轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1對(duì)結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)生存影響的初步研究

李軍麗 姜愛(ài)國(guó) 付麗麗 占玲俊 趙愛(ài)華

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)是一種胞內(nèi)寄生病原菌，其感染后主要在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖。鐵是M.tb生存繁殖的必要條件，M.tb本身胞內(nèi)缺鐵，必須通過(guò)宿主獲得自身生長(zhǎng)繁殖所需要的鐵元素。M.tb毒力和生長(zhǎng)機(jī)制的研究表明，其在缺鐵情況下生長(zhǎng)停滯，且逐漸獲得與低氧生長(zhǎng)條件下相似的休眠表型。與野生型和鐵儲(chǔ)存蛋白bfrB回補(bǔ)菌株比較，M.tbbfrB基因缺失突變株表現(xiàn)出對(duì)小鼠肺部侵染毒力和持久性的降低[1]。此外，筆者團(tuán)隊(duì)前期在探討M.tb感染與機(jī)體鐵代謝水平的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載M.tb感染小鼠肺、脾臟和肝臟等組織器官荷菌量及結(jié)核病理性改變均明顯高于單純M.tb感染對(duì)照組[2]。這些結(jié)果均表明宿主鐵水平與M.tb的毒力及其在宿主體內(nèi)復(fù)制之間存在關(guān)聯(lián)，提示宿主鐵代謝相關(guān)基因可能成為抗結(jié)核新靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)，即CD71分子，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由兩個(gè)同源二聚體的亞基通過(guò)兩條二硫鍵交聯(lián)而成[3,4]。TfR主要功能是通過(guò)與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)相互作用參與和介導(dǎo)鐵的吸收，是細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[5，6]。目前已發(fā)現(xiàn)兩種TfR，即在結(jié)構(gòu)和功能上都比較相似的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TfR1)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(transferrin receptor 2，TfR2)。TfR1被廣泛關(guān)注并大量報(bào)道與貧血、神經(jīng)退行性疾病以及癌癥等的發(fā)生有關(guān)，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和腎癌中，腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)TfR1后對(duì)鐵元素的吸收速度加快，而相應(yīng)的患者預(yù)后也表現(xiàn)較差[7～11]。同時(shí)，越來(lái)越多的報(bào)道顯示，TfR1的異常表達(dá)與傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展也同樣密切相關(guān)，且研究主要圍繞病原菌感染與宿主細(xì)胞鐵代謝穩(wěn)態(tài)間的相互影響。

本研究則在前期的基礎(chǔ)上通過(guò)細(xì)胞水平探討鐵吸收代謝相關(guān)受體TfR1與M.tb胞內(nèi)生存關(guān)系，進(jìn)一步明確TfR1在M.tb感染期間的作用機(jī)制，為T(mén)fR1成為抗結(jié)核潛在新靶點(diǎn)奠定研究基礎(chǔ)。

材料與方法

1.細(xì)胞、菌株與動(dòng)物：RAW 264.7小鼠單核-吞噬細(xì)胞白血病細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。M.tb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(菌株號(hào)：93009)和恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis，M.smegmatis)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。6～8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6N小鼠，體質(zhì)量為18～20g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK (京)-2016-0006]。

2.主要試劑：右旋糖酐鐵注射液購(gòu)自江西創(chuàng)導(dǎo)動(dòng)物保健品有限公司，山羊血清、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司，GAPDH一抗、TfR1一抗、HRP酶標(biāo)二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，PVDF膜、HRP ECL發(fā)光液購(gòu)自德國(guó)Millipore公司，TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒和2×TransTaq?High Fidelity (HiFi) PCR SuperMix Ⅱ (-dye)試劑盒購(gòu)自北京TransGen Biotech公司，F(xiàn)ITC熒光染料購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，Trypsin-EDTA (0.25%)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，中性羅氏培養(yǎng)管購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

