九種血瘀證動物模型造模方法研究進展與評述＊

于嘉瑩，張會永，王 鳳，李威瑩，郭星池，吳 威，楊關(guān)林＊＊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藏象理論及應(yīng)用教育部重點實驗室 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 沈陽110032；3.珠?？萍紝W(xué)院 珠海 519000）

根據(jù)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語國家標(biāo)準(zhǔn)（證侯部分）》[1]定義血瘀證是指瘀血內(nèi)阻，血行不暢，以局部出現(xiàn)青紫腫塊、疼痛拒按，或腹內(nèi)徵塊、刺痛不移、拒按，或出血紫暗成塊、舌紫或有斑點，脈弦澀為常見癥的中醫(yī)證侯?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為，飲食、外邪、情志、外傷及他病等侵襲機體導(dǎo)致氣血運行失常、停滯脈內(nèi)是血瘀證形成的主要病因病機。血瘀證臨床較為常見，涉及心腦血管、消化、婦科等多種疾病體系，病程較長，且患病率較高。動物模型是探討人類疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段。近20年血瘀證動物模型不斷完善，經(jīng)歷了從僅注射腎上腺素單純模擬臨床表現(xiàn)的西醫(yī)病理造模，到根據(jù)中醫(yī)發(fā)病原理制備模型，再到與疾病緊密結(jié)合的現(xiàn)代病證結(jié)合模型，發(fā)展較為迅速。中醫(yī)主要通過模擬寒凝、氣滯、痰濁、熱毒、氣虛、陽虛、陰虛、血虛及外傷共九個病因制備血瘀模型。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要從影響血流動力學(xué)、微循環(huán)、血小板及凝血功能等微觀層面來制備血瘀模型。制備手段較為成熟，操作性較強，但是在造模過程中，出現(xiàn)了模型制備混淆、檢測指標(biāo)不統(tǒng)一等問題。且由于前期學(xué)者在進行血瘀證動物模型的研究過程中并未體現(xiàn)出造模方法的改進過程，故本文總結(jié)血瘀證動物模型造模方法及其改進過程以及評價指標(biāo)、反證方劑等內(nèi)容，以期為探討血瘀證動物造模方法提供思路與見解，為臨床治療提供一定的借鑒意義。

1 研究方法

本文通過檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、維普（VIP）、萬方數(shù)據(jù)庫錄入的相關(guān)文獻。進入高級檢索頁面，以“血瘀”和“動物模型”為檢索詞，以主題為檢索項，檢索時間截止至2021年9月20日，其余條件設(shè)為默認(rèn)得到2673篇文獻。

本文納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究類型：有關(guān)血瘀證動物模型的實驗研究；②研究對象：血瘀證動物，動物年齡、雌雄不限；③干預(yù)措施：實驗隨機分組，使用藥物制劑、模型器具、手術(shù)等方法復(fù)制模型，實驗周期、所用器具、采取方式不限；④觀察指標(biāo)：模型動物的種屬、年齡、性別、造模時間、模型方法。

文獻排除標(biāo)準(zhǔn)：①三大數(shù)據(jù)庫中重復(fù)的文獻；②無法獲取實驗數(shù)據(jù)的文獻。

2 模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因的造模方法

2.1 寒凝血瘀證

2.1.1 冰水浸泡法

毛騰敏等[2]1985年第1次采用冰水浸泡的方法來建造寒凝血瘀證的動物模型，將Wistar大鼠浸入6℃冰水5 min左右，造模18 h。但除了全血粘度升高以外，其他均無變化。2005年成秀梅等[3]對此方法進行了改良，將SD大鼠置于0-1℃冰水中20 min，每日1次，連續(xù)造模2周。大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)、蜷縮少動、爪尾耳部紫暗等表現(xiàn)。目前復(fù)制的動物模型使用方法較前無明顯差異，大鼠均出現(xiàn)蜷縮少動，口、鼻、爪、耳色紫暗，毛色暗淡，喜扎堆等表現(xiàn)[4]。冰水浸泡法是目前最常用的造模方法，其不拘泥于特定疾病，普適性較好。但造模過程中，施加因子的多樣性如冰水浴后是否擦干、吹風(fēng)等會對結(jié)果造成影響。

2.1.2 局部凍傷法

張珊珊等[5]在1992年首次采用雙下肢低溫冷凍法，將家兔雙下肢剃毛，圍置冰袋，使其溫度降至零下20-25℃，冷凍1.5 h。家兔出現(xiàn)聳毛、不活潑、蜷縮少動、局部皮膚呈紫色的表現(xiàn)。王學(xué)江等[6]延續(xù)使用上述方法，大鼠出現(xiàn)局部凍傷引起紫紺、水腫、體溫下降、畏寒、爪甲舌質(zhì)紫暗等表現(xiàn)。

