秦皮甙對幼鼠肺炎鏈球菌肺炎的改善作用及機(jī)制

張鵬，張宇晨，王潤智

（1.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院兒科，河南平頂山 467000；2.河南省開封市人民醫(yī)院藥劑科，河南開封 475000）

肺炎是常見的肺部感染性疾病，包括終末氣道、肺泡腔及肺間質(zhì)等在內(nèi)的肺實(shí)質(zhì)炎癥[1-2]。肺炎鏈球菌肺炎屬于細(xì)菌性肺炎，由肺炎鏈球菌引起。肺炎鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌，正常情況下該菌定植在人體上呼吸道，當(dāng)機(jī)體被病毒感染或免疫力低下時，引起敗血癥、肺炎、中耳炎、腦膜炎[3]。據(jù)世界衛(wèi)生部門統(tǒng)計(jì)，每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌肺炎，其中，5歲以下兒童是肺炎鏈球菌感染率最高的群體，每年死于肺炎鏈球菌感染的5歲以下兒童約為100萬人[4]。肺炎鏈球菌肺炎常使用抗生素治療，隨著其對抗生素耐藥性的增加，尋找非抗生素類藥物治療肺炎鏈球菌肺炎十分重要。秦皮是木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophyllaHance、白 蠟 樹Fraxinus chinensisRoxb.、尖葉白蠟樹Fraxinus chinensisRoxb.var.acuminata Lingelsh.或宿柱白蠟樹Fraxinus stylosaLingelsh.的枝皮或干皮，味苦、澀，性寒，入大腸、肝、膽經(jīng)，可清熱燥濕，祛痰止咳，涼肝明目。秦皮甙是從秦皮中提取的一種香豆素類化合物，具有抗炎、抗氧化等藥理作用[5]。既往有動物實(shí)驗(yàn)研究表明，秦皮甙有明顯地改善脂多糖誘導(dǎo)的肺炎、因肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的重癥肺炎的作用[6-7]。這提示其在肺炎治療中具有潛在的應(yīng)用價值。但目前關(guān)于秦皮甙在肺炎鏈球菌肺炎患兒中的應(yīng)用研究少有報道。因此，本研究通過建立肺炎鏈球菌肺炎幼鼠模型，探討其對肺炎鏈球菌肺炎肺部的保護(hù)功能及抗炎作用，以期為臨床肺炎鏈球菌肺炎患兒治療提供實(shí)驗(yàn)支持，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD雄性大鼠50只，3周齡，體質(zhì)量（50±5）g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004。幼鼠購入后飼養(yǎng)于河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，使用許可證號：SYXK（豫）2016-0006，保持環(huán)境清潔通風(fēng)，室內(nèi)溫度（23±2）℃、濕度（60±5）%、明暗周期12 h/12 h循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物、菌株、試劑與儀器秦皮甙（純度≥98%；分子式：C16H18O10；分子量：370.31；規(guī)格：20 mg/支；成都曼斯特生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：191117）。肺炎鏈球菌菌株CMCC（B）31693（中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心）。Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）通路激活劑RO8191（美國MedCheme Express）；白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國Sigma公司）；兔抗鼠JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT5、p-STAT5、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（SOCS3）單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（美國Abcam公司）。RM2145型自動切片機(jī)（德國徠卡公司）；DM-35TV光學(xué)顯微鏡（江西道美智能科技有限公司）。

1.3 分組與建模將50只幼鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、秦皮甙組、激活劑組、激活劑+秦皮甙組，每組10只。除正常組外，其他各組幼鼠參照

文獻(xiàn)研究[8]建立肺炎鏈球菌肺炎模型。具體方法：采用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg腹腔注射麻醉，用無菌針頭刺破鼻黏膜后，從鼻腔緩慢滴入0.5麥?zhǔn)蠞舛龋?.5×108CFU/mL）鏈球菌菌液50 μL，待其自動吸入。正常組幼鼠刺破鼻黏膜后，從鼻腔滴入50 μL生理鹽水。前期經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)行肺組織病理切片證實(shí)造模成功與否。

1.4 干預(yù)方法建模2 d后，參照藥理實(shí)驗(yàn)中動物間的等效劑量換算方法[9]，依據(jù)Ma等[10]的用量，秦皮甙組灌胃20 mg/kg秦皮甙，激活劑組灌胃30 mg/kg RO8191，激活劑+秦皮甙組灌胃30 mg/kg RO8191和20 mg/kg秦皮甙，正常組與模型組灌胃等體積生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥7 d。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量（W/D）比值干預(yù)1周后，麻醉幼鼠，剖開頸部與胸腔，分離左肺與右肺，清洗干凈后備用。各組取左肺（5只），稱濕質(zhì)量（W），然后轉(zhuǎn)移至65℃烘箱干燥48 h，稱干質(zhì)量（D），計(jì)算濕質(zhì)量/干質(zhì)量（W/D）比值。

