過瘤胃煙酸和膽堿對圍產期奶牛泌乳性能和肝脂質代謝的影響

崔志潔，姜惺偉，吳登科，雷新建，曹陽春，鄧 露，姚軍虎，蔡傳江

(西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

奶牛圍產期包括圍產前期(產前21 d)和圍產后期(產后21 d)。圍產期奶牛由于采食量下降，胎兒急速發(fā)育等因素，能量攝入無法滿足機體需求[1-2]，導致能量和其他營養(yǎng)素的負平衡，進而易患各種代謝疾病，如脂肪肝、酮病等。有研究表明，產后奶牛脂肪肝患病率高達50%[3]。

煙酸(niacin, NA)，又名尼克酸，與其衍生物煙酰胺是VB3的兩種形式，是人體和動物不可缺少的營養(yǎng)成分。VB3是輔酶I和輔酶II前體物，還可通過煙酸的G蛋白偶聯受體(GPR109A)發(fā)揮抗脂解作用[4]，在能量代謝和細胞保護途徑都起著至關重要的作用[5]。NA在臨床上被廣泛用于治療血脂代謝異常。Ganji等[6-8]在體內外研究發(fā)現，NA可顯著改善肝中脂肪積累以及脂肪變性、炎癥和纖維化；Li等[9]的研究結果表明，NA可通過增加肝的脂質氧化并減少脂肪酸的從頭合成來緩解大鼠慢性酒精脂肪肝。NA在奶牛飼料中作為添加劑也被廣泛使用。Morey等[10]報道在圍產期奶?；A日糧中添加24 g·d-1過瘤胃保護煙酸(rumen-protected niacin, RPN)，可降低產后血漿中非酯化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid, NEFA)的濃度。從源頭上減少機體體脂動員，使進入肝的NEFA減少是緩解脂肪肝途徑之一，加速甘油三酯(triglycerides, TG)轉運出肝是緩解脂肪肝的另一條途徑。膽堿(choline, CH)是一種水溶性維生素類營養(yǎng)物質，參與3個主要的生理過程：1)作為細胞結構物質，維持細胞膜的結構和功能；2)參與乙酰膽堿合成，維持信息傳遞；3)作為甲基供體，參與機體甲基和蛋氨酸循環(huán)，調控基因表達[11]。此外，CH可促進極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)的合成，使TG及時轉運出肝組織，還可作為肉毒堿的甲基供體加快肝中脂肪酸的β氧化，減少TG的沉積[12-13]。CH在人類和鼠的肝組織能量代謝中發(fā)揮重要作用，并可用于預防和治療脂肪肝[14-16]。由于反芻動物瘤胃的特殊性，添加的CH需經過瘤胃包被技術加工，孫菲菲[17]在圍產期奶?；A日糧中添加60 g·d-1過瘤胃保護膽堿(rumen-protected choline, RPC)，發(fā)現RPC能顯著降低血漿NEFA的含量，提高VLDL的含量，從而改善肝和機體健康。綜上，煙酸可從源頭上減少進入肝的NEFA，膽堿可增加肝中TG的運輸，二者分別從不同的途徑緩解奶牛脂肪肝，但二者同時添加是否有協(xié)同作用并未報道。因此，本試驗旨在前期研究基礎上，研究日糧中添加RPN和RPC對圍產期奶牛泌乳性能和脂質代謝的影響，以期為緩解奶牛脂肪肝提供理論依據。

在馬克思之后，阿倫特從人的行動與語言的公共性維度概括出存在主義的公共性，哈貝馬斯將公共性闡發(fā)為主體間商談倫理的公共性，羅爾斯則提出在無知之幕中建構公共理性并以此限制人的行為，但他們都沒有超越馬克思，只是對馬克思的公共性理論進行了部分延伸和拓展，使之更加正視人性之弱點、更為契合新的時代精神。在21世紀破解人類共同難題，需要激活歷史唯物主義的公共性維度，引導人們更多地從公共實踐、公共利益、公共需要、公共意識、公共目標來認識和破解發(fā)展難題。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與分組