2.1.3 全身冷凍法

1999年鄭小偉[7]第1次采取低溫冰箱冷凍法進行造模，將SD大鼠放入-15℃的低溫冰箱中，持續(xù)受凍4 h。大鼠出現(xiàn)畏寒蜷縮易扎堆、朦朧欲睡、小便色淡、大便粘滯、唇周發(fā)黑、耳色暗紅的表現(xiàn)。近期造模多根據(jù)上述方法進行改良，在受凍4 h期間，每隔1 h通氣5 s，其余同以前的方法相似[8]?，F(xiàn)在多采用徐小薈等[9]的造模方法，每天特定時間將大鼠全身置于0℃冰水中，刺激30天，大鼠出現(xiàn)蜷縮易扎堆、反應(yīng)遲鈍、呼吸微弱、舌唇爪尾紫暗、皮毛無光澤、皮膚呈現(xiàn)青紫瘀斑等表現(xiàn)。該模型操作性強、重復(fù)性好，且由于不施加冰水、溫度可控，減少了造模過程中的可變因素，效果較好。

2.1.4 風(fēng)寒環(huán)境法

楊士友等[10]在1997年第1次模擬傷寒發(fā)病病因來進行造模，將大鼠飼養(yǎng)于風(fēng)（5-6級）、寒（3-7℃）等環(huán)境中，考慮到了血瘀證是多種因素長期相互作用的結(jié)果，所以造模時間延長至20天，6天之后大鼠出現(xiàn)畏寒喜暖、耳唇部暗紅等表現(xiàn)，符合寒凝血瘀證的表現(xiàn)。唐照亮等[11]在2000年稍作改良，將實驗安排在了冬季進行，更加符合感受風(fēng)寒的時間。陳湘宏等[12]模擬太陽傷寒發(fā)病病因，將小鼠放置在溫度2-5℃、濕度60%、風(fēng)力4-5級的環(huán)境下飼養(yǎng)1周，小鼠普遍出現(xiàn)蜷臥少動、噴嚏流涕流涕、進食減少、肛溫增加和體重下降等風(fēng)寒表證的表現(xiàn)。該模型符合中醫(yī)理論，但國際認(rèn)可度較差，操作性較差，實驗應(yīng)用較少。

2.1.5 冰水浸泡加藥物法

近年來論文大多采用冰水浸泡加皮下注射腎上腺素的方法來制備寒凝血瘀證動物模型。該造模方法簡單、易于掌握、可重復(fù)性強，比較適合用于短時間制備寒凝血瘀動物模型。毛騰敏[13]在1985年第1次采用了冰水浸泡加腎上腺素注射的方法來進行造模，給Wistar大鼠進行6℃冰水浴浸泡5 min并配合皮下注射0.1%腎上腺素0.2 mL，造模2天，大鼠出現(xiàn)全血粘度及血漿粘度增高的表現(xiàn)。1998年滕久祥等[14]對上述方法進行了改良，進行2次皮下注射腎上腺素，在2次注射之間將大鼠冰水浸泡5 min，大鼠均出現(xiàn)全血粘度及血漿粘度比升高的表現(xiàn)?，F(xiàn)在多像李鳳金等[15]，將大鼠浸泡在0-1℃冰水中，造模2周再配合上述方法，注射2次腎上腺素且2次注射之間給大鼠進行冰水浸泡，大鼠出現(xiàn)血粘度升高，并伴有進食減少、毛色枯槁等表現(xiàn)。

由于寒凝血瘀證動物模型的制備方法較多，所以可能會出現(xiàn)其他兼證，像寒邪日久可能會出現(xiàn)陽虛的癥狀以及注射腎上腺素會出現(xiàn)肝郁氣滯的癥狀。冰水浸泡時大鼠頭部多在水面以上，而實際上我們冬天多是頭面露在外面，最先受寒，故冰水游泳模擬實驗并不理想，若改為低溫冰箱中可能更接近人類發(fā)病規(guī)律，其次用冰水浸泡法制備動物模型過程中沒有提到小鼠在冰水浴中浸泡之后是否吹干以及給小鼠進行吹風(fēng)時是否會造成恐懼等問題?，F(xiàn)在還有通過寒涼中藥來進行寒凝血瘀證動物模型的造模[16]，雖然可以造成血瘀證模型，但是應(yīng)該將其歸為陽虛血瘀證模型的造模方法里。冰水浸泡加藥物法操作性強，重復(fù)性好，且模型穩(wěn)定，更符合氣滯血瘀證動物造模。

2.2 氣滯血瘀證

楊丁友等[17]在2003年第1次采用激惹大鼠的方法來進行氣滯血瘀證動物模型的造模。將雄性Wistar大鼠進行定時激惹，造模1周。趙日霞等[18]采用改良多平臺睡眠剝奪法（Modified multiple platform，MMPM）建立氣滯血瘀動物模型，制作中間放置平臺，水槽四周注滿水，水溫在22℃左右，水面距平臺大約1 cm。大鼠可在平臺上自由活動，當(dāng)大鼠準(zhǔn)備進入睡眠時，由于全身肌張力降低，會節(jié)律性垂頭觸到水面驚醒，從而不能進入快速動眼（Rapid eye movement，REM）睡眠期，結(jié)果大鼠出現(xiàn)探究行為和攻擊性增強，對環(huán)境刺激的警覺性以及進攻行為增強和皮毛蓬亂無光澤的表現(xiàn)。