1.5.2 ELISA法檢測肺組織勻漿IL-1β、IL-6、IL-10水平取右肺組織（5只），剪碎，加入9倍體積的生理鹽水，于勻漿管中，充分研磨，使組織勻漿化，以3 000 r/min（離心半徑8 cm）、4℃離心15 min，取上清液。按照IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出IL-1β、IL-6、IL-10的濃度。

1.5.3 肺組織病理學(xué)變化及肺損傷評分取左肺（5只），4%多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm），HE染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行肺損傷評分。評分標(biāo)準(zhǔn)[11]見表1。總分為12分，得分越高，病理變化越嚴(yán)重。每張切片取5個視野，求平均值作為病理評分。

表1 肺損傷評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria of lung injury

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肺組織JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT5、p-STAT5、SOCS3蛋白相對表達(dá)水平取剩余右肺組織80 mg，研磨后，加蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心，取上清；二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量，100℃水浴使蛋白變性；進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h；洗膜后分別加入1∶1 000稀釋的

JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT5、p-STAT5、SOCS3等一抗，4℃孵育過夜；洗膜后加入1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影，采用ImageJ軟件分析圖像。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠一般情況比較干預(yù)1周后，觀察各組幼鼠的一般情況。正常組幼鼠精神良好，皮毛光亮，進(jìn)食、飲水及活動正常；模型組、激活劑組幼鼠體型消瘦、精神倦怠，活動減少；激活劑+秦皮甙組、秦皮甙組幼鼠精神狀況較模型組好，活動增加。

2.2 各組幼鼠肺組織W/D比值比較肺組織W/D比值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組、秦皮甙組、激活劑組、激活劑+秦皮甙組肺組織W/D比值升高（均P＜0.05）；與模型組比較，秦皮甙組、激活劑+秦皮甙組肺組織W/D比值降低，激活劑組W/D比值升高（均P＜0.05），且秦皮甙組肺組織W/D比值低于激活劑+秦皮甙組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表2。

表2 各組幼鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量（W/D）比值比較Table 2 Comparison of W/D ratio of young rat lung tissues in various groups （±s）

表2 各組幼鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量（W/D）比值比較Table 2 Comparison of W/D ratio of young rat lung tissues in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與秦皮甙組比較；④P＜0.05，與激活劑組比較

W/D 2.65±0.51 5.82±0.71①4.10±0.49①②6.76±0.73①②③4.78±0.58①②③④21.772<0.001組別正常組模型組秦皮甙組激活劑組激活劑+秦皮甙組F值P值鼠數(shù)/只5 5 5 5 5

2.3 各組幼鼠肺組織勻漿IL-1β、IL-6、IL-10水平比較肺組織勻漿IL-1β、IL-6、IL-10水平組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組、秦皮甙組、激活劑組、激活劑+秦皮甙組IL-1β、IL-6水平升高，IL-10水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，秦皮甙組、激活劑+秦皮甙組IL-1β、IL-6水平降低，IL-10水平升高，激活劑組IL-1β、IL-6水平升高，IL-10水平降低（均P＜0.05）；且秦皮甙組IL-1β、IL-6水平低于激活劑+秦皮甙組，IL-10水平秦皮甙組高于激活劑+秦皮甙組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表3。

表3 各組幼鼠肺組織勻漿IL-1β、IL-6、IL-10水平比較Table 3 Comparison of IL-1β，IL-6 and IL-10 levels in lung tissue homogenates in various groups of young rats （s，ng·L-1）

表3 各組幼鼠肺組織勻漿IL-1β、IL-6、IL-10水平比較Table 3 Comparison of IL-1β，IL-6 and IL-10 levels in lung tissue homogenates in various groups of young rats （s，ng·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與秦皮甙組比較；④P＜0.05，與激活劑組比較

組別正常組模型組秦皮甙組激活劑組激活劑+秦皮甙組F值P值IL-10 90.55±9.24 36.78±6.41①66.15±7.32①②24.32±6.02①②③53.58±6.27①②③④13.458<0.001鼠數(shù)/只5 5 5 5 5 IL-1β 126.48±13.66 213.59±21.34①147.37±15.46①②240.28±24.51①②③175.25±18.15①②③④34.556<0.001 IL-6 208.45±24.75 319.55±32.12①223.15±25.41①②342.13±35.46①②③287.01±28.02①②③④25.672<0.001