3.鐵過(guò)載小鼠模型的建立：采用完全隨機(jī)法將20只C57BL/6N小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組5只。低、中、高劑量組分別經(jīng)腹腔注射右旋糖酐鐵3.75、7.50、15.00毫克/次，陰性對(duì)照組則經(jīng)腹腔注射等體積0.9%NaCl注射液，3 次/周，共計(jì)4周。定期觀察小鼠生長(zhǎng)及精神狀態(tài)，稱(chēng)重并記錄。

4.鐵過(guò)載小鼠模型M.tb感染：采用完全隨機(jī)法將24只C57BL/6N小鼠隨機(jī)分成鐵過(guò)載M.tb感染組、M.tb感染組、鐵過(guò)載模型組和正常對(duì)照組，每組6只。其中，M.tb感染小鼠經(jīng)尾靜脈注射100μl 1×106CFU/ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H37Rv單細(xì)胞菌懸液，空白對(duì)照組注射等劑量0.9%NaCl注射液。ABSL-3實(shí)驗(yàn)室正常飼喂，觀察并記錄小鼠臨床表現(xiàn)，感染后4周解剖小鼠。

5.肺部切片免疫組織化學(xué)分析：肺組織切片置于耐高溫玻片架，pH值6.0檸檬酸鹽緩沖液沒(méi)過(guò)玻片，微波加熱至沸騰進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加3% H2O2溶液覆蓋切片，室溫避光孵育10min后PBS洗滌3次。滴加500μl山羊血清，37℃封閉15min。每張切片滴加300μl按1∶1000稀釋的抗TfR1一抗，37℃孵育1h后PBS洗滌3次，隨后滴加300μl按1∶10000稀釋的HRP酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min后PBS洗滌3次。每張切片滴加500μl新鮮配制的DAB染色液，室溫避光孵育10min，流水漂洗終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染后經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固后觀察。

6.TfR1免疫印跡與qPCR分析：取10μl肺組織研磨液上清及蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)至SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離，采用半干法將蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜。TBST清洗PVDF膜3次，5% BSA溶液室溫封閉1h。PVDF膜經(jīng)1∶1000稀釋的抗TfR1一抗4℃孵育12h，TBST清洗3次，1∶5000稀釋的HRP酶標(biāo)二抗37℃孵育3h后進(jìn)行顯影檢測(cè)。無(wú)RNase水調(diào)平反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA模板濃度，按20μl反應(yīng)體系中10μl SuperMix，6.5μl去離子水，3μl 10倍稀釋的cDNA模板和0.5μl引物進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參基因，按95℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循環(huán)35次，72℃后延伸10min的反應(yīng)條件進(jìn)行TfR1基因擴(kuò)增。

7.RAW 264.7巨噬細(xì)胞吞噬與殺傷實(shí)驗(yàn)：FITC標(biāo)記的M.smegmatis以MOI 5分別與巨噬細(xì)胞共孵育1、2和4h，棄培養(yǎng)上清，PBS洗去胞外未吞噬菌株。每孔加入200μl 0.25%胰酶37℃消化5min，加入500μl DMEM完全培養(yǎng)基中和胰酶，吹散至單個(gè)細(xì)胞懸液。轉(zhuǎn)移至流式檢測(cè)管，室溫300×g離心5min、PBS洗滌，甲醛固定后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。M.smegmatis以MOI 5與巨噬細(xì)胞共孵育進(jìn)行體外感染，感染24h、48h和72h后PBS洗去胞外未吞噬菌株。每孔加入500μl 0.05% SDS裂解液，吹打混勻，裂解細(xì)胞1min。10倍倍比稀釋裂解液，分別取10-2、10-3和10-4稀釋液50μl均勻涂布于中性羅氏培養(yǎng)管，37℃培養(yǎng)并計(jì)算菌落數(shù)。

