共軛亞油酸誘導(dǎo)的奶牛低脂乳癥中脂肪球膜甘油磷脂的組成差異分析

楊靜娜，胡明月，盧文燕，黃啟雪，未安琪，王月影，鐘 凱，韓立強(qiáng)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000)

乳脂在乳中主要存在形式為乳脂肪球(milk fat globules，MFG)，核心為甘油三酯，外面由三層膜包裹，稱為乳脂肪球膜(milk fat globule membrane，MFGM)[1-2]。乳脂肪球粒徑大小從0.2到15 μm不等。MFGM中最重要的極性脂質(zhì)是磷脂[3]。磷脂可分為甘油磷脂和鞘磷脂兩大類，約占乳脂總量的1%[4]。國外研究發(fā)現(xiàn)，MFG的粒徑和乳脂肪球膜的磷脂含量受到季節(jié)因素和飲食的影響[5]。在天然牛乳中，乳脂肪球粒徑大小的分布會影響牛乳中極性脂質(zhì)、膜結(jié)合蛋白與甘油三酯的比值[6]。Loperz等[7]發(fā)現(xiàn)，飼喂奶牛亞麻籽增加了牛乳中的MFGM磷脂含量，這與較小粒徑的乳脂肪球有關(guān)。大粒徑和小粒徑乳脂肪球含有不同數(shù)量的極性脂質(zhì)[8]。Lopez和Ménard等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MFGM磷脂組合物的含量在不同粒徑的MFG之間也有所差異[10-11]。MFG主要來源于乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的脂滴(lipid droplet，LD)，已有研究證明，膜中磷脂的組成和生物利用度可以對LD的大小和融合發(fā)揮調(diào)控作用[12-13]，增加磷脂酰乙醇胺(PE)與磷脂酰膽堿(PC)的比例可以促進(jìn)膜融合，進(jìn)而促進(jìn)脂滴融合使LD直徑增加[14]。

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一種主要從反芻動(dòng)物脂肪和牛奶產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的天然活性物質(zhì)，是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的所有立體和位置異構(gòu)體混合物的總稱[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中多不飽和脂肪酸的生物合成過程中產(chǎn)生脂肪酸中間體，這些中間體被吸收，對奶牛乳腺脂肪的合成具有直接的抑制作用[17-18]，其中Trans-10,cis-12 CLA已經(jīng)被確定為瘤胃脂肪酸氧化的中間體，可以抑制牛奶脂肪的合成，形成低脂乳癥[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量CLA能誘導(dǎo)奶牛低脂乳癥，影響 MFG 粒徑D[3,2]和D[4,3]的大小[20]，但低脂乳是否引起了脂肪球膜的甘油磷脂含量差異目前國內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)為自身前后對照，試驗(yàn)組奶牛先飼喂CLA日糧6 d，然后恢復(fù)為基礎(chǔ)日糧飼喂6 d，采用液相色譜-質(zhì)譜分析牛乳中甘油磷脂含量的變化趨勢。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 共軛亞油酸微囊粉購于青島澳海生物科技有限公司，脂肪酸組成如表1所示；甲醇、乙腈、異丙醇(色譜純)購于Merck，甲酸銨、氯仿(色譜純)購于Fisher，甲酸(色譜純)購于中國Sigma-Aldrich公司，甲基叔丁基醚(色譜純)購于CNW，甘油磷脂標(biāo)準(zhǔn)品(15:0/18:1-d7-PE, 15:0/18:1-d7-PS, 15:0/18:1-d7-PG, 15:0/18:1-d7-PI, 15:0/18:1-d7-PA, 15:0/18:1-d7-PC, 18:1(d7)Lyso PE, 18:1(d7)Lyso PC)購于美國Avanti Polar Lipids公司。