2.4 各組幼鼠肺組織病理學(xué)變化比較HE染色顯示：正常組幼鼠支氣管黏膜結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，肺泡壁正常；模型組、激活劑組支氣管黏膜上皮脫落或壞死，肺泡壁增厚并水腫，肺泡腔內(nèi)有大量滲出物，肺泡間隔內(nèi)毛細(xì)血管彌漫性擴(kuò)張并充血；激活劑+秦皮甙組肺泡間隔內(nèi)少量水腫，肺泡腔內(nèi)少量滲出物；秦皮甙組幼鼠支氣管黏膜結(jié)構(gòu)無明顯水腫充血，黏膜上皮有少量脫落、壞死。具體結(jié)果見圖1。

圖1 各組幼鼠肺組織病理學(xué)變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of pathological changes of young rat lung tissues in various groups（by HE staining，×200）

2.5 各組幼鼠肺組織病理學(xué)評分比較肺組織病理學(xué)評分組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組、秦皮甙組、激活劑組、激活劑+秦皮甙組肺組織病理學(xué)評分升高（均P＜0.05）；與模型組比較，秦皮甙組、激活劑+秦皮甙組肺組織病理學(xué)評分降低，激活劑組肺組織病理學(xué)評分升高（均P＜0.05），且秦皮甙組肺組織病理學(xué)評分低于激活劑+秦皮甙組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表4。

表4 各組幼鼠肺組織病理學(xué)評分比較Table 4 Comparison of lung histopathological score in various of young rats groups （±s，分）

表4 各組幼鼠肺組織病理學(xué)評分比較Table 4 Comparison of lung histopathological score in various of young rats groups （±s，分）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與秦皮甙組比較；④P＜0.05，與激活劑組比較

病理評分2.09±0.57 8.76±0.93①4.62±0.56①②10.02±1.11①②③6.36±0.72①②③④12.124<0.001組別正常組模型組秦皮甙組激活劑組激活劑+秦皮甙組F值P值鼠數(shù)/只5 5 5 5 5

2.6 各組幼鼠肺組織JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT5、p-STAT5、SOCS3蛋 白 相 對表達(dá)水平比較p-JAK2、p-STAT1、p-STAT5、SOCS3蛋白相對表達(dá)水平組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組、秦皮甙組、激活劑組、激活劑+秦皮甙組p-JAK2、p-STAT1、p-STAT5蛋白相對水平升高，SOCS3蛋白相對表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，秦皮甙組、激活劑+秦皮甙組p-JAK2、p-STAT1、p-STAT5蛋白相對表達(dá)水平降低，SOCS3蛋白相對表達(dá)水平升高，激活劑組p-JAK2、p-STAT1、p-STAT5蛋白相對表達(dá)水平升高，SOCS3蛋白相對表達(dá)水平降低（均P＜0.05），且秦皮甙組p-JAK2、p-STAT1、p-STAT5蛋白相對表達(dá)水平低于激活劑+秦皮甙組，SOCS3蛋白相對表達(dá)水平高于激活劑+秦皮甙組（均P＜0.05）。JAK2、STAT1、STAT5蛋白相對表達(dá)水平組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具體結(jié)果見表5、圖2。

表5 各組幼鼠肺組織JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT5、p-STAT5、SOCS3蛋白相對表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of relative protein expression levels of JAK2，p-JAK2，STAT1，p-STAT1，STAT5，p-STAT5，SOCS3 in yong rat lung tissues of various groups

表5 各組幼鼠肺組織JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT5、p-STAT5、SOCS3蛋白相對表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of relative protein expression levels of JAK2，p-JAK2，STAT1，p-STAT1，STAT5，p-STAT5，SOCS3 in yong rat lung tissues of various groups

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與秦皮甙組比較；④P＜0.05，與激活劑組比較

組別正常組模型組秦皮甙組激活劑組激活劑+秦皮甙組F值P值SOCS3 1.10±0.11 0.46±0.05①0.91±0.09①②0.35±0.05①②③0.76±0.08①②③④20.358<0.001鼠數(shù)/只5 5 5 5 5 JAK2 1.21±0.12 1.20±0.12 1.21±0.13 1.22±0.12 1.21±0.12 0.264 0.799 p-JAK2 0.35±0.04 0.90±0.09①0.45±0.06①②1.12±0.11①②③0.75±0.08①②③④21.234<0.001 STAT1 1.11±0.10 1.10±0.10 1.12±0.11 1.12±0.10 1.11±0.10 0.158 0.878 p-STAT1 0.34±0.04 0.78±0.08①0.41±0.05①②0.99±0.10①②③0.55±0.06①②③④16.753<0.001 STAT5 1.12±0.11 1.11±0.10 1.11±0.11 1.12±0.10 1.10±0.10 0.316 0.760 p-STAT5 0.36±0.04 0.81±0.08①0.46±0.05①②1.01±0.10①②③0.69±0.07①②③④19.372<0.001

