基于COX-2酶活性的瘀血痹片生物質(zhì)量評(píng)價(jià)

馬悅，邵平，胡相卡，劉曉娟,5，楊鶴，桂留銘，蔡曾曉瑞，代春美

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110000；4.本溪國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心有限公司，遼寧 本溪 117004；5.通遼職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

瘀血痹片是由乳香、威靈仙、紅花、丹參、沒藥、川牛膝、川芎、當(dāng)歸、姜黃、香附、炙黃芪組成的片劑，具有活血化瘀、通絡(luò)定痛的功效，臨床用于瘀血阻絡(luò)的痹癥及肌肉關(guān)節(jié)的疼痛。近年來有研究報(bào)道瘀血痹片具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用[1]，且與其他藥物聯(lián)合治療膝骨關(guān)節(jié)炎的效果更好，不會(huì)增加用藥后的不良反應(yīng)，為預(yù)后提供保障[2-3]。在2020版《中國(guó)藥典》中僅收載了瘀血痹膠囊及瘀血痹顆粒，并以丹酚酸B(C36H30O16)的含量為測(cè)定指標(biāo)[4]，但該成分與功效并不完全相關(guān)，且對(duì)于同類品種瘀血痹片的質(zhì)量控制并沒有明確報(bào)道。

生物評(píng)價(jià)是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，利用整體動(dòng)物、離體組織、器官、微生物和細(xì)胞以及相關(guān)生物因子等為實(shí)驗(yàn)系，評(píng)價(jià)藥物有效性或毒性等生物活性，從而達(dá)到控制或評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量的目的[5]。而中藥質(zhì)量生物評(píng)價(jià)是在現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制體系的基礎(chǔ)上，引入生物評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)，以期從常規(guī)、化學(xué)、生物等多角度控制與評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量[6]。因此，為了更加真實(shí)反映瘀血痹片的臨床功效，有必要基于其抗炎鎮(zhèn)痛的功效，構(gòu)建生物評(píng)價(jià)方法，有效評(píng)價(jià)中藥的整體質(zhì)量。

COX-2作為誘導(dǎo)型合酶，是啟動(dòng)炎癥、發(fā)熱反應(yīng)的關(guān)鍵酶[7]。正常情況下的組織中幾乎不表達(dá)COX-2，各種損傷因素如化學(xué)、物理、外傷和細(xì)胞因子等可誘發(fā)其生成和活性增加，催化花生四烯酸生成前列腺素，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥和發(fā)熱[8]。此外非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥作為治療炎癥性疾病的最常用藥物之一，其發(fā)揮藥理作用的主要靶點(diǎn)就是COX-2[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采取了體外酶免疫法，分別測(cè)定了瘀血痹片及塞來昔布對(duì)COX-2的抑制作用。以COX-2抑制率作為生物質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，并通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)瘀血痹片的抗炎鎮(zhèn)痛作用，以期為瘀血痹片的生物質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)，HY-2振蕩器(金壇市科析儀器有限公司)；COX抑制劑篩選檢測(cè)試劑盒(cayman，批號(hào)：701080)，6 mm打孔器，瘀血痹片(遼寧華潤(rùn)本溪有限公司，批號(hào)：20210303)，塞來昔布(輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：DK1011)，濃度分別為99%、99.5%的二甲苯、冰醋酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)小鼠96只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。

2 方 法

2.1 瘀血痹片抗炎鎮(zhèn)痛活性測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品(塞來昔布)溶液的配制：反應(yīng)緩沖液溶解塞來昔布配成濃度分別為1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的溶液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 瘀血痹片供試品溶液的配制：用反應(yīng)緩沖液溶解瘀血痹片配成濃度分別為40、20、10、5、2.5 mg/mL的溶液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 前列腺素(PG)標(biāo)準(zhǔn)曲線：以S1～S8的B/B0值(y，%)對(duì)PG濃度的對(duì)數(shù)(x)作圖，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y = -41.194x + 153.88(r = 0.9928)，結(jié)果顯示，在15.6～2000 pg/mL內(nèi)，B/B0(%)值與PG濃度對(duì)數(shù)值有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 對(duì)照品、供試品COX-2抑制作用測(cè)定：設(shè)置背景管、COX-2 100%初始活性管、塞來昔布對(duì)照品管、瘀血痹片供試品管。在反應(yīng)管中加入反應(yīng)緩沖液及亞鐵血紅素160 μL和10 μL，在背景管中加入失活的COX-2 10 μL、反應(yīng)緩沖液10 μL，在COX-2 100%初始活性管中加入COX-2 10 μL、反應(yīng)緩沖液10 μL，在對(duì)照管和供試品管分別加入COX-2 10 μL、不同濃度對(duì)照品、供試品10 μL，37 ℃孵育10 min，在所有的反應(yīng)管中加入花生四烯酸10 μL，迅速混合，37 ℃孵育2 min，于各反應(yīng)管中再加入SnCl230 μL終止反應(yīng)。室溫孵育5 min后，將上述所得背景溶液以ELISA緩沖液稀釋100倍。其它樣品組溶液以ELISA緩沖液稀釋2000倍，供檢測(cè)使用。

