乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液14例臨床病理學特征及分子分型分析

楊朝暉，林 雅，曹學全，顧華敏，蔡小波，於櫻枝，盧洪勝

晚期惡性腫瘤是導致胸腔積液形成的原因之一，常規(guī)細胞學涂片陽性率較低。在惡性胸腔積液中可見到多種類型的腫瘤細胞，由于腫瘤細胞具有異質(zhì)性和相似性，鑒別困難，尤以惡性腫瘤易誤診[1]。晚期乳腺癌胸腔轉(zhuǎn)移病例雖常見，但關于乳腺癌的惡性胸腔積液細胞學形態(tài)的報道較少，尚無文獻報道乳腺癌胸腔積液基于免疫組化結(jié)果的分子分型改變情況，而該現(xiàn)象對臨床治療和預后判斷非常重要。本文結(jié)合細胞蠟塊和臨床資料，探討乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液的細胞學形態(tài)、免疫細胞化學特點及分子分型改變。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年11月～2021年4月臺州市中心醫(yī)院(臺州學院附屬醫(yī)院)存檔的11例和溫嶺市第一人民醫(yī)院存檔的3例乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液標本。這些標本原發(fā)部位的診斷均依據(jù)臨床資料、影像學和(或)病理檢查證實。

1.2 方法使用廣州安必平液基細胞沉降式制片染色機，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行制片，巴氏染色，閱片。取液基制片后剩余胸腔積液放入50 mL離心管中，離心機2 000 r/min離心5 min，棄上清；向沉淀物中加入10%中性福爾馬林5 mL，振蕩，2 000 r/min離心5 min，棄上清；向沉淀物中加入95%乙醇10 mL，振蕩，2 000 r/min離心10 min，棄上清液；將底部沉淀物包于濾紙置入包埋盒中，與常規(guī)組織一同行脫水處理，制成細胞蠟塊。

1.3 試劑免疫細胞化學染色過程所需單克隆抗體：ER、PR、HER-2、Ki-67、GATA3、p120、CK34βE12、E-cadherin、CK、PCNA、TTF-1、Napsin A、CK7、Villin、CDX-2、CA125、PAX8、AR、P504S、Calretinin和WT-1等鼠抗人單克隆抗體，均購自福州邁新生物公司。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定根據(jù)空白、陽性和陰性對照的顯色情況，在確定無假陽性和假陰性的前提下，HER-2、p120、CK34βE12、E-cadherin、CK、Napsin A、CK7、Villin、CA125和P504S蛋白表達定位于細胞膜和(或)細胞質(zhì)，ER、PR、Ki-67、GATA3、PCNA、TTF-1、CDX-2、PAX8、AR、WT-I蛋白表達定位于細胞核，Calretinin蛋白表達定位于細胞核及細胞質(zhì)，均呈棕黃色顆粒；陽性細胞>10%為陽性。

乳腺癌分子分型采用免疫組化替代分型(2013年St Gallen乳腺癌會議國際共識[2])，即：ER陽性，PR陽性率≥20%，HER-2陰性且Ki-67增殖指數(shù)<20%定義為Luminal A型；Luminal B型分兩種情況，一種為ER陽性，HER-2陰性，Ki-67增殖指數(shù)≥20%或PR陽性率<20%，另一種為ER陽性、HER-2陽性、PR及Ki-67增殖指數(shù)任何表達水平；HER-2過表達型定義為ER及PR陰性，HER-2陽性；ER、PR及HER-2均陰性定義為三陰型。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液臨床病理學特征及分子分型14例患者年齡44～74歲，平均60.36歲；其中浸潤性導管癌Ⅲ級9例(64.3%)，浸潤性導管癌Ⅱ級3例(21.4%)，浸潤性小葉癌2例(14.3%)；分子分型：2例術后不詳，余12例Luminal A型3例(25%)，Luminal B型7例(58.4%)，三陰型1例(8.3%)，HER-2過表達型1例(8.3%)。14例基于胸腔積液的分子分型結(jié)果：Luminal A型4例(28.6%)，Luminal B型3例(21.4%)，三陰型5例(35.7%)，HER-2過表達型2例(14.3%)；隨訪期間，生存7例，死亡6例，總生存期10個月～13年，出現(xiàn)胸水至死亡時間均在1年內(nèi)，失訪1例(表1)。

表1 14例胸腔轉(zhuǎn)移乳腺癌臨床病理學特征及分子分型

2.2 乳腺癌細胞學特點12例細胞單個或形成不同大小的三維細胞團，圓形、卵圓形或不規(guī)則形，可以互相疊加，又稱球形或空心球形(圖1、2)。免疫細胞化學染色結(jié)果：Ki-67、GATA3、p120胞膜(圖3)、CK均陽性；ER陽性5例；PR陽性4例。12例對應組織學診斷均為乳腺浸潤性導管癌。12例浸潤性導管癌中HER-2基因擴增3例，無擴增9例。表型擴增細胞學與組織學免疫組化結(jié)果一致。

圖1 乳腺浸潤性導管癌的液基細胞學涂片，鏡下見圓形、卵圓形或不規(guī)則形的三維細胞團，巴氏染色 圖2 乳腺導管癌的細胞蠟塊染色，鏡下見球形或空心球形的細胞團，HE染色 圖3 乳腺導管癌細胞蠟塊p120胞膜陽性，SP法 圖4 乳腺浸潤性小葉癌的液基細胞學涂片，鏡下見單個細胞或單層排列的細胞團，巴氏染色 圖5 乳腺浸潤性小葉癌的細胞蠟塊染色，鏡下見單個細胞或小的細胞團，HE染色圖6 p120呈細胞質(zhì)陽性，SP法

