological Remodeling

2.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌和血漿中miR-133表達(dá)的影響

與CON 組相比，AAC 大鼠血漿中miR-133 的表達(dá)顯著升高，在4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后其表達(dá)顯著回落（圖3A，P＜0.000 1，P＜0.05）；與此相反的是，在心肌組織中檢測(cè)到AAC 大鼠miR-133 的表達(dá)顯著低于CON 組，而運(yùn)動(dòng)干預(yù)后其表達(dá)又顯著回升（圖3B，均為P＜0.01）。

圖3 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)AAC大鼠血漿和心肌組織miR-133表達(dá)的影響Figure 3. Effect of Treadmill Exercise on the Expression of miR-133 in Plasma and Myocardial Tissue of AAC Rats

2.3 agomir-133給予在運(yùn)動(dòng)改善心肌重塑中的作用

agomir-133 給藥后，與A＋E＋NC 組相比，大鼠心臟質(zhì)量/體質(zhì)量顯著增加（圖4A，P＜0.05），二維超聲心動(dòng)圖像（圖4B）及超聲心動(dòng)結(jié)果表明LVAW；d 和LVPW；d 顯著升高（圖4C、D，P＜0.05，P＜0.01），LVID；d 和LVEF 有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異，提示agomir-133給藥部分抵消了運(yùn)動(dòng)對(duì)病理性心肌重塑的改善作用。

圖4 agomir-133給藥合并跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)AAC大鼠心功能的影響Figure 4. Effects of Agomir-133 Administration Combined with Treadmill Exercise on Cardiac Function in AAC Rats

HE 染色結(jié)果（圖5A）表明，與A＋E＋NC 組相比，A＋E＋agomir-133 組大鼠心肌細(xì)胞橫截面積顯著增大（圖5B，P＜0.05），天狼星紅陽(yáng)性（紅色）染色面積明顯增多（圖5A），提示心肌出現(xiàn)肥大和纖維化，同時(shí)心肌纖維化指標(biāo)collagen I和collagen Ⅲ的表達(dá)顯著升高（圖5C、D，均為P＜0.05），心臟病理性重塑相關(guān)基因BNP、MSTN 的表達(dá)顯著升高（圖5F、G，均為P＜0.05）。以上結(jié)果表明agomir-133 給藥部分抵消了運(yùn)動(dòng)對(duì)病理性心肌重塑的改善作用。

圖5 agomir-133合并跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟病理性重塑的影響Figure 5. Effect of Agomir-133 Combined with Treadmill Exercise on Cardiac Pathological Remodeling

agomir-133 給藥后，與陰性對(duì)照組（A+E+NC 組）相比，血漿中miR-133 的表達(dá)出現(xiàn)升高的趨勢(shì)，但并無(wú)顯著差異（圖6A），而心肌組織中miR-133 的表達(dá)在給藥后出現(xiàn)了顯著的降低（圖6B，P＜0.01）。

圖6 agomir-133合并跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)循環(huán)和心肌miR-133表達(dá)的影響Figure 6. Effects of Agomir-133 Combined with Treadmill Exercise on Endogenous Circulation and Myocardial miR-133 Expression

2.4 miR-133 給藥對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)心肌進(jìn)行TUNEL 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)（圖7A），與CON 組相比，AAC 組大鼠陽(yáng)性染色細(xì)胞核（紫色箭頭）明顯增多，在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后其數(shù)量顯著降低，并在agomir-133 給藥后又出現(xiàn)增多。同樣地，對(duì)心肌組織的凋亡相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與CON 組相比，AAC 組大鼠Bcl2 相關(guān)X 基因（BCL2-associated X，Bax）表達(dá)顯著升高（圖7B，P＜0.01）且B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）顯著降低（圖7C，P＜0.01），Bcl-2/Bax 顯著降低（圖7D，P＜0.01）；與AAC 組相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)使大鼠Bax 表達(dá)顯著降低（圖7B，P＜0.05）；agomir-133 給藥后與陰性對(duì)照組（A+E+NC 組）相比，Bax 顯著升高（圖7B，P＜0.01），Bcl-2 和Bcl-2/Bax 均顯著降低（圖7C、D，P＜0.001，P＜0.05）。提示AAC 導(dǎo)致大鼠發(fā)生了心肌細(xì)胞凋亡，在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后得到改善，而agomir-133 給藥使運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的改善作用消失。