表1 共軛亞油酸鈣(CLA-Ca)的脂肪酸組成

1.1.2 主要儀器 乳成分分析儀(Foss 120 Milko-Scan，丹麥)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS 1X73，日本)、馬爾文3000激光粒度儀(Mastersizer3000，英國)、移液槍(Eppendorf，德國)，離心機(jī)(Eppendorf，德國)，LC-MS/MS(SCIEX，QTRAP 6500+，美國)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場進(jìn)行。試驗(yàn)所用奶牛在同一雙列式牛舍內(nèi)飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間采用全混日糧(total mixed ration，TMR)，按照自由采食、自由飲水的方式進(jìn)行飼養(yǎng)，所有試驗(yàn)?zāi)膛＝y(tǒng)一管理。泌乳母牛每天早上6:00、下午15:00和晚上20:00擠奶3次，在6:00和15:00擠奶后飼喂基礎(chǔ)日糧，日糧營養(yǎng)成分見表2。

表2 奶?；A(chǔ)日糧成分和化學(xué)組成

1.2.2 樣品采集 隨機(jī)選取身體狀況相近的泌乳中期10頭荷斯坦奶牛，試驗(yàn)設(shè)計(jì)前后自身對照，共持續(xù)12 d。第1～6天處理期每頭奶牛飼喂基礎(chǔ)日糧+CLA 400 g·d-1，第7～12天恢復(fù)期奶牛飼喂基礎(chǔ)日糧，每天記錄每頭牛的產(chǎn)奶量與采食量，每天下午15:00擠奶時(shí)采集乳樣200 mL，一部分送到河南DHI檢測乳脂肪、乳蛋白、乳糖等乳成分含量。另一部分立即用馬爾文3000激光粒度儀進(jìn)行粒徑參數(shù)測量。取第1、6、12天的乳樣提取脂質(zhì)，用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行甘油磷脂含量分析。

1.2.3 乳脂肪球粒徑測量 乳脂肪球粒徑使用激光粒度儀進(jìn)行分析，根據(jù)Mastersizer 3000濕法單元的基本指南，點(diǎn)擊“手動(dòng)測量”，設(shè)置折射率(純水1.330，牛奶1.560)，攪拌器速度 2 000 r·min-1。設(shè)置完成后，在500 mL燒杯中加入超過 400 mL的水，并將攪拌器放入燒杯中。并點(diǎn)擊開始按鈕初始化儀器，設(shè)置測量背景，然后將大約1 mL的純牛奶樣品加入燒杯，直到激光遮蔽條指示大約10%～20%。然后開始測量，系統(tǒng)將自動(dòng)測量3次并計(jì)算平均值。用Mastersizer軟件對每個(gè)樣品的測量值進(jìn)行分析，生成的數(shù)據(jù)包括：表面積相關(guān)直徑D[3,2]、體積相關(guān)直徑D[4,3]、10%粒子體積徑Dv(10)、50%粒子體積徑Dv(50)、90%粒子體積徑Dv(90)和比表面積SSA。根據(jù)所測脂肪球粒徑大小將乳脂肪球分為3部分，小脂肪球(small MFG)粒徑范圍為1.0～2.0 μm；中脂肪球(medium MFG)粒徑范圍為2.0～4.0 μm；大脂肪球(large MFG)粒徑范圍為4.0～8.0 μm，并計(jì)算各自所占比例。

1.2.4 甘油磷脂含量分析

1.2.4.1 磷脂樣品的提取：將乳樣從-80 ℃冰箱取出，在冰上溶解；溶解混勻后取0.2 mL，加入2 mL甲醇于-20 ℃冰箱中靜置12 h用于沉淀蛋白。同時(shí)每個(gè)樣本中取500 μL混合均勻后取3份，每份200 μL，作為提取質(zhì)控樣本(TT-QC)，與樣本用相同方法提取。加入100 μL(10 μg·mL-1)內(nèi)標(biāo)，2 mL二氯甲烷，渦旋1 h；再加入2 mL二氯甲烷，1.6 mL超純水，渦旋離心，將下清轉(zhuǎn)移到新的EP管中；剩余上清再加入4 mL二氯甲烷提取，重復(fù)2次，與上述下清混合，氮吹；用1 mL異丙醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，所有樣本取200 μL混合均勻作為質(zhì)控樣本QC，上機(jī)。