結(jié) 果

1.鐵過(guò)載小鼠肺組織TfR1未見(jiàn)明顯增加：如圖1A所示，不同劑量鐵過(guò)載小鼠肺部切片免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TfR1在低劑量、中劑量和高劑量鐵劑小鼠肺組織中表達(dá)水平未見(jiàn)顯著升高，與陰性對(duì)照小鼠肺組織比較無(wú)明顯變化。進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)對(duì)不同劑量鐵過(guò)載小鼠肺組織研磨液上清中TfR1表達(dá)豐度進(jìn)行分析，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)低劑量、中劑量和高劑量鐵劑小鼠肺組織TfR1表達(dá)水平與陰性對(duì)照小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，圖1C)。

圖1 鐵過(guò)載小鼠肺組織TfR1表達(dá)豐度檢測(cè)A.不同劑量鐵過(guò)載小鼠肺組織TfR1免疫組化分析(×20)。其中a為陰性對(duì)照組，b為低劑量組，c為中劑量組，d為高劑量組；B.不同劑量鐵過(guò)載小鼠肺組織研磨液上清TfR1免疫印跡檢測(cè)；C.不同劑量鐵過(guò)載小鼠肺組織研磨液上清TfR1免疫印跡檢測(cè)吸光度積分定量分析

2.M.tb感染增加小鼠肺組織TfR1表達(dá)：與正常對(duì)照小鼠和鐵過(guò)載模型小鼠比較，M.tb感染后小鼠肺組織TfR1表達(dá)水平均有所增加(圖2A)，且在鐵過(guò)載M.tb感染小鼠中增加最為顯著(圖2A)。同時(shí)，不同組別小鼠肺組織研磨液上清中TfR1蛋白質(zhì)免疫印跡顯示，表達(dá)豐度由高至低依次為鐵過(guò)載M.tb感染小鼠、M.tb感染小鼠、鐵過(guò)載模型小鼠及正常對(duì)照小鼠，且前兩者肺組織TfR1表達(dá)豐度顯著高于后兩者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 < 0.05，圖2B)。進(jìn)一步提取各組小鼠肺組織總RNA并進(jìn)行TfR1基因qPCR驗(yàn)證，顯示鐵過(guò)載M.tb感染小鼠和M.tb感染小鼠肺組織TfR1在基因表達(dá)水平上也顯著高于鐵過(guò)載模型小鼠及正常對(duì)照小鼠(P均<0.05，圖2C)。

圖2 M.tb感染小鼠肺組織TfR1表達(dá)豐度檢測(cè)A.不同實(shí)驗(yàn)組小鼠H37Rv感染后肺組織TfR1免疫組化分析(×20)。其中a為鐵過(guò)載M.tb感染組，b為M.tb感染組，c為鐵過(guò)載模型組，d為正常對(duì)照組；B.不同實(shí)驗(yàn)組小鼠H37Rv感染后肺組織TfR1免疫印跡檢測(cè)及吸光度積分定量分析；C.不同實(shí)驗(yàn)組小鼠H37Rv感染后肺組織TfR1基因qPCR檢測(cè)；與鐵過(guò)載模型組比較，*P<0.05,**P<0.001;與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.001；箭頭指示為T(mén)fR1免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)

3.TfR1缺失對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能無(wú)影響：siRNA技術(shù)構(gòu)建TfR1-/-RAW 264.7巨噬細(xì)胞系，以FITC標(biāo)記的M.smegmatis進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，TfR1基因缺失對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞吞噬功能無(wú)顯著性影響。FITC-M.smegmatis以MOI 5與RAW 264.7巨噬細(xì)胞共孵育1h、2h和4h后，TfR1-/-與TfR1+/+RAW 264.7巨噬細(xì)胞吞噬熒光菌株數(shù)量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。共孵育2h時(shí)，TfR1-/-和TfR1+/+RAW 264.7巨噬細(xì)胞吞噬FITC-M.smegmatis的細(xì)胞占比分別為38.9%和37.8%，空白對(duì)照組為0.79%(圖3B)。