圖7 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、agomir-133合并跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡的影響Figure 7. Effects of Treadmill Exercise Alone and Agomir-133 Combined with Treadmill Exercise on Cardiomyocyte Apoptosis Induced by Abdominal Aortic Coarctation

2.5 agomir-133 合并跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的肌肉萎縮的影響

與CON組相比，AAC大鼠腓腸肌重量顯著降低，并在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后顯著回升，但agomir-133給藥又導(dǎo)致腓腸肌重量顯著降低（圖8A，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）。AAC 導(dǎo)致腓腸肌中MSTN的表達(dá)顯著升高，在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后其表達(dá)顯著降低，并在agomir-133 給藥后顯著升高（圖8B，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。血漿中MSTN 的濃度也表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)（圖8C，均為P＜0.01）。腓腸肌H&E 染色（圖8E）結(jié)果表明，AAC 導(dǎo)致肌細(xì)胞橫截面積顯著減小，運(yùn)動(dòng)干預(yù)又使肌細(xì)胞橫截面積顯著增大，而agomir-133給藥抵消了運(yùn)動(dòng)的改善作用（圖8D，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）。以上結(jié)果提示，AAC 可引起骨骼肌萎縮，運(yùn)動(dòng)后得到顯著改善，而miR-133在肌肉內(nèi)的過(guò)表達(dá)又可導(dǎo)致骨骼肌的萎縮。

圖8 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、agomir-133合并跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的肌肉萎縮的影響Figure 8. Effects of Treadmill Exercise Alone and Agomir-133 Combined Treadmill Exercise on Muscle Atrophy Induced by Abdominal Aortic Coarctation

3 討論

本研究使用AAC 構(gòu)建了大鼠心臟病理性重塑模型，AAC 導(dǎo)致大鼠心臟質(zhì)量/體質(zhì)量增加，左室壁增厚，心肌發(fā)生纖維化，ANP、BNP 以及MSTN 的表達(dá)顯著升高，表明心臟病理性重塑模型成立。AAC 大鼠循環(huán)中miR-133的表達(dá)顯著升高，而心肌中miR-133 的表達(dá)則顯著降低。4 周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)明顯改善了大鼠的心臟病理性重塑，并使循環(huán)中miR-133 的表達(dá)顯著降低而心肌中miR-133 的表達(dá)升高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-133 在運(yùn)動(dòng)改善心肌重塑中的作用，本研究對(duì)AAC 運(yùn)動(dòng)大鼠外源性的補(bǔ)充了agomir-133，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠病理性心肌重塑的改善作用消失，同時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡顯著增加。以上結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)通過(guò)促進(jìn)心肌miR-133 表達(dá)，減少循環(huán)miR-133 水平，產(chǎn)生心臟保護(hù)效應(yīng)，外源性miR-133給予抵消了運(yùn)動(dòng)的保護(hù)作用。

由于miRNA 在細(xì)胞的各個(gè)生命活動(dòng)環(huán)節(jié)均發(fā)揮重要調(diào)控作用，所以近年來(lái)miRNA 備受關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)有數(shù)千種miRNA，它們?cè)跈C(jī)體中的表達(dá)有著明顯的組織特異性（Lagos-Quintana et al.，2002）。miR-133 被證實(shí)在成年人心肌和骨骼肌組織中特異性高表達(dá)，因此被稱(chēng)為肌源性miRNA。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-133 與某些心臟疾病的關(guān)系較為密切。有研究表明在多種因素誘導(dǎo)的病理性心臟重塑時(shí)，心肌中miR-133 的表達(dá)水平顯著降低。在肥大性心肌病患者中，心房和心室肌的miR-133a 表達(dá)下調(diào)。在腹主動(dòng)脈縮窄（Hua et al.，2012）和主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)的心肌肥大小鼠模型（Carè et al.，2007）中，心肌miR-133 的表達(dá)顯著下調(diào)，在血管緊張素II（Castoldi et al.，2012）和高血壓誘導(dǎo)（Duisters et al.，2009）的心肌肥大的模型中，心肌、心臟成纖維細(xì)胞miR-133 的表達(dá)也顯著下降。有臨床研究表明，心肌中miR-133a 的表達(dá)水平與心衰的嚴(yán)重程度呈反比（Danowski et al.，2013）。心肌梗死患者心肌中的miR-133a 表達(dá)顯著降低（Emanuela et al.，2010），在心肌梗死的動(dòng)物模型上同樣觀(guān)察到心肌miR-133 的表達(dá)出現(xiàn)顯著降低（Sun et al.，2020；Zhang et al.，2019）。但血液中miR-133 的表達(dá)變化與心肌中不一致，不論是心衰患者（Ben-Zvi et al.，2020），還是心?；颊撸≒eng et al.，2014），循環(huán)中miR-133 的表達(dá)均顯著升高。與前期研究結(jié)果一致，在本研究中，AAC 誘導(dǎo)的病理性心臟重塑大鼠心肌中miR-133 的表達(dá)顯著降低，而血液中miR-133 的水平則顯著升高。