本試驗選用24頭健康、胎次相近的中國荷斯坦圍產期奶牛(山東省淄博市某規(guī)模化奶牛場)。根據2×2試驗設計法，將奶牛分為4組，每組6頭。日糧處理組分別為：對照組(CON，基礎日糧)、煙酸組(RPN，基礎日糧+18.4 g·d-1RPN(有效成分9.6 g·d-1))、膽堿組(RPC，基礎日糧+60 g·d-1RPC(氯化膽堿15 g·d-1))、混合組(RPN×RPC，基礎日糧+18.4 g·d-1RPN+60 g·d-1RPC)。RPN劑量參考Morey等[10,18]的方法；RPC劑量參考孫菲菲[17]的方法。試驗期為產前14 d到產后21 d，共35 d。試驗用RPN(純度65%，過瘤胃率80.3%)和RPC(氯化膽堿25%，過瘤胃率85%)均購自杭州康德權飼料有限公司。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗牛飼養(yǎng)管理均依照牧場管理制度。試驗期配制2種日糧，分別是圍產前期日糧和圍產后期日糧，原料組成及營養(yǎng)水平見表1；基礎日糧以全混合日糧(total mixed ratio，TMR)的形式飼喂，分別于07:00和16:00飼喂，自由采食和飲水。

表1 圍產前期和圍產后期日糧組成(干物質基礎)

1.3 樣品采集

1.3.1 血液樣品的采集 于產前14、7 d，產后1、7、14和21 d 18:00在頸靜脈采集約10 mL血液樣品，分裝于EDTA-K2抗凝管中，3 000×g離心15 min，取上清液(即血漿)，分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃冷凍保存，待測。

1.4.5 肝脂質合成和氧化相關基因表達量的測定 采用常規(guī)TRIzol法，提取奶牛肝組織總 RNA。稱取50～80 mg冷凍肝組織，加入1 mL TRIzol(TaKaRa，中國大連)，充分勻漿，取上清液，加入氯仿和異丙醇，獲得RNA沉淀。然后用75%的乙醇洗滌RNA沉淀，將其溶解于無RNAse水中。使用超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度。隨后將RNA反轉錄為cDNA(UEIris RT mix with DNase，R2020，US EVERBRIGHT INC)。反應條件是：42 ℃持續(xù)30 min、95 ℃持續(xù)5 min、5 ℃持續(xù)5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用SYBR(US EVERBRIGHT INC，S2014))進行實時熒光定量(RT-qPCR)。擴增體系為10 μL：SYBR Green Master Mix(2×)5 μL，正向和反向引物各0.5 μL，cDNA 4 μL。使用兩步快速擴增法：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，重復40個循環(huán)，60 ℃退火30 s，重復40個循環(huán)(LightCycler?96，Roche)?；虮磉_量用經典的2-ΔΔCT方法計算[19]，引物序列見表2。

研究結果為企業(yè)在合作實踐中更好的開展協(xié)調聯動工作，創(chuàng)新合作方式，提高合作深度與廣度，設計合理有效的協(xié)調聯動機制提供了重要參考依據。由于各影響因素對協(xié)調聯動影響程度不同，企業(yè)在確立與優(yōu)化合作伙伴關系時應重點針對關鍵因素制定措施以改進其對合作關系的作用效果。

如圖5所示，日糧添加RPN顯著降低了肝中TG的含量(主效應P=0.006)。組間比較發(fā)現，RPN和RPN×RPC組肝中TG含量顯著低于CON組(P<0.05),RPC組與CON組相比差異不顯著(P>0.05)。

1.3.2 肝組織樣品的采集 于產后21 d進行肝組織活檢(每次在13:00時采集)，用活檢針穿刺采集肝組織樣本。將第10和11根肋骨和髖關節(jié)到右前肢肘關節(jié)的連線交叉處區(qū)域剃光，酒精消毒，2 mL鹽酸利多卡因皮下麻醉，5 min后通過皮膚反應評估麻醉效果，用刀片在體壁切口，活檢針向肝插入，收集約100 mg組織在液氮中快速冷凍，-80 ℃下保存，待測。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 母牛體重和犢牛初生重 產犢后1、7、14和21 d測定母牛體重(body weight, BW)和犢牛初生重。

1.4.2 產奶量測定與乳成分分析 產犢后，試驗奶牛采用魚骨式擠奶臺進行擠奶，擠奶廳配套利拉伐奶廳管理系統(tǒng)軟件，記錄產后1～21 d的產奶量，產后14 d和產后21 d上午和下午均采集乳樣各約50 mL，均勻混合為全天奶樣，混合奶樣中添加1～2滴飽和重鉻酸鉀溶液作為防腐劑，混勻保存。乳成分使用全自動乳成分分析儀(FOSS, 丹麥)測定，檢測指標包括乳脂肪、乳蛋白、乳糖、固形物和乳尿素氮。