1.2.4.2 色譜質(zhì)譜分析：色譜系統(tǒng)：shimadzu UPLC LC-30A；色譜柱：Phenomenex Kinete C18 column(100×2.1 mm，2.6 μm)；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.4 mL；柱溫：60 ℃；樣品室溫度：4 ℃。

溶劑體：A相∶H2O∶MeOH∶ACN(1∶1∶1含5 mmol·L-1NH4Ac)；B相：IPA：CAN(5∶1)(含5 mmol·L-1NH4Ac)；梯度洗脫條件：0.5 min，20% B相；1.5 min 40% B相；3 min 60% B相；13 min 98% B相, 13.1 min 20% B相, 17 min 20% B相。

質(zhì)譜系統(tǒng)：AB SciexTripleTOF? 6600，ESI離子源；質(zhì)譜采集的質(zhì)量數(shù)范圍：100～1200 m·z-1；Curtain Gas: 35.000 psi；Ion Source Gas1: 50.000;Ion Source Gas2: 50.00; IonSpray Voltage: 5500.00 V; Temperature: 600 ℃。磷脂的定性及定量分析采用MS-DIAL、PeakView、MasterView和MultiQuant(SCIEX)軟件進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)奶量、乳成分、粒徑參數(shù)和甘油磷脂含量采用SPSS25軟件(SPSS/ibmcorp.，Chicago，IL)中一般線性模型(GLM)的重復(fù)測量方差進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 生產(chǎn)性能及乳成分分析

由圖1可知，飼喂CLA處理前后對奶牛的產(chǎn)奶量、采食量、乳糖、乳蛋白含量沒有顯著差異(P>0.05)，顯著降低了乳脂肪的含量(P<0.05)。第1天乳脂肪為每100 mL 3.86 g，飼喂CLA后乳脂肪含量開始下降，到第6天降至每100 mL 1.99 g，停止飼喂后乳脂肪含量慢慢上升，到第12天恢復(fù)至每100 mL 2.86 g，同樣，脂肪蛋白比值也表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(P<0.05)。

A.產(chǎn)奶量；B.采食量；C.乳蛋白；D.乳脂肪；E.乳糖；F.脂肪/蛋白比率

2.2 乳脂肪球粒徑參數(shù)分析

由圖2可知，飼喂CLA處理前后D[3,2]的值有顯著差異(P<0.05)，D[3,2]由第1天的3.72 μm降低到第6天的3.05 μm，第12天恢復(fù)至3.14 μm，表明所有脂肪球顆粒的平均直徑顯著減少。CLA處理過程中粒徑參數(shù)Dv(10)、Dv(50)保持先降低后升高的趨勢(P<0.05)，對Dv(90)沒有顯著影響(P>0.05)，表明CLA的處理能夠降低牛乳中50%以上脂肪球的粒徑。比表面積(SSA)顯示為先升高后降低(P<0.05)，由第1天的1 797.075 m2·kg-1升高到第6天的2 244.795 m2·kg-1，第12天降低至2 127.07 m2·kg-1。

A.D[3,2]: 表面積平均直徑；B.D[4,3]: 體積相關(guān)的等效直徑；C.Dv(10): 10%粒子的體積徑；D.Dv(50): 50%粒子的體積徑；E.Dv(90): 90%的粒子的體積徑；F.SSA:比表面積

2.3 乳脂肪球粒度比例分析

將脂肪球按照粒徑分為大、小、中脂肪球，粒徑1.0～2.0 μm的為小脂肪球，粒徑2.0～4.0 μm之間的為中脂肪球，粒徑4.0～8.0 μm的為大脂肪球。如圖3所示，飼喂CLA處理前后，小粒徑脂肪球的比例先增加后降低(P<0.05)，大粒徑脂肪球的比例為先降低后升高(P<0.05)，而中粒徑脂肪球比例差異不明顯(P>0.05)。