運(yùn)動(dòng)對(duì)miRNA 的表達(dá)具有顯著的調(diào)節(jié)作用，但與運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的測(cè)定時(shí)間有關(guān)。成年男性馬拉松比賽后血清miR-133a 水平顯著升高（Mooren et al.，2014），健康的成年男性在經(jīng)過(guò)急性耐力運(yùn)動(dòng)后3 h，骨骼肌活檢發(fā)現(xiàn)miR-133a/b 的表達(dá)分別上調(diào)35%和40%（Russell et al.，2013）。Nielsen 等（2010）研究也證實(shí)骨骼肌miR-133a的表達(dá)在60 min 有氧運(yùn)動(dòng)后明顯升高，而經(jīng)過(guò)12 周耐力訓(xùn)練后，骨骼肌miR-133a 的表達(dá)水平在運(yùn)動(dòng)前后未發(fā)生明顯變化。抗阻運(yùn)動(dòng)則上調(diào)了pre-miR-133 的表達(dá)，但成熟miR-133 表達(dá)降低或不變。也有研究報(bào)道了運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌中miR-133 表達(dá)的影響。Palabiyik 等（2019）研究表明8 周的游泳運(yùn)動(dòng)使大鼠心室肌中miR-133的表達(dá)顯著升高；Fathi等（2020）也發(fā)現(xiàn)14 周的耐力訓(xùn)練使大鼠出現(xiàn)生理性心肌肥大，且左心室miR-133 表達(dá)顯著增加。但在病理性心臟重塑時(shí)，運(yùn)動(dòng)對(duì)miR-133 的調(diào)節(jié)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使AAC 大鼠心肌miR-133 表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)循環(huán)中miR-133 的水平顯著降低，提示跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)miR-133的表達(dá)可能是運(yùn)動(dòng)防治心血管疾病的機(jī)制之一。根據(jù)已有研究提示，運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)肌源性miR-133 的表達(dá)可能與轉(zhuǎn)錄因子MyoD、myogenin、PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路等作用機(jī)制相關(guān)（Pegoraro et al.，2020；Soplinska et al.，2020）。

miR-133 抑制心肌細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮心臟保護(hù)作用的重要機(jī)制。在β1 腎上腺素受體持續(xù)激活誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡時(shí)，miR-133 能顯著抑制凋亡的發(fā)生，miR-133 可以下調(diào)60% β1腎上腺素能受體mRNA 表達(dá)，抑制受體通路的激活，發(fā)揮抗心肌凋亡的作用（Nader et al.，2021）。miR-133 還通過(guò)抑制caspase-9 的表達(dá)，抑制尼古丁誘導(dǎo)的心肌凋亡（Jan et al.，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)AAC 大鼠的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加，4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，細(xì)胞凋亡得到顯著改善，上述改變與心肌miR-133 的表達(dá)變化同步，提示心肌組織中的miR-133可能通過(guò)抗細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

