化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料快速篩選大黃降血脂活性成分

邊惠琴，武曉玉,2,3*，夏鵬飛,2,3，段文達(dá)，楊飛霞，李嬌嬌，趙 磊,2,3*

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省道地藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究與推廣工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州730000

傳統(tǒng)中藥活性成分篩選以活性追蹤為主，其以單體組分為篩選對(duì)象，存在工作量大、操作繁瑣、效率低等缺點(diǎn)。而與傳統(tǒng)活性追蹤法相比，細(xì)胞膜色譜(cell membrane chromatography，CMC)是近年發(fā)展迅速的一種生物親和色譜技術(shù)，具有特異性識(shí)別和高效分離的特性。CMC基本原理是將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠載體表面制成固定相，細(xì)胞膜受體可與藥物分子產(chǎn)生特異性結(jié)合，利用色譜分析法研究藥物分子與細(xì)胞膜受體的相互作用規(guī)律[1,2]。CMC集合了色譜技術(shù)、細(xì)胞分子生物學(xué)及受體藥理學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了色譜柱內(nèi)近似動(dòng)態(tài)地模擬藥物活性成分在體內(nèi)的作用過程；相比于常用吸附劑(如：離子交換樹脂、大孔吸附樹脂等)，CMC具有色譜分離與活性篩選相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，且操作方便、快速穩(wěn)定、靈敏度高，尤其適用于中藥等復(fù)雜體系的活性成分篩選。

細(xì)胞膜色譜制備時(shí)，根據(jù)細(xì)胞膜與硅膠載體的不同結(jié)合形式，可將其分為：物理吸附和化學(xué)修飾。物理吸附細(xì)胞膜生物親和色譜是利用細(xì)胞膜自身的融合作用和硅膠表面硅羥基的吸附作用制備而成；這種作用力比較弱，細(xì)胞膜易從載體上脫落，導(dǎo)致色譜柱壽命短[3,4]?；瘜W(xué)修飾細(xì)胞膜生物親和色譜是硅膠和細(xì)胞膜以共價(jià)鍵結(jié)合；硅膠的硅醇基與硅烷偶聯(lián)劑發(fā)生縮合反應(yīng)引入氨基，氨基與戊二醛分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，硅膠表面即可得到一端游離的醛基官能團(tuán)；細(xì)胞膜上含有大量氨基基團(tuán)，在室溫環(huán)境中易發(fā)生醛氨縮合反應(yīng)，從而達(dá)到硅膠和細(xì)胞膜共價(jià)連接的目的?；瘜W(xué)修飾細(xì)胞膜生物親和色譜中載體硅膠與細(xì)胞膜共價(jià)鍵連接、比較穩(wěn)定、細(xì)胞膜不易脫落，可延長色譜柱壽命[5,6]。

大黃是甘肅道地藥材，為臨床常用中藥之一；具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血脂等藥理作用[7-9]。許多學(xué)者及課題組前期研究均證實(shí)了大黃降血脂作用，且本課題組利用高脂血癥大鼠篩選出降血脂有效部位為30%乙醇提取液，但其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確[10-12]；課題組也制備了物理吸附L02肝細(xì)胞膜生物親和色譜材料，但其細(xì)胞膜脫落較嚴(yán)重，使用次數(shù)有限。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)制備APTES修飾硅膠為載體的L02肝細(xì)胞膜生物親和色譜材料，利用細(xì)胞膜表面的靶點(diǎn)對(duì)大黃30%乙醇提取液中化學(xué)成分進(jìn)行特異性吸附，HPLC分析吸附前后各化學(xué)成分色譜峰變化，以色譜峰峰面積變化率為依據(jù)，快速篩選大黃降血脂活性成分；并考察該材料的重復(fù)使用性能，為高通量篩選大黃降血脂藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

85-2型恒溫磁力攪拌器(海司樂儀器有限公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；Waters Alliance型高效液相色譜儀(四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器)；IMARK酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；ALPHA-T紅外光譜儀(布魯克儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國Beck-man-Coulter公司)；JY92-ⅡDN細(xì)胞破碎儀(寧波新芝科技股份有限公司)；DGX-9143BC-1型電熱恒溫干燥箱(上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