圖3 下調(diào)TfR1表達(dá)對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響A.a至c依次為T(mén)fR1-/-與TfR1+/+RAW264.7巨噬細(xì)胞與FITC-M.smegmatis共孵育1、2和4h后，吞噬細(xì)胞流式計(jì)數(shù)結(jié)果；B.a至b依次為FITC-M.smegmatis與TfR1-/-及TfR1+/+ RAW264.7巨噬細(xì)胞共孵育2h后含熒光菌株的細(xì)胞占比，c為陰性對(duì)照

4.TfR1缺失增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷功能：siRNA技術(shù)構(gòu)建TfR1-/-RAW264.7巨噬細(xì)胞系，M.smegmatis分別感染TfR1-/-和TfR1+/+RAW 264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行殺傷功能分析。感染后24h、48h和72h，TfR1-/-RAW 264.7巨噬細(xì)胞殺傷功能明顯優(yōu)于TfR1+/+RAW 264.7巨噬細(xì)胞，不同殺傷時(shí)間點(diǎn)其殘余的M.smegmatis活菌數(shù)顯著低于后者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，圖4)。

圖4 下調(diào)TfR1表達(dá)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞殺傷功能的影響從左至右依次為T(mén)fR1+/+與TfR1-/-RAW264.7巨噬細(xì)胞分別感染M.smegmatis 24、48和72h后殘余活菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

討 論

細(xì)菌致病期間需要鐵，尤其是胞內(nèi)病原菌。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，鐵元素缺失會(huì)嚴(yán)重降低熱柯克斯體、嗜肺軍團(tuán)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌及其他胞內(nèi)菌的致病性[12]。事實(shí)上很多物種也采用在感染期間以扣留游離鐵作為主要的防御策略[13]。鐵與Tf和鐵蛋白(ferritin，F(xiàn)n)這類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存蛋白相結(jié)合不僅解決了可溶性問(wèn)題，而且限制了入侵病原菌對(duì)鐵元素的利用。然而，M.tb在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套特殊的鐵攝取系統(tǒng)來(lái)完成自身對(duì)鐵元素的需求。當(dāng)機(jī)體感染了M.tb以后，一方面，M.tb為了自身的生存需要從被感染的宿主獲得一定量的鐵元素，以保證其在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖。另一方面，其通過(guò)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子影響鐵反應(yīng)元件(iron responsive element，IRE) 和鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein，IRP) 的結(jié)合活性，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控TfR1的表達(dá)，促使細(xì)胞增加對(duì)鐵的攝取從而滿(mǎn)足其胞內(nèi)活性和生存所需鐵元素(圖5)。

圖5 M.tb感染對(duì)巨噬細(xì)胞鐵代謝及TfR1表達(dá)的影響鐵元素經(jīng)TfR1吸收進(jìn)入巨噬細(xì)胞，多余鐵元素一方面以Fn形式儲(chǔ)存或經(jīng)FPN1泵出細(xì)胞外，另一方面滿(mǎn)足胞內(nèi)M.tb生長(zhǎng)繁殖。同時(shí)，M.tb感染后產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子影響IRE和IRP的結(jié)合活性，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控TfR1的表達(dá)。TfR1.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1；Tf.轉(zhuǎn)鐵蛋白，F(xiàn)e3+.三價(jià)鐵離子；Fe2+.二價(jià)鐵離子；Steap3.金屬還原酶家族STEAP；Fn.鐵蛋白；TRPML1.瞬時(shí)受體電位通道；DMT1.二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；IRE.鐵反應(yīng)元件；IRP.鐵調(diào)節(jié)蛋白；FPN1.膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；Cp.銅藍(lán)蛋白；M.tb.結(jié)核分枝桿菌；mRNA.信使RNA

