心外膜脂肪中巨噬細(xì)胞對快速心房起搏犬心房KCa3.1及心房顫動易感性的影響

曹真 劉弟世聞 付韞韜 陳慧宇 趙慶彥

心外膜脂肪是一種代謝活躍的內(nèi)分泌脂肪庫，由冠狀動脈分支供血，位于心肌和內(nèi)臟心包之間，與心肌直接毗鄰。有研究發(fā)現(xiàn)心外膜脂肪為心肌炎癥及纖維化因子旁分泌調(diào)節(jié)的來源，可影響心房重構(gòu)的產(chǎn)生[1-4]。臨床上也發(fā)現(xiàn)心房顫動(簡稱房顫)患者心外膜脂肪的高炎癥活性[5]，心外膜脂肪的炎癥活性與巨噬細(xì)胞浸潤程度一致[6]。巨噬細(xì)胞釋放多種炎癥和纖維化因子，在房顫的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[7]。與非房顫患者相比，房顫患者心外膜脂肪標(biāo)本中存在巨噬細(xì)胞大量聚集，提示房顫的病理生理機(jī)制可能與心外膜脂肪中的巨噬細(xì)胞相關(guān)[3,8]。KCa3.1是一種由KCNN4基因編碼的中電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道，在心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞表面表達(dá)，參與如心肌細(xì)胞自律性、心肌成纖維細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞遷移極化等多種功能的調(diào)節(jié)[9-11]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)快速心房起搏犬心房中KCa3.1表達(dá)上調(diào)，抑制KCa3.1可明顯降低快速心房起搏導(dǎo)致的房顫易感性增加[12]，但在房顫發(fā)生過程中KCa3.1表達(dá)上調(diào)是否與心外膜脂肪中巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)尚不清楚。本研究通過快速心房起搏探討犬心外膜脂肪局部巨噬細(xì)胞浸潤對相鄰心房肌組織中KCa3.1及房顫易感性的影響。

材料與方法

1.材料：比格犬[湖北逸摯誠生物科技有限公司，許可證號：SCXK(鄂)2016-0020，體質(zhì)量8～10kg]、戊巴比妥鈉(Aspen，中國)、氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(Vrije Universiteit Amsterdam，荷蘭)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)脂質(zhì)體(Vrije Universiteit Amsterdam，荷蘭)、多極電極導(dǎo)管(Biosense-Webster,加拿大)、計算機(jī)電生理系統(tǒng)Lead7000(晉江公司，中國)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗CY3(Aspen，中國)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Aspen，中國)、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(Aspen，中國)，一抗均購自于Aspen，包括CD68、血管緊張素Ⅱ受體-1(AT1R)、磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)、c-Fos、c-Jun及KCa3.1。

2.方法

(1)動物模型制備：18只比格犬飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實(shí)驗中心。采用戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈推注麻醉比格犬，予以氣管插管、機(jī)械通氣和連續(xù)心電監(jiān)測。額外靜脈追加戊巴比妥鈉1 ml/h以維持實(shí)驗過程中的動物麻醉狀態(tài)。靜脈滴注生理鹽水(50～100 ml/h)以補(bǔ)償自發(fā)的液體丟失。將18只犬隨機(jī)分為空白組、起搏組和清除組，每組6只。清除組及起搏組犬在無菌條件下于第4肋間逐層雙側(cè)開胸，剪開心包以暴露心臟，在左心房和右心房縫制多極電極導(dǎo)管用于快速心房起搏及記錄。清除組犬在右肺靜脈-左心房脂肪墊、下腔靜脈-左心房脂肪墊與上腔靜脈-主動脈根部脂肪墊注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(5 mg/ml，每個部位0.5 ml)以清除巨噬細(xì)胞，起搏組犬在相同的部位注射等劑量的PBS脂質(zhì)體作為對照。隨后給予起搏組及清除組犬快速心房起搏(600次/min，持續(xù)7 h)。

(2)電生理學(xué)指標(biāo)測量：分別于起搏前和起搏后1、3、5、7 h測量左心房和右心房的心房有效不應(yīng)期(AERP)。AERP采用程序期前刺激法(S1S2)進(jìn)行測量，每8個基礎(chǔ)S1起搏刺激后，發(fā)放一個期前刺激S2,S1S2的偶聯(lián)間期以2 ms遞減。在起搏前及起搏7 h后，使用S1S1程序刺激法(120 ms、100 ms和75 ms周期長度，每次5 s，每頻率執(zhí)行3次，即每只犬于3個起搏周長共完成9次程控刺激)誘發(fā)房顫。房顫定義為持續(xù)時間>5 s的絕對不規(guī)則的心房節(jié)律，頻率>500次/min。記錄各組中每只犬的房顫誘發(fā)次數(shù)，統(tǒng)計各組平均房顫誘發(fā)次數(shù)。記錄各組中每只犬每次誘導(dǎo)出房顫的持續(xù)時間，并計算每只犬的平均房顫持續(xù)時間，用以統(tǒng)計各組房顫持續(xù)時間,所有數(shù)據(jù)均由計算機(jī)電生理系統(tǒng)記錄。