硅膠(5 μm，批號(hào)：20190316，中國青島美高化工有限公司)；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，批號(hào)：SLBB5978V)、油酸(批號(hào)：SLBRI87V)均購自SIGMA公司；磷酸鹽緩沖溶液(批號(hào)：AQ29629583)、鏈霉素/青霉素(批號(hào)：20201116)、胰酶(批號(hào)：20210629)、1640培養(yǎng)液(批號(hào)：AG29643109)、胎牛血清(批號(hào)：21040702)、1M Tris-HCl溶液(批號(hào)：20190821)、BCA蛋白試劑盒(批號(hào)：20191022)、Na+、K+-ATP酶試劑盒(批號(hào)：20200629)均購于Solarbio公司；BSA蛋白粉(批號(hào)：3131053，購于YESEN公司)；戊二醛(批號(hào)：EU2RDH1X，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(Merk公司)；人L02肝細(xì)胞(普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 L02肝脂肪變性細(xì)胞膜提取[13]

0.5 mmoL/L油酸刺激L02肝細(xì)胞，建立脂肪變性模型；利用差速離心法提取細(xì)胞膜，具體步驟如下：1 mL PBS洗滌L02肝脂肪變性細(xì)胞，棄去PBS；加1 mL 0.25%胰酶消化，輕輕吹打混勻，在鏡下觀察細(xì)胞全部脫落；再加1 mL PBS終止消化，160 × g、4 ℃下離心10 min，保留細(xì)胞沉淀；用1 mL PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次。細(xì)胞沉淀在50 mM Tris-HCl溶液中溶脹30 min，在破碎功率720 W、破碎時(shí)間2 s，冷卻間隔2 s的冰浴條件下，破碎3 min；細(xì)胞碎片混懸液在1 000 × g、4 ℃下離心10 min，保留上清液；上清液進(jìn)一步在12 000 × g、4 ℃下離心20 min，即得細(xì)胞膜沉淀。

1.4 化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料的制備及表征[5]

稱取硅膠2 g，在105 ℃活化2 h。

精密稱取活化硅膠1 g，加100 mL甲苯、1 mL APTES，N2保護(hù)、110 ℃條件下加熱回流12 h；反應(yīng)結(jié)束后，5 000 × g離心3 min，甲苯?jīng)_洗沉淀；沉淀加50 mL 5%戊二醛甲醇溶液，常溫下攪拌反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，5 000 × g離心3 min，甲醇沖洗沉淀；50 ℃真空干燥，得APTES修飾硅膠。

取APTES修飾硅膠0.1 g置于圓底燒瓶中，加5 mL L02肝脂肪變性細(xì)胞膜混懸液，渦旋3 min， 10 Mbar、0 ℃條件下攪拌反應(yīng)1 h；然后放入4 ℃冰箱中反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，1 000 × g、4 ℃條件下離心10 min，保留沉淀；PBS洗滌沉淀，1 000 × g，4 ℃條件下離心10 min，即得化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料。采用掃描電鏡和紅外光譜對(duì)其表征，并測(cè)定細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力。

1.5 吸附、解吸附

化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL大黃30%乙醇提取液，輕輕吹打并渦旋震蕩1 min，37 ℃孵育8 h；孵育液在1 000 × g，4 ℃下離心10 min，上清液即共孵育殘液。

化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL蒸餾水，輕輕吹打并渦旋震蕩1 min，1 000 × g，4 ℃下離心10 min，上清液即洗滌液。

化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL PBS溶液，37 ℃孵育6 h，孵育液在1 000 × g，4 ℃下離心10 min，上清液即解離液。

HPLC分析條件：ODS柱(15 mm ( 4.6 mm，μm)；流動(dòng)相：0.05%甲酸水(A)，乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～10 min，5%→0% B；10～15 min，20% B；15～30 min，20%→30% B；30～50 min，30%→50% B；50～60 min，50%→85% B；60～65 min，100% B；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.6 重復(fù)使用性能評(píng)價(jià)

為了考察該材料的重復(fù)使用性能，對(duì)化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料進(jìn)行6次吸附、解吸附實(shí)驗(yàn)，用細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力來評(píng)價(jià)重復(fù)使用性能。具體過程如下：該材料加1 mL大黃30%乙醇提取液，渦旋混勻，37 ℃孵育8 h；孵育液1 000 × g，4 ℃下離心10 min，保留沉淀；沉淀加1 mL PBS溶液，37 ℃孵育6 h，孵育液在1 000 × g，4 ℃下離心10 min，保留沉淀；測(cè)定沉淀(解吸附后)的細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力；重復(fù)測(cè)定6次。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征分析

硅膠、APTES修飾硅膠、化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料掃描電鏡圖見圖1。

圖1 掃描電鏡圖(×10 000)Fig.1 SEM images of silica gel (×10 000)注：a.硅膠；b.APTES修飾硅膠；c.化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料。Note:a.The silica gel;b.APTES modified silica gel;C.Chemical modification L02 liver membrane bioaffinity material.