當前在校大學生群體基本為“95后”“00后”，這類群體更具有全球化視野、立體化知識結構與個性化表達習慣，對“形勢與政策”課授課的內容和方式要求更高，所以亟需推進教學方式方法的創(chuàng)新。具體來說，可從以下幾方面著手。

1.4.3 血漿生化指標測定 血漿生化指標均使用生化試劑盒測定：葡萄糖(GLU，上海優(yōu)選生物科技有限公司)，甘油三酯(TG，E-BC-K261-M，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，NEFA(A042-1-1，南京建成生物工程研究所)、β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid，BHBA，E030-1-1，南京建成生物工程研究所，中國南京)。VLDL含量采用酶聯免疫吸附法測定，試劑盒購于上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.4.4 肝TG的測定 肝TG使用商業(yè)試劑盒(E-BC-K261-M，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)測定，總蛋白濃度使用BCA法。

隨著全國數字化城市建設浪潮興起，數字城市成為熱點研究方向之一。各大院校、科研結構及公司紛紛對數字城市理論進行研究，并開展一些系列的系統(tǒng)開發(fā)工作，取得了一定的研究成果，如CityMaker三維數字城市可視化平臺、Skysymbol網絡三維數字城市平臺等。由于三維數字城市包含大量地形、影像、城市模型及紋理數據，數據量通常在幾百G以上。因此，海量數據成為數字城市實現動態(tài)可視化的瓶頸[2]。對于海量級別精細化數字城市模型數據庫如何組織與管理以及場景數據如何調度，成為3DGIS數字城市建設的關鍵問題，也是主要的障礙。

表2 引物列表

1.5 數據處理

試驗數據使用SAS 9.2的混合線性模型進行單因素和雙因素重復測定分析(Repeated Measurement Model)，對于單個時間點的組間差異顯著性，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P≤0.05表示差異顯著，0.050.05表示無顯著性差異。

2 結 果

2.1 添加RPN和RPC對圍產期奶牛生產性能的影響

如表3和表4所示，奶牛的BW和犢牛的初生重并未受到添加RPN和RPC的影響，產后3周內，奶牛的BW呈現下降狀態(tài)。日糧添加RPN和RPC對圍產后期奶牛產奶量(圖1)、乳脂、乳蛋白、乳糖、非脂固形物和乳尿素氮(表5)均無顯著影響(主效應P>0.05)。

圖1 圍產期奶牛添加RPN和RPC對產奶量的影響

表3 圍產期奶牛添加RPN和RPC對圍產期奶牛體重的影響

2.2 添加RPN和RPC對圍產期奶牛血液生化指標的影響

如圖3所示，添加RPN和RPC對血漿中NEFA、BHBA和GLU無顯著影響(主效應P>0.05)，RPN與RPC間不存在交互作用(RPN×RPCP>0.05)，但血漿NEFA、BHBA濃度均受時間影響(TimeP<0.05)。單獨添加RPN和RPC對血漿中TG無顯著性影響(主效應P>0.05)，但RPN和RPC存在交互作用(RPN×RPCP<0.05)，且與時間存在交互作用(RPN×RPC×TimeP<0.05)。動態(tài)監(jiān)測產前14 d到產后21 d血漿中VLDL的含量，結果顯示(圖4)，日糧中添加RPN、RPC顯著增加了血漿中VLDL的含量(主效應RPNP<0.001, RPCP<0.001)，且二者存在交互作用(RPN×RPCP<0.001)。RPN×RPC與時間也存在交互效應(RPN×RPC×TimeP=0.038)，組間比較，RPN、RPC和RPN×RPC的VLDL含量均顯著高于CON組(P<0.05)。

圖2 RPN和RPC對圍產期奶牛血漿中NA和CH含量的影響

如圖2所示，圍產期奶牛基礎日糧中添加RPN和RPC可分別提高血漿中NA和CH的含量(主效應P<0.001)。在整個試驗期，血漿NA和CH含量隨時間變化而變化(TimeP<0.001)，NA和CH含量都是在產后1 d達到最高。