96孔酶標(biāo)板設(shè)孔后于搖床上室溫孵育18 h。洗滌緩沖液沖洗后，各孔中加入Ellman’s試劑200 μL，COX-2 100%初始活性孔中再加入PG-AChE 5 μL，專用塑料膜封上，暗室振搖孵育30～60 min，在酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。B0的OD值應(yīng)在0.3～0.8 AU內(nèi)(扣除空白)。

2.1.5 對(duì)照品、供試品COX-2抑制率(I%)的計(jì)算：校準(zhǔn)后各孔的OD值與校準(zhǔn)后的B0的OD值比值B/B0(%)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出各供試品的PG濃度，并根據(jù)以下公式求出COX-2的抑制率I%。

I%=(CIA-Csample)/CIA×100%

2.1.6 對(duì)照品及供試品的量效曲線：分別以對(duì)照品、供試品的COX-2抑制率I%(y)對(duì)其各自濃度的對(duì)數(shù)(x)作圖，即得塞來昔布、瘀血痹片的量效曲線，并采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件概率單位回歸法(Probit)計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥：取小鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、塞來昔布組、瘀血痹片低劑量組、瘀血痹片中劑量組、瘀血痹片高劑量組，每組8只。空白組、模型組小鼠灌胃給予等劑量的蒸餾水，塞來昔布組小鼠灌胃塞來昔布80 mg/kg(相當(dāng)于60 kg體重人每日400 mg最大推薦劑量)，瘀血痹片低劑量組給予瘀血痹片1.5 g/kg(相當(dāng)于70 kg體重人每日7.5 g正常給藥劑量)、瘀血痹片中劑量組給予瘀血痹片3 g/kg(相當(dāng)于70 kg體重人每日7.5 g正常給藥劑量的2倍)、瘀血痹片高劑量組給予瘀血痹片6 g/kg(相當(dāng)于70 kg體重人每日7.5 g正常給藥劑量的3倍)，連續(xù)給藥7 d。

2.2.2 計(jì)算小鼠耳腫脹度及抑制率：末次給藥后20 min，將二甲苯涂于小鼠右耳廓兩面，左耳不涂作為對(duì)照(除空白組)。20 min后將小鼠脫頸處死，在左右兩耳的對(duì)稱位置，取下直徑為6 mm耳片并稱量。以耳廓腫脹率、抑制率表示藥物抗炎效應(yīng)[4]。腫脹率=(右耳廓重-左耳廓重)/左耳廓重×100%；腫脹抑制率=(模型組腫脹率-給藥組腫脹率)/模型組腫脹率×100%[10]。

2.3 小鼠扭體實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥：取48只小鼠，同“2.2.1”方法。

2.3.2 記錄扭體次數(shù)并計(jì)算藥物鎮(zhèn)痛率：末次給藥后30 min，空白組小鼠腹腔注射生理鹽水，其它組各小鼠注射0.6%冰醋酸溶液10 mL/kg，記錄小鼠第一次發(fā)生扭體的時(shí)間(潛伏期)、規(guī)定時(shí)間內(nèi)的扭體次數(shù)，并計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率。藥物鎮(zhèn)痛百分率=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%[11]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果與分析