(3)巨噬細(xì)胞浸潤水平評估：實(shí)驗結(jié)束后，收集心外膜脂肪組織和其覆蓋的毗鄰心房肌組織。部分置于4%多聚甲醛中固定，過夜后取出，制備常規(guī)石蠟切片，部分置于-80 ℃冰箱中待檢。采用免疫熒光法檢測心外膜脂肪中巨噬細(xì)胞浸潤水平，將心外膜脂肪樣本與CD68的一抗(1∶50稀釋)進(jìn)行孵育，然后將其與二級抗體熒光素(CY3)標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG(1∶50稀釋)進(jìn)行孵育，并用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色。于熒光顯微鏡下觀察心外膜脂染色情況，在每組中隨機(jī)選擇來自不同犬的4個樣本，用于計算3個不同視野中巨噬細(xì)胞數(shù)量的平均數(shù)，使用Image J軟件分析結(jié)果。

(4)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測心外膜脂肪組織中CD68及其毗鄰心房肌組織中AT1R、P-p38MAPK、c-Fos、c-Jun、KCa3.1表達(dá)水平：將心外膜脂肪組織和心房肌組織分別研磨后收集總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離總蛋白并將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在膜上添加CD68(1∶1 000稀釋)、AT1R(1∶500稀釋)、p-P38MAPK(1∶500稀釋)、c-Fos(1∶1 000)稀釋、c-Jun(1∶500稀釋)和KCa3.1(1∶1 000稀釋)的一抗并在4 ℃下孵育過夜，洗滌后在37 ℃下與HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。采用蛋白凝膠成像儀進(jìn)行拍照和灰度分析，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度/相對內(nèi)參灰度。

結(jié) 果

1.3組犬心外膜脂肪中CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞浸潤水平及CD68水平比較：免疫熒光分析結(jié)果顯示，空白組、起搏組、清除組犬心外膜脂肪中CD68標(biāo)記的巨噬細(xì)胞浸潤水平分別為5.00±4.24、228.25±65.41、45.25±27.90，其中起搏組高于空白組，清除組低于起搏組(P<0.001)，而空白組和清除組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，空白組、起搏組、清除組犬心外膜脂肪組織中CD68水平分別為0.12±0.05、0.77±0.06、0.42±0.17，其中起搏組高于空白組，清除組低于起搏組，清除組高于空白組(P<0.001)。

圖1 3組犬心外膜脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤水平：CY3標(biāo)記的CD68被染成紅色，DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核被染成藍(lán)色(A、B、C分別為空白組的DAPI、CD68、Merge；D、E、F分別為起搏組的DAPI、CD68、Merge；G、H、I分別為清除組的DAPI、CD68、Merge；免疫熒光染色，×200)

2.起搏組和清除組犬左右心房不同時間AERP及房顫易感性比較：起搏組犬左心房和右心房1、3、5、7 h的AERP均短于0 h(P<0.05)。清除組左心房和右心房5、7 h的AERP均短于0h(P<0.05)。清除組犬左心房1、3、5、7 h的AERP均長于起搏組同一時間，清除組犬右心房3、5、7 h的AERP均長于起搏組同一時間(P<0.05)。見表1。起搏前，起搏組和清除組犬均未誘發(fā)出房顫。起搏組犬7 h房顫誘發(fā)次數(shù)高于基線[(5.3±2.5)次比0次，P<0.001]，而清除組犬7 h與基線房顫誘發(fā)次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(1.3±0.5)次比0次，P>0.05]。清除組犬房顫誘發(fā)次數(shù)低于起搏組[(5.3±2.5)次比(1.3±0.5)次，P<0.001]，且清除組犬房顫持續(xù)時間低于起搏組[(7.4±3.0)s比(22.7±18.6)s，P<0.05]。