圖1a中硅膠表面光滑，APTES修飾硅膠(圖1b)表面有一層絮狀物，較圖1a硅膠表面粗糙，推測(cè)為APTES烷氧基與硅膠硅羥基反應(yīng)所致。圖1c表面明顯覆蓋有一層細(xì)胞膜，說明APTES修飾硅膠上的游離醛基與細(xì)胞膜表面氨基發(fā)生醛氨縮合反應(yīng)，細(xì)胞膜鍵合到硅膠表面，推斷化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料制備成功。硅膠、APTES修飾硅膠、化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料紅外光譜圖見圖2。

圖2 紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectrum 注：a.硅膠；b.APTES修飾硅膠；c.化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料。Note:a.The silica gel;b.APTES modified silica gel;C.chemical modification L02 liver membrane bioaffinity material.

圖2a中3 434 cm-1處為Si-OH特征吸收峰，1 114 cm-1是Si-O-Si的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，802 cm-1和466 cm-1為Si-O-Si搖擺振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰。APTES修飾硅膠(圖2b)在2 942 cm-1處出現(xiàn)氨基硅烷的N-H伸縮振動(dòng)特征吸收峰，1 884 cm-1處出現(xiàn)N-H變形振動(dòng)吸收峰[14]。圖2c中3 442 cm-1吸收峰變寬，推測(cè)是Si-OH與細(xì)胞膜上-NH2蒂合所致，且802 cm-1和466 cm-1處Si-O-Si搖擺振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰也消失，說明硅膠與細(xì)胞膜上氨基發(fā)生反應(yīng)，所以化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料成功制備。

將硅膠、APTES修飾硅膠、化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料分別混懸于1 mL生理鹽水中，利用細(xì)胞膜蛋白試劑盒及Na+、K+-ATP酶試劑盒測(cè)定細(xì)胞膜蛋白含量和Na+、K+-ATP酶活力，結(jié)果見表1。

表1 細(xì)胞膜蛋白含量和 Na+、K+-ATP酶活力結(jié)果表(n=3)Table 1 Results of membrane protein content and Na+,K+-ATP activity(n=3)

由表1可知，硅膠和APTES修飾硅膠細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力均為0；化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料由于引入細(xì)胞膜，其細(xì)胞膜蛋白含量為0.385 2 mg/mL，Na+、K+-ATP酶活力為8.017 0 U/mgprot，表明化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料具有活性。

2.2 降脂活性成分篩選[15]

大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液、混合對(duì)照品溶液、洗滌液、解離液的HPLC圖見圖3。

由圖3a可知，大黃30%乙醇提取液中各化學(xué)成分色譜峰峰形對(duì)稱，分離度良好，說明優(yōu)化的色譜條件穩(wěn)定可行。圖3b可以看出化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料吸附后，部分化學(xué)成分色譜峰峰面積減小，說明該成分和材料發(fā)生了特異性吸附。通過與混合對(duì)照品溶液化學(xué)成分保留時(shí)間及紫外光譜學(xué)特征進(jìn)行對(duì)比，初步確定1、2、4、5、7、8、9、10、11號(hào)色譜峰分別為蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚；3、6號(hào)色譜峰為未知成分。圖3d洗滌液中沒有出現(xiàn)色譜峰，說明特異性吸附成分與化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料結(jié)合牢固。圖3e解離液中色譜峰極小，分析原因可能是特異性吸附成分和細(xì)胞膜上受體相結(jié)合，進(jìn)入到細(xì)胞膜內(nèi)部，進(jìn)而造成解離液中色譜峰較小。

將6份共孵育殘液進(jìn)樣分析，考察色譜峰峰面積的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

由表2可知，共孵育殘液中11個(gè)色譜峰峰面積RSD值均小于1%，表明在優(yōu)化色譜條件下，化學(xué)成分峰面積大小穩(wěn)定。

通過測(cè)定大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液中各化學(xué)成分峰面積，按照公式1計(jì)算色譜峰峰面積變化率，以峰面積變化率大于15%為依據(jù)，篩選特異性吸附成分，結(jié)果見表3。

圖3 HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms 注：a.大黃30%乙醇提取液；b.共孵育殘液；c.混合對(duì)照品溶液；d.洗滌液；e.解離液。 Note:a.30% ethanol extract of Rheum palmatum L.;b.Co-incubate residual liquid;c.Reference solution;d.Washing liquid;e.Desorption solution.