圖3 共軛亞油酸對大、中和小粒徑脂肪球比例的影響

2.4 甘油磷脂含量分析

甘油磷脂是由甘油作為骨架，與兩種脂肪酸和一種磷酸鹽分子酯化而成，后者又與其他極性基團(tuán)(如膽堿、絲氨酸、乙醇胺或肌醇)結(jié)合，分別為溶血磷脂酰膽堿(LPC)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷酯酰絲氨酸(PS)等。在本試驗(yàn)中，通過 UPLC/QTOF-MS 鑒定了來自乳脂的77種甘油磷脂(圖4)，在不同飼喂時(shí)期甘油磷脂的含量變化如表3所示。與第1天相比，LPC18:1、PC 28:0、PC 30:0、PC 32:0、PC 34:1、PC 36:4 和PC 38:5的含量在第6天降低，到了第12天又升高(P<0.05)；LPE 18:2、PE 28:0、PE 30:0、PE 31:1e、PE 32:0、PE 32:2e、PE 33:2e、PE 34:0、PE 34:1、PE 34:2、PE 34:2e、PE 34:4e、PE 34:5e、PE 35:1、PE 35:3e、PE 35:5e、PE 36:2e、PE 36:4、PE 36:5e、PE 38:3、PE 38:4也呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，而PI化合物(PI 34:1、PI 34:2、PI 36:1、PI 36:2、PI 36:3、PI 38:3)從第1天開始隨著時(shí)間逐漸升高，到第12天濃度達(dá)到最高。計(jì)算甘油磷脂總含量變化發(fā)現(xiàn)，隨著CLA的處理，PC、PE的總含量和PC/PE呈先降低后升高趨勢，而PI、PS總化合物含量持續(xù)增加。PC和PE等磷脂是脂肪球膜的重要組成成分，這些結(jié)果表明CLA處理影響了牛乳脂肪球膜的磷脂組成。

圖4 甘油磷脂化合物數(shù)目

表3 共軛亞油酸對乳脂肪球膜甘油磷脂含量的影響

3 討 論

大量研究證明，經(jīng)過CLA處理的奶牛一般在5～7 d內(nèi)就具有抑制脂肪合成的作用，會導(dǎo)致乳脂含量降低，形成低脂乳癥[21-22]。韓雪峰等[23]在奶牛日糧中添加不同水平的CLA，發(fā)現(xiàn)能顯著降低乳脂率。Chouinard等[24]研究發(fā)現(xiàn)，給奶牛真胃灌注CLA會使乳脂含量大幅下降，且乳脂率呈劑量依賴性降低。與這些結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)在CLA處理前后對奶牛采食量、產(chǎn)奶量、乳糖和乳蛋白含量沒有顯著影響，但能顯著降低乳脂率，同時(shí)也顯著降低了乳脂球粒徑參數(shù)D[3,2]、Dv(10)和Dv(50)，表明脂肪含量的降低引起粒徑的減小[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，牛奶中的脂肪/蛋白質(zhì)比率(fat/protein ratio)可作為衡量脂肪球大小的指標(biāo)[26]。乳腺泌乳過程中，酪蛋白和脂肪球都在乳腺上皮細(xì)胞的頂端分泌，乳脂肪球通過出芽排出，并被頂端質(zhì)膜包圍，而與頂端質(zhì)膜一起運(yùn)輸?shù)哪遗葜兴睦业鞍讋t通過胞吐釋放，脂肪/蛋白質(zhì)比率體現(xiàn)了脂肪分泌和蛋白質(zhì)分泌之間的膜平衡[26]。Couvreur和Hurtaud[26]分析了一個(gè)包含數(shù)百頭奶牛的數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，MFG粒徑與乳脂含量和脂肪/蛋白質(zhì)比率呈正相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，CLA處理能夠影響乳中脂肪/蛋白的比例，當(dāng)MFG的粒徑減小時(shí)，脂肪/蛋白質(zhì)的比率也有顯著差異(圖1F)。因此，脂肪/蛋白比率可以作為一個(gè)評估乳脂肪球粒徑大小的指標(biāo)。有趣的是，在本研究中發(fā)現(xiàn)，飼喂CLA引起脂肪球粒徑減小的同時(shí)比表面積(SSA)顯著升高。SSA定義為每質(zhì)量單位材料的總表面積。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MFG的粒徑大小決定了它們的表面積，從而影響牛奶MFGM中表層物質(zhì)的含量[9]。有研究發(fā)現(xiàn)小粒徑MFG的SSA比大粒徑MFG要大[27]。Lopez等[8]研究也表明，大粒徑脂肪球的比表面積較小，為0.98 m2·g-1，而小粒徑脂肪球的比表面積較大，為4.36 m2·g-1。從不同尺寸MFG的總和分布(圖3)可以看出，CLA飼喂增加了小直徑脂肪球的比例，減少了大直徑脂肪球的比例，恢復(fù)為基礎(chǔ)日糧后，小脂肪球比例隨之降低而大脂肪球比例增加?？梢酝茰y，CLA處理抑制脂肪合成的同時(shí)導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成和分泌更多比例的小脂滴，這也引起了脂肪球粒徑的減少和比表面積的增加。