圖3 RPN和RPC對圍產期奶牛血漿中生化指標含量的影響

圖4 RPN和RPC對圍產期奶牛血漿中VLDL含量的影響

2.3 添加RPN和RPC對圍產期奶牛肝中TG的影響

邊坡區(qū)上部為含角礫粉質粘土，下部為基巖層。上部土體為含角礫粉質粘土底部局部地段分布有一層厚度為0.1～0.2m灰白色夾紫紅色粉質粘土，粉質粘土夾少量角礫，分布在邊坡的中前緣地段，該層遇水極易軟化，并易形成貫通性潛在滑動面，空隙較大，地下水易富集在此，因此在暴雨季節(jié)，地表水滲入形成局部孔隙水水壓急劇增高，隨著水自上向下排泄流經，再加上土體力學參數降低，為邊坡變形破壞形成提供有利條件。下部基巖為順層砂質泥巖邊坡，巖層層面局部呈閉合～張開0.1～0.3cm，裂隙面粗糙，充填少量的粘性土，巖層中層間錯動帶較為發(fā)育，薄層泥巖地段最為發(fā)育，為工程邊坡潛在滑動面（順層結構面）。

圖5 RPN和RPC對圍產期奶牛肝中TG含量的影響

2.4 添加RPN和RPC對圍產期奶牛肝脂質合成及氧化基因表達的影響

由表6可知，日糧中添加RPN和RPC對PPAR-αmRNA相對表達量無顯著影響(主效應P>0.05)，但RPN和RPC存在互作效應(RPN×RPCP=0.043)。RPC有降低DGAT1的趨勢(主效應RPCP<0.10)，添加RPN和RPC對脂質合成和氧化的其他基因相對表達量均無顯著影響(主效應P>0.05)；組間對比差異不顯著(P> 0.05)。

表6 RPN和RPC對圍產期奶牛肝脂代謝相關基因的影響

3 討 論

3.1 日糧添加RPN和RPC對圍產期奶牛生產性能的影響

在過去幾十年，關于奶牛日糧中補飼RPN和RPC的研究有很多，大多數結果表明二者的補充不影響泌乳早期的采食量(dry matter intake, DMI)和產奶量。Morey等[10]在圍產期奶牛基礎日糧中添加24 g·d-1RPN，對體況評分(body condition score, BCS)、BW、能量平衡、產奶量及乳成分無顯著影響。Yuan等[20]研究結果顯示，圍產期奶牛日糧中補飼12 g·d-1RPN對奶牛生產性能也無顯著影響。Bollatti等[21]報道，奶牛日糧添加12.9 g·d-1RPC不會影響其DMI、BCS和BW。本試驗研究結果與之一致，日糧添加RPN和RPC對圍產期奶牛、犢牛體重產奶量以及乳成分無顯著影響。但也有研究結果顯示，補飼RPN和RPC可以提高奶牛產奶量[22-23]。Potts等[23]發(fā)現，在試驗中添加60 g·d-1RPC(氯化膽堿含量為28.8%)，可顯著增加奶牛的產奶量。本試驗RPC添加量與Potts 等[23]的試驗相似，但氯化膽堿含量較低，為25%。因此，本試驗生產性能無顯著變化可能是由于添加量較低或生物學效價不同，后續(xù)應加大添加量，探索RPN和RPC的最佳劑量。

鑒于藥學類實驗室種類多樣，經常存在多學科交叉共用實驗室現象，筆者提出以實驗室安全防控點為依據的實驗室分類方案，以便安全環(huán)保培訓和實驗室準入制度的實施。該分類方案將實驗室按安全與環(huán)保因素分為以下幾類：“有毒”指可直接接觸有毒物質、產生有毒氣、液、固體物質、接觸高傳染性生物、放射性物質等的實驗室；“危險”指實驗中可能發(fā)生爆炸、爆沸、明火，接觸高壓、高溫等實驗室；“風險”指實驗中可能接觸腐蝕性物質，可造成實驗者肢體損傷，接觸動物、微生物有潛在感染，火、水、電傷害等的實驗室；“一般”可能出現水、電、火災及普通污染物等實驗室，具體涉及的實驗室見表1。

3.2 添加RPN和RPC對圍產期奶牛血液生化指標的影響

為增加小腸中對NA和CH的生物利用度，本試驗從產前14 d到產后21 d持續(xù)添加RPN和RPC，顯著提高了血漿中NA和CH的含量。值得注意的是，二者混合添加后血漿中CH的含量并未顯著提高，且與CON組中的CH含量接近，原因可能是部分CH在肝中轉化為甜菜堿，進一步提供甲基，而NA代謝過程中會消耗甲基[24]，導致RPN × RPC組CH含量未顯著提高，其具體原因還需進一步探究。

