miRNAs在膿毒癥致MODS模型犬心力衰竭時(shí)的研究

張 健 黃 祥 李發(fā)鵬 蘆顏美 邢 強(qiáng) 姜 濤 湯寶鵬

膿毒癥(sepsis)是臨床上常見(jiàn)的一種疾病，發(fā)病兇險(xiǎn)，治療費(fèi)用高，病死率高達(dá)20%[1]。膿毒癥被認(rèn)為是一種綜合的炎癥反應(yīng)綜合征而不是特定的疾病[2]。因?yàn)闄C(jī)體發(fā)生了感染，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體功能處于失衡狀態(tài)，從而發(fā)生危及生命的一種器官功能障礙[3]。一旦發(fā)生膿毒癥，心臟不良事件的發(fā)生率明顯增高[4]。

多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)指的是機(jī)體遭受?chē)?yán)重創(chuàng)傷、休克或感染后，同時(shí)或序貫出現(xiàn)2個(gè)或更多的器官功能障礙或衰竭，不能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的臨床綜合征[5]。1995年，Marshall等[6]對(duì)ICU的MODS流行病學(xué)調(diào)查研究，研究提出的評(píng)分系統(tǒng)包含6個(gè)臟器組織系統(tǒng)——心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、血液、肝臟、呼吸和腎臟系統(tǒng)。13%的MODS患者(占ICU患者總數(shù)的7%)病死率超過(guò)70%。周榮斌對(duì)急診成人MODS的流行病學(xué)研究中得出，在急診成人MODS患者中，心臟功能產(chǎn)生障礙發(fā)生心力衰竭(heart failure, HF)的發(fā)生率高達(dá)61.2%[7]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以作為心臟疾病的一種標(biāo)志物，miRNAs的相關(guān)分型如miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499在心肌組織中均有表達(dá)[8～18]。對(duì)于以上基因是否在MODS犬發(fā)生HF的左心室肌中表達(dá)，以及如何表達(dá)是本文研究的重點(diǎn)。本文通過(guò)在膿毒癥致MODS模型犬中選取發(fā)生HF的犬，取左心室肌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499與膿毒癥致MODS犬發(fā)生HF的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：健康雌雄比格犬11只，雌雄兼有，實(shí)驗(yàn)前給予常規(guī)的體檢工作，主要包括12導(dǎo)心電圖、心臟彩超等相關(guān)檢查，結(jié)合獸醫(yī)對(duì)犬的一般常規(guī)體格檢查。比格犬的體質(zhì)量為12.0～15.6(15.0±2.5)kg，年齡為1.5～2.5(1.3±0.7)歲。7只為MODS模型組犬(平均年齡為1.47±0.45歲，平均體質(zhì)量為14.2±2.5kg)，4只為正常組犬(平均年齡為1.45±0.36歲，平均體質(zhì)量為14.6±2.0kg)。全部實(shí)驗(yàn)犬由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心已經(jīng)通過(guò)AAALAC認(rèn)證)。本次的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，同時(shí)也結(jié)合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所在1996年制定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則實(shí)施。本次實(shí)驗(yàn)制作的MODS犬模型采用的是注射內(nèi)毒素，同時(shí)進(jìn)行器官支持的方法[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后選取犬心臟的左心室肌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后迅速開(kāi)胸，本著人道主義方法獲取犬的心臟標(biāo)本。迅速剪取心室組織，用生理鹽水去除標(biāo)本所含的血液和用剪刀去除標(biāo)本所含的脂肪組織。迅速將組織放入凍存管中，放置入液氮中快速冷凍，待快速冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。剪取部分心室肌組織使用甲醛溶液固定，后期行病理檢查。

2.研究方法：(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)：采用real-time PCR檢測(cè)心室肌細(xì)胞miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499的mRNA表達(dá)。具體操作過(guò)程：-80℃超低溫冰箱中取去除血液以及脂肪組織的左心室肌標(biāo)本100mg。由Invitrogen公司提供Trizol用于提取總RNA(上海生物工程服務(wù)有限公司，貨號(hào)SK1321)。取2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海生物工程服務(wù)有限公司(貨號(hào)SK2445)。引物序列由Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，其中反應(yīng)體系由上海睿安生物工程有限公司提供。具體過(guò)程為：在0.2ml PCR管中加入以下試劑：5μl總RNA、1μl特異性引物、5μl無(wú)核糖核酸酶雙蒸餾水；70℃溫浴5min；冰浴10s；離心加入下列試劑：4μl 5×反應(yīng)緩沖液、2μl dNTP混合物(10mmol/L)、1μl核糖核酸酶抑制物(20U/L)、2μl反轉(zhuǎn)錄酶(10U/L)、20μl總?cè)萘浚?7℃溫浴5min；42℃溫浴60min；70℃溫浴10min；將上述溶液于-20℃保存。反應(yīng)完成后根據(jù)2-△△Ct計(jì)算得出目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。(2)病理檢查:通過(guò)使用光鏡以及電鏡(圖1)觀(guān)察MODS犬左心室肌結(jié)構(gòu)(光鏡采用HE、PAS、銀染3種染色法，電鏡在2500倍下隨機(jī)觀(guān)察8～10個(gè)視野，在5000～30000倍下觀(guān)察左心室細(xì)胞的細(xì)胞器變化)。

結(jié) 果

1.不同類(lèi)型基因miRNAs引物序列：miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499與內(nèi)參U6的引物序列表(表1)。