正常細(xì)胞鐵代謝過(guò)程中，位于細(xì)胞膜的TfR1可以識(shí)別Tf，將Tf-Fe3+復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)e3+被Steap3還原成Fe2+，再由二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(divalent metal transporter 1，DMT1)和瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channels，TRPML1)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)鐵池供細(xì)胞利用。鐵池中一部分鐵被氧化為Fe3+由Fn儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，剩余的鐵被膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin 1，F(xiàn)PN1)泵出細(xì)胞外，維持細(xì)胞內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞膜上TfR1的表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)鐵水平的影響和調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏時(shí)，TfR1 mRNA的穩(wěn)定性增加，使TfR1表達(dá)增加，從而增加細(xì)胞對(duì)鐵的攝取[14,15]。因此，TfR1水平反映了機(jī)體和細(xì)胞對(duì)鐵的需求[16～18]。

筆者團(tuán)隊(duì)前期在鐵過(guò)載小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，不同劑量鐵劑構(gòu)建的鐵過(guò)載模型小鼠與正常對(duì)照小鼠中外周血可溶性TfR均未見(jiàn)明顯改變，而本研究也同樣發(fā)現(xiàn)該兩組小鼠肺組織TfR1表達(dá)也均未見(jiàn)明顯增強(qiáng)[2]。相反，M.tb感染后該兩組小鼠肺組織TfR1表達(dá)豐度均顯著上調(diào)，且鐵過(guò)載M.tb感染小鼠TfR1表達(dá)豐度顯著高于M.tb感染小鼠組，這表明，M.tb感染導(dǎo)致小鼠肺部細(xì)胞上調(diào)表達(dá)TfR1以促進(jìn)宿主細(xì)胞對(duì)鐵的吸收，從而滿(mǎn)足M.tb胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖所需鐵元素，抑制TfR1表達(dá)則可能影響細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)與生存。而這些研究結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道分枝桿菌和埃立克體這類(lèi)胞內(nèi)病原菌主動(dòng)招募TfR1至含菌囊泡影響宿主細(xì)胞內(nèi)鐵池的動(dòng)態(tài)和存儲(chǔ)相一致[19,20]。

為了進(jìn)一步明確TfR1在M.tb感染期間的作用，筆者團(tuán)隊(duì)在細(xì)胞水平上進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。用小干擾RNA下調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞TfR1的表達(dá)，進(jìn)而用FITC-M.smegmatis分別感染TfR1表達(dá)下調(diào)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞，并進(jìn)行FITC熒光菌株吞噬計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在分別感染1、2和4h后，TfR1表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞內(nèi)熒光細(xì)菌數(shù)與未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但殺傷實(shí)驗(yàn)中，M.smegmatis分別感染24、48和72h后，TfR1下調(diào)樣本中殘留活菌數(shù)明顯低于未轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞。這些結(jié)果說(shuō)明在感染早期TfR1參與了M.tb的侵染，這可能與M.tb獲取鐵以利其在胞內(nèi)生存有關(guān)，TfR1的下調(diào)不影響M.tb的入侵，但抑制細(xì)菌其在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)與增殖。

依賴(lài)于TfR1的鐵攝取對(duì)于機(jī)體而言是必需的，TfR1基因敲除純合子小鼠在胚胎期即死亡[21]。因此，本研究針對(duì)TfR1僅進(jìn)行了細(xì)胞水平的初步探討，而為了進(jìn)一步驗(yàn)證TfR1的下調(diào)表達(dá)是否降低M.tb感染宿主鐵水平，從而抑制體內(nèi)M.tb生長(zhǎng)這一假設(shè)，則應(yīng)該構(gòu)建TfR1基因敲除雜合子小鼠TfR1-/+，從動(dòng)物水平上評(píng)價(jià)TfR1在M.tb感染期間的作用。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TfR1下調(diào)導(dǎo)致機(jī)體鐵攝取障礙，從而抑制體內(nèi)M.tb增殖的分子機(jī)制，為T(mén)fR1作為抗結(jié)核感染新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。