泌乳早期，奶牛為補償能量不足而動用體脂[25]，導致血漿中NEFA、BHBA和肝中TG顯著增加[26]。由于其抗脂解作用，煙酸被認為是一種降脂化合物[27]。因此，煙酸有望抑制泌乳早期的脂肪分解以改善奶牛健康。NEFA是反映奶牛脂肪動員和代謝健康的重要指標[28]。研究表明，圍產期補飼RPN可降低血漿NEFA濃度[20,29]，但也有研究表明添加RPN對血液NEFA濃度無顯著影響。Zeitz等[30]試驗中補飼79 mg·kg-1BW RPN，奶牛血漿TG含量和NEFA濃度無顯著差異，本試驗研究結果與之一致。Aragona等[31]發(fā)現，添加16、32、48 g·d-1RPN對圍產期奶牛能量代謝和生產性能無顯著影響。Pires等[32-34]發(fā)現，每小時持續(xù)真胃灌注3 mg·kg-1BW RPN可顯著降低奶牛血漿NEFA濃度，但在灌注停止后2～4 h觀察到NEFA濃度顯著反彈，且持續(xù)4～9 h。表明一定水平的RPN可以抑制脂肪分解，但血漿NEFA濃度的反彈可能會干擾對奶牛煙酸抗脂解作用的評估。血漿中NEFA部分氧化形成BHBA或酯化后作為TG儲存在肝中。有人提出，血漿NEFA濃度可能不是決定血漿BHBA濃度的唯一因素，但本試驗結果中添加RPN和RPC對血漿中NEFA和BHBA的濃度均無顯著影響。如同NEFA一樣，也存在持續(xù)灌注RPN可顯著降低BHBA濃度，但停止灌注后反彈的現象[33-34]。采血時間可能是導致各研究之間血漿NEFA和BHBA濃度差異的一個原因，因為血漿NEFA和BHBA濃度可能會因進食和采血之間的時間間隔而產生差異[4]。因膽堿可促進VLDL的合成，是被廣泛用于緩解奶牛脂肪肝的添加劑。圍產期奶牛補飼 RPC 對血漿NEFA和BHBA的影響也不一致，這可能是因為開始補充的時期、持續(xù)時間、補充水平或過瘤胃保護率不同導致的[35]。一些研究中，RPC降低了血液 NEFA和BHBA濃度[36-38]，而在其他研究中無顯著影響[39-41]。本試驗添加RPC對血漿NEFA和BHBA濃度無顯著影響，二者混合添加對NEFA和BHBA也無顯著影響。

3.3 添加RPN和RPC對圍產期奶牛肝中TG及脂質代謝相關基因表達的影響

奶牛的肝脂肪變性主要是由體脂動員、脂肪酸氧化、TG合成和輸出的不平衡引起的。在非反芻動物中，肝中TG累積與SREBP-1c的轉錄活性和豐度密切相關，部分原因是該蛋白質參與調節(jié)脂肪酸和TG合成的基因，包括 ACC1、FAS和DGAT1[42-43]。Jia等[44]的研究表明，中度脂肪肝奶牛的肝中過度誘導 SREBP-1c 及其靶分子 ACC1、FAS和DGAT1表達。此外，用高濃度脂肪酸處理犢牛原代肝細胞可上調脂肪生成分子(ACA、FAS和 DGAT1)的表達，部分是通過增加SREBP-1c的表達和活性。這表明脂肪生成是奶牛中度脂肪肝發(fā)育的一個組成部分[45]，而PPAR-α和CPT1A可促進脂肪酸的氧化，CPT1A是PPAR-α的靶分子。本試驗發(fā)現，RPC有降低DGAT1的趨勢，表明添加RPN和RPC有降低肝中脂肪合成的可能。另一方面，本試驗添加RPC奶牛肝中TG含量顯著降低，可能是RPC促進了VLDL的合成，有利于肝中TG的輸出。

4 結 論

圍產期奶牛日糧中添加RPN和RPC可顯著提高血漿中VLDL的含量，降低肝中TG的含量，從而有效緩解圍產期奶牛脂肪過度沉積，但二者混合添加的效果并未顯著優(yōu)于單獨添加，具體機制還需進一步探究。