表1 起搏組和清除組犬左右心房不同時間AERP比較

3.3組犬心外膜脂肪鄰近心房肌組織中AT1R、p-P38MAPK、c-Fos、c-Jun及KCa3.1表達(dá)水平比較：3組犬心外膜脂肪鄰近心房肌組織中AT1R、p-P38MAPK、c-Fos、c-Jun及KCa3.1表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，其中起搏組高于空白組，清除組低于起搏組(P<0.05)。見表2。

表2 3組犬心外膜脂肪鄰近心房肌組織中AT1R、p-P38MAPK、c-Fos、c-Jun及KCa3.1表達(dá)水平比較

討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，相較于皮下脂肪，心外膜脂肪與房顫的發(fā)生及發(fā)展更為相關(guān)[6]，影像學(xué)檢查提示心外膜脂肪與其相鄰心房肌在病理改變上密切相關(guān)[13]。但心外膜脂肪與房顫病理生理機(jī)制之間的關(guān)系仍未完全闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn)快速心房起搏犬心房中KCa3.1的表達(dá)上調(diào)，抑制KCa3.1可逆轉(zhuǎn)快速心房起搏犬的心房電重構(gòu)及降低房顫易感性[12]。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，KCa3.1表達(dá)上調(diào)影響巨噬細(xì)胞的招募極化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分泌的多種炎癥因子如白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)增加[14]。IL-1β抑制心房肌顫動蛋白(QK1)的表達(dá)，使L型鈣通道電流減少，進(jìn)而導(dǎo)致心房電重構(gòu)[15]。最近的一項研究提示編碼KCa3.1的KCNN4基因上調(diào)主要?dú)w因于巨噬細(xì)胞聚集極化，巨噬細(xì)胞通過激活KCa3.1和縫隙鏈接導(dǎo)致動作電位時程異質(zhì)性及心肌梗死后心律失常[16]。巨噬細(xì)胞聚集對房顫過程中心房組織KCa3.1表達(dá)的影響尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，在房顫患者心外膜脂肪標(biāo)本中，巨噬細(xì)胞在心肌和脂肪組織交界處大量聚集[8]。本研究證實(shí)了巨噬細(xì)胞在快速心房起搏犬心外膜脂肪中大量浸潤，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)使用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除局部心外膜脂肪組織中的巨噬細(xì)胞后，臨近心房肌組織中KCa3.1的表達(dá)水平上調(diào)及房顫易感性的增加被抑制。此前有研究結(jié)果顯示，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用于AT1R激活P38MAPK、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路，從而上調(diào)激活蛋白-1(AP-1，由c-Fos和c-Jun組成的轉(zhuǎn)錄因子)導(dǎo)致KCa3.1的表達(dá)水平升高[11]。與其一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)快速心房起搏犬心外膜脂肪臨近心房肌組織中AT1R、P38MAPK及AP-1表達(dá)水平升高，而心外膜脂肪的巨噬細(xì)胞清除后，AT1R、P38MAPK及AP-1表達(dá)的上調(diào)均被抑制，提示心外膜脂肪中巨噬細(xì)胞可能與臨近心肌中AT1R/P38MAPK/AP-1途徑的KCa3.1激活相關(guān)。近期有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)在心外膜脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)增厚部位的表達(dá)增加[3]。而ACE2基因敲除小鼠的心外膜脂肪炎癥程度加重，常駐脂肪組織巨噬細(xì)胞的浸潤增多，提示局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)與心外膜巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)[17]。經(jīng)典RAS途徑(AngⅡ/AT1R)的激活和非經(jīng)典RAS途徑(Ang1-7/Mas1R)的抑制可能通過巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥/心外膜脂肪代謝改變/心臟電重構(gòu)機(jī)制參與房顫的誘發(fā)和維持[18]。巨噬細(xì)胞相關(guān)的局部炎癥微環(huán)境影響脂肪組織的代謝及活化，促進(jìn)循環(huán)血管緊張素原的釋放，產(chǎn)生和分泌AngⅡ，激活A(yù)T1R誘導(dǎo)自分泌和旁分泌效應(yīng)，從而影響循環(huán)和局部的RAS[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，心外膜脂肪巨噬細(xì)胞浸潤與相鄰心房肌組織中AT1R表達(dá)相關(guān)，為心外膜脂肪/巨噬細(xì)胞/局部RAS的關(guān)聯(lián)提供了證據(jù)。

綜上所述，快速心房起搏犬心外膜脂肪組織存在巨噬細(xì)胞大量浸潤，心外膜脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤可能通過調(diào)控AT1R/P38MAPK/AP-1信號通路上調(diào)KCa3.1表達(dá)，從而增加快速心房起搏犬的房顫易感性。