表1 目的基因引物序列

2.不同類(lèi)型基因表達(dá)水平的比較: miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499的mRNA表達(dá)詳見(jiàn)表2。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組6種基因的表達(dá)水平比較結(jié)果顯示，miRNA-1、miRNA-133、miRNA-21、miRNA-29、miRNA-208、miRNA-499在MODS模型犬發(fā)生HF的左心室肌中均有表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組的miRNA-21的mRNA表達(dá)水平(2.21±0.49)顯著高于對(duì)照組的mRNA表達(dá)水平(0.83±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.414，P<0.001)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，其余5種基因的mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組不同類(lèi)型基因表達(dá)水平的比較

3.病理的光鏡以及電鏡結(jié)果：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較，實(shí)驗(yàn)組的左心室肌的肌細(xì)胞排列順序明顯不整齊、雜亂，部分心肌細(xì)胞肌束斷裂，ZM帶線(xiàn)模糊，線(xiàn)粒體其質(zhì)密度降低，輕微變形，部分線(xiàn)粒體嵴不完整，線(xiàn)粒體水腫，線(xiàn)粒體膜損傷，有自噬溶酶體，部分線(xiàn)粒體形成少量空泡，空泡線(xiàn)粒體散在分布(圖1)。

圖1 左心室肌組織的光鏡及電鏡圖A、B.實(shí)驗(yàn)組左心室肌的光鏡圖(A為銀染法，B為HE染色法)；C、D.對(duì)照組左心室肌的光鏡圖(C為銀染法，D為PAS染色法)；E.實(shí)驗(yàn)組左心室肌的電鏡圖；F.對(duì)照組左心室肌的電鏡圖。A、C、E放大倍數(shù)為5540倍；B、D、F放大倍數(shù)為22100倍

討 論

microRNAs (miRNAs) 是一類(lèi)小分子調(diào)控核糖核酸，它們?cè)诤芏嗉膊≈芯哂蓄A(yù)測(cè)作用[19]。miRNAs有著數(shù)以千計(jì)的高度保守的分型， miRNAs的很多分型在大多數(shù)物種中漸漸地被人類(lèi)熟知和掌握[20]。miRNA-21與膿毒癥炎性細(xì)胞因子有相關(guān)性。McClure等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21 在膿毒癥的早期及晚期階段都存在高表達(dá)，而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)外源的miRNA抑制物阻斷miRNA-21可以降低晚期膿毒癥的病死率。Sheng等[22]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血液中miRNA-21同樣存在著高表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)間接下調(diào)miRNA-21的表達(dá)水平可以降低膿毒癥炎性反應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的顯著上調(diào)，導(dǎo)致它們表現(xiàn)出促炎活性，可以作為炎癥條件下的生物學(xué)標(biāo)志物[23]。上述的研究提示,高表達(dá)的miRNA-21可能在膿毒癥的病理生理過(guò)程中扮演著不好的角色。

但是另外一些研究結(jié)果卻截然相反。我國(guó)研究者Yang發(fā)現(xiàn)，在敲除miRNA-21基因的小鼠心肌組織中，炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平增高，心功能障礙加重，提示miRNA-21高表達(dá)可以抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致心功能下降[24]。Bejerano等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21的高表達(dá)可以使心臟巨噬細(xì)胞表型從促炎型轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)型，進(jìn)而促進(jìn)血管生成，減少心肌纖維化，降低了凋亡細(xì)胞數(shù)量，減弱了左心室的重構(gòu)。上述的研究提示,高表達(dá)的miRNA-21可能在膿毒癥的病理生理過(guò)程中扮演著好的角色。

膿毒癥會(huì)通過(guò)感染或非感染等因素導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生過(guò)度炎性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生MODS，這種發(fā)生機(jī)制其本質(zhì)是全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SISR)[26]。MODS極易引發(fā)心臟病變，如HF。HF是由于心排出量不足而不能滿(mǎn)足體內(nèi)器官和組織的代謝需要而引起的一種復(fù)雜的臨床綜合征。HF由心臟進(jìn)行性結(jié)構(gòu)和功能改變引起的收縮和(或)舒張收縮功能障礙演變而來(lái)[27]。

miRNA-21基本上在所有細(xì)胞中表達(dá)，是公認(rèn)的最豐富和高度保守的miRNAs之一[20]。miRNA-21可作為HF診斷和治療的生物學(xué)標(biāo)志物[28，29]。miRNA-21在不同心血管疾病中均表現(xiàn)為失調(diào)狀態(tài)，其中包括心力衰竭[20]。Galluzzo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21可能參與了HF進(jìn)展的惡化，并且可以預(yù)測(cè)HF的預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的miRNA-21的mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組的mRNA表達(dá)水平，說(shuō)明在膿毒癥致MODS模型犬發(fā)生HF時(shí)左心室肌中miRNA-21的高表達(dá)與膿毒癥致MODS模型犬的HF有關(guān)，也就是說(shuō)，miRNA-21的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子增加，心功能下降。通過(guò)MODS模型犬左心室肌組織的病理改變發(fā)現(xiàn)，心室肌的肌細(xì)胞的確發(fā)生了明顯改變，結(jié)構(gòu)發(fā)生了異常，說(shuō)明miRNA-21在膿毒癥致MODS模型犬發(fā)生HF時(shí)左心室肌中的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致左心室肌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致機(jī)體損傷。由此筆者大膽預(yù)測(cè)，miRNA-21的高表達(dá)與膿毒癥致MODS發(fā)生HF有關(guān)。或許miRNA-21高表達(dá)可作為膿毒癥致MODS發(fā)生HF時(shí)的早期預(yù)警信號(hào)之一。