表2 共孵育殘液峰面積變化表(n=6)Table 2 Peak area change of co-incubate residual liquid (n=6)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

表3 化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料吸附差異結(jié)果表 Table 3 Results of adsorption difference of chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material

由表3可知，大黃30%乙醇提取液中有11個(gè)色譜峰峰面積變化率大于15%，說明化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料對(duì)11種化學(xué)成分發(fā)生特異性吸附，包括4個(gè)蒽醌糖苷、2個(gè)未知成分(3號(hào)和6號(hào)色譜峰)及5個(gè)蒽醌苷元。1～ 4號(hào)色譜峰變化率雖較7～11號(hào)小，但實(shí)際峰面積差值遠(yuǎn)比7～11號(hào)大；造成其變化率小的原因在于：峰面積變化率計(jì)算公式中，大黃30%乙醇溶液峰面積在分母位置，峰面積大進(jìn)而導(dǎo)致變化率小。結(jié)合峰面積變化率及峰面積差值，11種活性成分中1～4號(hào)色譜峰是主要的特異性成分，即蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及未知成分1可作為潛在活性成分進(jìn)行降血脂活性驗(yàn)證。

為進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)解離液中特異性吸附成分進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)部的推測(cè)，將化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料加1 mL PBS溶液，超聲10 min(超聲功率16 kHz)，1 000 × g，4 ℃下離心10 min，收集上清液，HPLC色譜圖見圖4。

由圖4可看出，采用超聲法對(duì)化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料表面細(xì)胞膜進(jìn)行破碎后，PBS溶液中出現(xiàn)被特異性吸附的11個(gè)化學(xué)成分色譜峰，證實(shí)上述推斷合理性。

2.3 重復(fù)使用性能評(píng)價(jià)

化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料進(jìn)行6次吸附實(shí)驗(yàn)后，細(xì)胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力結(jié)果見圖5。

圖4 化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料超聲破碎液HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of ultrasonic crushing solution of chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material

圖5 化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料重復(fù)使用性能評(píng)價(jià)Fig.5 Effect of the regeneration cycles on the chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material注：a.細(xì)胞膜蛋白含量；b.Na+、K+-ATP酶活力。Note：a.Cell membrane protein content;b.Na+,K+-ATP ezyme activity.

由圖5可知，化學(xué)修飾L02肝細(xì)胞膜生物親和材料重復(fù)使用6次，細(xì)胞膜蛋白含量下降11.1%，Na+、K+-ATP酶活力下降12.1%，兩者均未發(fā)生顯著降低，說明該材料重復(fù)使用性能良好。

3 結(jié)論

硅膠與APTES、戊二醛依次發(fā)生交聯(lián)、縮合反應(yīng)，通過共價(jià)鍵將硅膠和細(xì)胞膜進(jìn)行連接，制備APTES修飾硅膠為載體的L02細(xì)胞膜生物親和材料，掃描電鏡和紅外光譜均證明制備成功。APTES修飾L02細(xì)胞膜生物親和材料對(duì)大黃30%乙醇提取液進(jìn)行吸附，結(jié)果顯示11個(gè)成分可被特異性結(jié)合；包括4個(gè)蒽醌糖苷、5個(gè)蒽醌苷元及2個(gè)未知成分，其中蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及未知成分1是主要的特異性成分，可作為潛在活性成分進(jìn)行降血脂活性驗(yàn)證。但由于細(xì)胞膜表面靶點(diǎn)眾多，本材料僅適用于降血脂活性成分的初步篩選；且后期需要利用LC-MS/MS對(duì)2個(gè)未知成分進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)鑒定。相比于物理吸附L02細(xì)胞膜生物親和材料，該材料通過引入化學(xué)共價(jià)鍵，一定程度上避免了細(xì)胞膜的脫落，延長使用次數(shù)，可用于大黃降血脂活性成分的快速篩選，該材料也可為其他降血脂活性成分的快速篩選提供參考。