圖2 各組幼鼠肺組織JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT5、p-STAT5、SOCS3的Western Blot電泳條帶灰度值比較Figure 2 Comparison of gray levels of JAK2，p-JAK2，STAT1，p-STAT1，STAT5，p-STAT5，SOCS3 in lung tissues in various groups of young rats by Western Blot

3 討論

炎癥因子異常表達(dá)是引起肺炎及其并發(fā)癥的主要原因，其中，IL-1β和IL-6是主要促炎因子。臨床上常以IL-1β表達(dá)水平的高低來判斷肺損傷的程度[12]。IL-6不僅能夠反映肺損傷的嚴(yán)重程度，且對急性肺損傷患者預(yù)后具有較高的預(yù)測價值[13]。有研究[14]表明，肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織IL-6的含量明顯升高。而IL-10是機(jī)體常見的抑炎因子，通過調(diào)控抑炎因子的表達(dá)，能夠平衡機(jī)體的炎癥反應(yīng)[15]。

本研究結(jié)果顯示，秦皮甙治療后的肺炎鏈球菌肺炎幼鼠精神狀況明顯改善、活動量增加，肺組織W/D值降低，肺組織勻漿IL-1β和IL-6水平降低，IL-10水平升高，表明秦皮甙具有抗肺炎鏈球菌肺炎作用，且通過抑制促炎因子表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子表達(dá)發(fā)揮作用。本研究中，秦皮甙治療后的肺組織病理學(xué)損傷改善，肺組織病理評分降低，表明秦皮甙治療對肺炎鏈球菌肺炎幼鼠肺部具有保護(hù)作用。

JAK/STAT信號通路包括JAKs家族和STATs家族，JAKs細(xì)胞因子與其受體結(jié)合，JAKs激酶聚集，相鄰JAKs彼此磷酸化而被激活，激活后的JAKs使受體產(chǎn)生STATs結(jié)合區(qū)域，STATs磷酸化形成二聚體，進(jìn)行信號傳遞[16]。SOCS家族是JAK/STAT通路的負(fù)調(diào)控蛋白，腫瘤壞死因子等多種細(xì)胞因子可以通過JAK/STAT通路誘導(dǎo)SOCS蛋白家族的表達(dá)，SOCS又特異性地負(fù)反饋抑制JAK/STAT通路的活化，形成細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反饋調(diào)節(jié)環(huán)[17]。炎癥介質(zhì)過度表達(dá)是肺炎鏈球菌肺炎的主要發(fā)病機(jī)制之一，IL-6、IL-1β是引起肺炎鏈球菌肺炎器官損傷的重要炎性介質(zhì)，JAK/STAT信號通路是調(diào)控炎癥基因表達(dá)的樞紐，在肺炎發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。JAK/STAT信號通路活化后可促進(jìn)IL-6、IL-1β等炎性介質(zhì)釋放，通過促炎因子相互誘生和炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷。因此，抑制JAK/STAT信號通路，可作為減輕肺炎鏈球菌肺炎肺損傷的重要途徑[18]。

本研究應(yīng)用JAK/STAT信號通路特異性激活劑干預(yù)肺炎鏈球菌肺炎幼鼠，結(jié)果顯示，肺組織p-JAK2、p-STAT1、p-STAT5蛋白相對表達(dá)水平較模型組明顯升高，而SOCS3蛋白相對表達(dá)水平明顯降低，同時促炎因子IL-6、IL-1β水平升高，肺組織損傷進(jìn)一步加重，表明激活JAK/STAT信號通路，可促進(jìn)肺炎鏈球菌肺炎病情加重；而秦皮甙組p-JAK2、p-STAT1、p-STAT5蛋白相對水平低于模型組，SOCS3蛋白相對表達(dá)水平高于模型組，表明秦皮甙可能參與調(diào)控JAK/STAT信號通路；在使用激活劑激活該通路基礎(chǔ)上聯(lián)合使用秦皮甙，結(jié)果顯示秦皮甙的治療作用明顯減弱，證實(shí)了秦皮甙對JAK/STAT信號通路的抑制作用，表明秦皮甙對肺炎鏈球菌肺炎幼鼠的改善作用可能與抑制JAK/STAT信號通路有關(guān)。

綜上所述，秦皮甙可明顯抑制肺炎鏈球菌肺炎幼鼠的炎癥反應(yīng)，減輕肺組織損傷，發(fā)揮肺保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制JAK/STAT信號通路有關(guān)。