3.1 瘀血痹片、塞來昔布對(duì)COX-2的抑制作用

3.1.1 瘀血痹片對(duì)COX-2抑制作用：瘀血痹片對(duì)COX-2抑制作用的量效關(guān)系見圖1、表1，隨著瘀血痹片濃度的升高，瘀血痹片對(duì)COX-2的抑制作用增大，具有劑量依賴關(guān)系。瘀血痹片對(duì)COX-2的半抑制濃度(IC50)約為20.32 mg/mL。

圖1 瘀血痹片對(duì)COX-2抑制作用的量效曲線

3.1.2 塞來昔布對(duì)COX-2抑制作用：塞來昔布對(duì)COX-2抑制作用的量效關(guān)系如圖2、表1，隨著塞來昔布濃度的增加，塞來昔布對(duì)COX-2抑制作用增強(qiáng)，并呈劑量依賴關(guān)系。塞來昔布對(duì)COX-2的半抑制濃度(IC50)約為0.4922 mg/mL。

圖2 塞來昔布對(duì)COX-2抑制作用的量效曲線

表1 瘀血痹片、塞來昔布對(duì)COX-2的作用

3.2 瘀血痹片對(duì)小鼠耳廓腫脹度變化的影響

各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳腫脹程度的變化見表2。模型組小鼠耳腫脹度較空白組顯著升高(P<0.05)，說明造模成功。與模型組相比，瘀血痹片、塞來昔布兩種藥均對(duì)炎癥具有抑制的作用(P<0.05)，其中瘀血痹片低劑量組的耳腫脹率與塞來昔布組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而中、高劑量組小鼠的耳腫脹率低于塞來昔布組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，瘀血痹片具有較好的抗炎作用。

3.3 瘀血痹片對(duì)小鼠扭體次數(shù)變化的影響

各實(shí)驗(yàn)組小鼠潛伏期及扭體次數(shù)的變化見表3。模型組小鼠15 min 內(nèi)的扭體次數(shù)較空白組顯著增多(P<0.05)，說明造模成功。與模型組相比，瘀血痹片與塞來昔布均有鎮(zhèn)痛的作用(P<0.05)，其中高劑量組瘀血痹片的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于塞來昔布組。結(jié)果表明，瘀血痹片可延長(zhǎng)小鼠第一次出現(xiàn)扭體的潛伏期，減少小鼠15 min內(nèi)的扭動(dòng)次數(shù)，具有鎮(zhèn)痛作用。

表2 瘀血痹片、塞來昔布對(duì)小鼠耳腫脹度的影響

表3 瘀血痹片、塞來昔布對(duì)小鼠扭體潛伏期、次數(shù)的影響

4 討 論

中成藥是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下以中藥材為原料[12-13]，按規(guī)定處方和制劑工藝加工而成的中藥制劑。中成藥品種眾多、劑型多樣、臨床應(yīng)用廣泛，其質(zhì)量直接影響臨床安全性和有效性[14]。目前，指紋圖譜結(jié)合多成分含量測(cè)定是普遍采用的有效性和一致性研究方法，以HPLC、TLC 及 LC/GC-MS技術(shù)最為常用，但由于中藥的多樣性和復(fù)雜性，還不能達(dá)到完全控制中成藥質(zhì)量的目的[15]。

中藥的生物質(zhì)量評(píng)價(jià)作為一種新質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法，通過藥物對(duì)于生物整體、離體器官、細(xì)胞、酶或分子等所起的作用，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，通過比較對(duì)照品和供試品的生物體或離體器官與組織的特定生物效應(yīng)[16]，從而完善和補(bǔ)充現(xiàn)有的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

本實(shí)驗(yàn)中以瘀血痹片為研究對(duì)象，基于COX-2活性對(duì)瘀血痹片的抗炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。生物質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示，瘀血痹片具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用，此外為了驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的瘀血痹片均具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用，其中高濃度的抗炎鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)，這也與生物質(zhì)量檢測(cè)的結(jié)果相符合，即瘀血痹片對(duì)COX-2的抑制率越高，在一定程度上說明了其抗炎鎮(zhèn)痛效果越強(qiáng)。鑒于生物測(cè)定結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明基于COX-2酶活性的生物效價(jià)檢測(cè)法具有一定的可行性，可以用來評(píng)價(jià)瘀血痹片的質(zhì)量，也期望能為現(xiàn)行的中成藥質(zhì)量控制方法提供補(bǔ)充和參考。