為了驗(yàn)證miR-133 在運(yùn)動(dòng)改善心臟病理性重塑中的作用，本研究對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)大鼠同時(shí)外源性給予了agomir-133，結(jié)果與多數(shù)miR-133 發(fā)揮心臟保護(hù)作用的研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)腓腸肌注射agomir-133 并沒(méi)有發(fā)揮對(duì)心臟病理性重塑的改善作用。與以往研究相比，本研究的給藥部位以及靶向性有所不同。Chen 等（2017）將過(guò)表達(dá)miR-133 的間充質(zhì)干細(xì)胞直接注射到心肌梗死大鼠的心肌組織中，Sun 等（2020）對(duì)大鼠尾靜脈注射攜帶miR-133 的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽（RGD）修飾的聚乙二醇（PEG）-聚乳酸（PLA）納米粒（PEG-PLA/miR-133），對(duì)心肌組織具有較高的靶向性。本研究采用了肌肉注射，并選取了目前應(yīng)用較為廣泛的agomir 實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)。agomir 是人工合成并經(jīng)過(guò)特殊化學(xué)修飾的miRNA 片段，通過(guò)模擬內(nèi)源性miRNA 來(lái)調(diào)節(jié)靶基因mRNA 的表達(dá)而發(fā)揮作用（Mai et al.，2019）。與其他過(guò)表達(dá)試劑相比，agomir 在動(dòng)物體內(nèi)具有更高的穩(wěn)定性和活性，作用時(shí)間長(zhǎng)，不依賴(lài)載體，對(duì)各種器官組織均可發(fā)揮作用。但有研究提示，局部注射agomir可能無(wú)法到達(dá)外周組織發(fā)揮作用。Zhang 等（2021）將0.25 nmol/g 體質(zhì)量的agomir-30b 注射到小鼠的褐色脂肪組織中，發(fā)現(xiàn)心臟、肝臟等外周組織中miR-30b 的表達(dá)無(wú)顯著升高，表明局部agomir-30b 給藥對(duì)其他組織不產(chǎn)生影響。本研究以局部給藥的方式對(duì)腓腸肌進(jìn)行了多點(diǎn)注射，并檢測(cè)了血漿和心肌miR-133 表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)注射agomir-133 后心肌miR-133 表達(dá)顯著降低，在血漿中也未發(fā)生顯著變化。由于腓腸肌以快肌纖維為主，血管數(shù)量較少，推測(cè)agomir-133注射后難以進(jìn)入循環(huán)及外周組織發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，肌肉agomir-133 給予不但沒(méi)有發(fā)揮心臟的保護(hù)作用，還抵消了運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟病理性重塑的改善作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肌肉agomir-133 給予后，骨骼肌出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，推測(cè)miR-133 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的肌肉萎縮通過(guò)外周機(jī)制加重心臟病理性重塑。以往研究也證實(shí)miR-133 與肌肉萎縮有關(guān)（Cacchiarelli et al.，2011；Ringholm et al.，2011；Williams et al.，2009），并將miR-133 作為臨床上肌病的診斷指標(biāo)。目前研究提示，骨骼肌質(zhì)量與心血管疾病的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌質(zhì)量的減少增加了冠心病患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)（Nichols et al.，2019），骨骼肌質(zhì)量與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)呈正對(duì)數(shù)線(xiàn)性相關(guān)（Knowles et al.，2021），肌少癥患者骨骼肌質(zhì)量的減少會(huì)對(duì)心衰病人的預(yù)后產(chǎn)生不良影響（Emami et al.，2018；Von，2018）。研究表明骨骼肌和心肌之間存在交互作用。肌肉萎縮時(shí)其胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（Neuregulin，NRG1）、機(jī)械生長(zhǎng)因子（mechano growth factor，MGF）以及卵泡抑素樣蛋白1（Follistatin-like protein 1，F(xiàn)STL1）的表達(dá)顯著降低，與心功能的減弱及心梗的發(fā)展有關(guān)（Cai et al.，2016；Xi et al.，2021）。MSTN 是肌肉生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控因子，主要由骨骼肌分泌，有研究報(bào)道肌肉萎縮 合 并 心 衰 小 鼠 血 漿MSTN 明 顯 增 加（Heineke et al.，2010），且MSTN 可引起心肌纖維化和心衰等癥狀（Yoshida et al.，2013）。本研究中腓腸肌注射agomir-133 后發(fā)生萎縮，腓腸肌以及血漿中MSTN 的表達(dá)均顯著升高。提示agomir-133 給藥引起的肌肉萎縮可能誘導(dǎo)肌源性MSTN及其他外周機(jī)制作用于心臟，加重了心臟病理性重塑。但具體機(jī)制如何還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

AAC 誘導(dǎo)大鼠發(fā)生心臟病理性重塑，心肌中miR-133表達(dá)降低，循環(huán)中miR-133 水平增加。4 周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著改善了AAC 誘導(dǎo)的心肌肥大和纖維化，抑制了心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)增加了心肌miR-133 表達(dá)，降低了循環(huán)中miR-133 的水平。外源性的agomir-133 給藥使心肌內(nèi)源性miR-133 表達(dá)降低，抵消了運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟病理性重塑的改善和抗凋亡作用，并引起骨骼肌萎縮。miR-133 在運(yùn)動(dòng)改善心臟病理性重塑中發(fā)揮重要作用，其在骨骼肌內(nèi)的過(guò)表達(dá)可引起肌肉萎縮，并可通過(guò)外周機(jī)制抵消運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟病理性重塑的改善作用。