Lopez等[8]使用微濾法分離了正常牛乳中的大小脂肪球，發(fā)現(xiàn)極性脂質(zhì)(PE、PI、PS、PC和SM)在小粒徑MFG中高于正常牛乳和大粒徑MFG的牛乳。Logan等[28]報(bào)道小脂肪球的總PL和PC相對含量與大脂肪球相比有所增加。然而，Mesilati-Stahy等[29]通過重力作用將不同大小的MFGs分離開來，發(fā)現(xiàn)平均直徑接近或低于2 μm的小MFG中PI含量最高，PS含量最低，PE在大MFG中最高，而PC含量在大粒徑和小粒徑脂肪球之間沒有顯著變化。這些不同的結(jié)果表明，乳脂肪球磷脂的濃度可能不僅受MFG大小而影響，而且也受到試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分離方法的影響[28,30]。Foroutan等[31]通過質(zhì)譜鑒定并定量了牛乳中82種LPC、PC和PE，本研究采用色譜-質(zhì)譜技術(shù)定量了77種甘油磷脂。分析發(fā)現(xiàn)，與乳脂肪球粒徑變化類似，牛乳中PC和PE的含量也呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢(表3)。

Kinsella和Houghton[32]發(fā)現(xiàn)，在泌乳期間脂肪的產(chǎn)量和磷脂分泌均降低，因此在整個(gè)泌乳期間磷脂與脂肪的比率也比較穩(wěn)定，且Bitman和Wood[33]也研究發(fā)現(xiàn)，從哺乳第42到180天總脂質(zhì)中磷脂和膽固醇的百分比降低。PS的脫羧作用可以產(chǎn)生PE，PE可以通過磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用轉(zhuǎn)化為PC[34]。脂滴作為乳脂肪球的前體物，在乳腺細(xì)胞合成時(shí)需要包裹磷脂膜，磷脂含量的多少會影響脂滴大小[12-13]，進(jìn)而直接調(diào)控脂肪球的粒徑。因此這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了PE和PC代謝在調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞形成MFG粒徑中的作用。在脂滴生成脂肪球的過程中，脂肪球膜的外層主要由含有磷脂酰膽堿(PC)的甘油磷脂組成，并朝向水環(huán)境，而內(nèi)表面含有PE、PI和PS。PC占總磷脂的35%，其功能是維持膜的通透性[35]。PI是陰離子磷脂，不對稱地分布在MFGM的內(nèi)部單層中[36]。本研究中還發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇(PI)則呈現(xiàn)出與PC和PE完全不同的變化趨勢，其濃度在整個(gè)試驗(yàn)處理中呈現(xiàn)一直上升的趨勢。對不同粒徑牛乳中PI含量的研究很少，Lu等[37]對正常牛乳離心獲得的兩種不同粒徑大小的MFG進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)大粒徑MFG中的PI濃度較高。所以在本研究中PI含量增加所代表的科學(xué)意義，還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

綜上，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給奶牛飼喂CLA可以減少脂肪球粒徑，使小脂肪球比例增加，大脂肪球比例減少，減少了PC和PE含量，增加了PI含量，這些試驗(yàn)結(jié)果揭示CLA在造成低脂乳癥的過程中影響了脂肪球膜的磷脂組成。