2例細胞單個或形成不同大小的細胞團，細胞單層排列，可見核仁(圖4、5)。免疫細胞化學染色結(jié)果：CK34βE12、p120胞質(zhì)(圖6)、GATA3陽性。2例組織學診斷均為乳腺浸潤性小葉癌。免疫組化結(jié)果：ER 1例陽性、1例陰性；PR 1例陽性、1例陰性。HER-2基因無擴增。細胞學與組織學免疫組化結(jié)果基本一致。

3 討論

乳腺癌已成為全球女性癌癥死亡的主要原因[3]，我國乳腺癌已成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤。乳腺癌可以通過血行/淋巴和種植轉(zhuǎn)移，如果出現(xiàn)胸腔積液，應考慮是胸膜、肺部轉(zhuǎn)移等造成的。很多惡性腫瘤晚期均可出現(xiàn)胸腔積液，最常見的為肺癌，但出現(xiàn)胸腔積液未必均出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，即使有腫瘤轉(zhuǎn)移也不一定可以在胸水中找及惡性腫瘤細胞。因此，在胸腔積液中找及惡性腫瘤細胞相對較難，細胞學檢測能及時明確診斷，可以指導胸腔灌注化療或配合放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等[4]。

本組14例乳腺癌轉(zhuǎn)移性胸腔積液以浸潤性導管癌為主，也可以為浸潤性小葉癌，分子分型以Luminal B型為主，隨訪期間，7例生存，6例死亡，1例失訪，總生存期10個月～13年，出現(xiàn)胸水至死亡時間均在1年內(nèi)，提示伴胸腔積液患者預后較差。有6例胸腔積液的分子分型發(fā)生改變，其中3例Luminal B型改成三陰型，1例Luminal A型改成三陰型，1例Luminal B型改成Luminal A型，1例Luminal B型改成HER-2過表達型；進一步分析發(fā)現(xiàn)，ER、PR的表達發(fā)生明顯改變，有6例直接轉(zhuǎn)為陰性，3例表達減弱；HER-2表達未發(fā)生改變；Ki-67表達部分增強部分減弱。ER和PR分別是雌激素受體和孕激素受體，其表達與乳腺癌發(fā)生及預后有關[5]。HER-2是表皮生長因子受體家族(epithelial growth factor receptor, EGFR)成員，與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及靶向治療有關[6]，HER-2是乳腺癌的獨立預后和預測指標，決定了疾病的侵襲性進程，增加復發(fā)的機會、遠處轉(zhuǎn)移，并縮短無瘤生存期。HER-2陽性乳腺腫瘤對人源化單克隆抗體赫賽汀治療亦有反應。病理醫(yī)師需要報告已知復發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的HER-2和受體表達狀態(tài)。這對于確認復發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤的狀態(tài)通常是必要的，據(jù)報道復發(fā)性/轉(zhuǎn)移性乳腺癌與原發(fā)腫瘤的受體狀態(tài)有近36%的差異。Ki-67是一種增殖細胞相關的核抗原，與腫瘤的惡性程度有關[6]。本組病例HER-2檢測的一致性較好，但激素受體發(fā)生明顯改變，這對于臨床選擇治療和預后判斷具有重要意義，本組5例發(fā)生激素受體表達丟失的患者均已死亡，提示激素受體表達轉(zhuǎn)陰者預后更差。

對于胸腔積液免疫表型與原發(fā)腫瘤不一致的問題，需要進一步分析可能的原因，以避免不必要的假陽性和假陰性結(jié)果，胸腔積液的保存時間、保存溫度、保存液的選擇等均有可能影響細胞學的制片結(jié)果和免疫表型[7-8]，正確收集、存儲、保存和處理技術的掌握程度對于確保樣品的正確處理和成功分析是必不可少的[9]。需要確保細胞蠟塊經(jīng)10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋，并制作組織對照片[10]。

本組乳腺癌的細胞學特點因組織學類型不同而有所不同。乳腺癌細胞學制片的背景較干凈，無炎癥細胞。乳腺癌胸腔積液的細胞學形態(tài)有兩種：(1)細胞單個或形成不同大小的圓形、卵圓形或不規(guī)則形的三維細胞團，可以互相疊加，又稱球形或空心球形。(2)排列方式為細胞單個或單層排列的細胞團，可見核仁。該排列方式可見于任何一種乳腺癌類型，但對診斷浸潤性小葉癌價值更大。p120連環(huán)素是catenin家族新成員，與E-cadherin具有特殊的連接性，在細胞黏附、發(fā)育和乳腺癌發(fā)生中起關鍵作用[11]。細胞角蛋白CK34βE12與乳腺癌發(fā)生及組織學類型相關[12]。CK34βE12陽性提示乳腺癌為浸潤性小葉癌。聯(lián)合檢測ER、PR、HER-2、Ki-67、p120及CK34βE12免疫細胞化學染色及病史對診斷惡性胸腔積液乳腺來源及組織學類型非常重要。由于胸腔積液中惡性腫瘤細胞具有異質(zhì)性和相似性，診斷乳腺癌需與肺腺癌、胃腸道腺癌、卵巢外漿液性癌、惡性間皮瘤等腫瘤進行鑒別[13]，可通過特征性的細胞學形態(tài)及特異性免疫組化標記進行鑒別。

綜上，若腫瘤患者出現(xiàn)胸腔積液，尋找原發(fā)部位顯得尤為重要。女性患者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌通過形態(tài)學特點及免疫組化結(jié)果不難診斷，乳腺癌發(fā)生胸腔積液一般病理分級較高、預后較差，尤其發(fā)生激素受體(ER、PR)轉(zhuǎn)陰的患者，生存時間通常不超過1年。對于乳腺癌胸腔積液分子分型發(fā)生改變的標本，需要排除各方面的影響因素進行綜合分析，盡可能按照標準化模式制作樣本。