情致異常是肝郁氣滯和氣滯血瘀證的主要病因，目前認(rèn)為情志內(nèi)傷的主要病因是不良的生活事件形成的心理應(yīng)激反應(yīng)。2007年任建勛等[19]采取不可預(yù)知的慢性刺激，包括大鼠電擊刺激、噪聲刺激、閃爍光刺激以及半高脂高糖飲食，使之出現(xiàn)肝郁氣滯證、氣滯血瘀證的特點，大鼠出現(xiàn)相互撕咬，易惹怒等行為，大鼠血液流變學(xué)中低中高切變率與血漿粘度明顯升高。目前氣滯血瘀證的造模大多采用聲光電刺激、夾尾、束縛、冰水浴多種刺激聯(lián)合應(yīng)用和腎上腺素注射方法。該模型與人類發(fā)病規(guī)律更為相近，但由于無法精準(zhǔn)判斷其對實驗動物的刺激程度，在復(fù)合因素造模時可能會在原有疾病基礎(chǔ)上添加新的病種，如多因素刺激日久導(dǎo)致抑郁[20]。

2.3 痰濁血瘀證

2002年鄭學(xué)民等[21]給雄性Wistar大鼠喂高脂飼料，造模4周，大鼠出現(xiàn)血粘度升高。趙玲等[22]進行了改進，將大鼠放在室溫23-25℃，相對濕度是55% ± 5%的環(huán)境下，并且對大鼠喂養(yǎng)高脂飼料，實驗期間自由進食，采取終點取齊法，造模16周。大鼠的高、中、低切變率下全血黏度和血漿粘度升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)升高。通過長時間給大鼠喂食高脂飼料，從而痰濁內(nèi)生、氣血運行受阻，導(dǎo)致血瘀，該類造模方法符合痰濁血瘀證的病機，但由于造模時間較長，過食肥甘的同時也易導(dǎo)致脾虛證。

2.4 熱毒血瘀證

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為熱毒血瘀證乃感受溫?zé)嵋叨静⌒白苽梭w津液，傷津耗液，煉熬陰血成瘀。在其形成過程中，溫?zé)岫拘吧钊霠I血是首要因素，營陰耗損、絡(luò)損津傷是病理，熱毒熾盛、熱瘀交結(jié)、正虛外脫是發(fā)展趨勢。

根據(jù)上述理論，許長照[23]1988年第1次給家兔耳靜脈注射內(nèi)毒素的方法來進行熱毒血瘀證模型的造模，造模時間為24 h，大鼠出現(xiàn)高熱、眼球充血、皮下瘀血等表現(xiàn)。卞慧敏等[24]分別采用注射金黃色葡萄球菌、大腸桿菌加內(nèi)毒素和地塞米松磷酸鈉加內(nèi)毒素3種不同方法制備熱毒血瘀證模型。前2組大鼠進行耳緣靜脈注射，最后1組進行肌肉注射，造模時間分別為48 h、48 h、8 d。金葡菌造模后大鼠體溫持續(xù)升高，并發(fā)現(xiàn)多個臟器微膿腫，內(nèi)臟有大片瘀血。內(nèi)毒素造模大鼠出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱10 h以上，呈雙峰熱型，多臟器毛細(xì)血管瘀血、出血、微血栓等。而地塞米松磷酸鈉加內(nèi)毒素模型的大鼠血液呈高凝狀態(tài)。張建軍等[25]于第7天給SD大鼠腹腔注射25 mg·kg-1的角叉菜膠，并且尾靜脈注射80 g·kg-1內(nèi)毒素，來制備熱毒血瘀證動物模型，大鼠出現(xiàn)發(fā)熱等表現(xiàn)。目前采用最多的熱毒血瘀證方法均屬于短期造模法，雖可在較短時間內(nèi)制備模型，但不符合日久生瘀的中醫(yī)理論，楊超等[26]采用分時間段給大鼠腹腔注射2.5 mg·kg-1的LPS，每周注射2次，造模進行8周，模型組大鼠與對照組相比持續(xù)體重增加緩慢、進食下降和活動減少、皮毛枯黃、爪甲枯燥、尾部紫暗，眼睛分泌物多、多處于閉目狀，大便異常臭穢。長期造模法更能模擬熱毒血瘀證的演變過程，符合中醫(yī)“熱毒血瘀證”的形成理論。

2.5 外傷血瘀證

1988年廖福龍[27]第1次采用重物擊打肢體的方法來進行外傷血瘀證動物模型的造模，大鼠的紅細(xì)胞比積、血液粘度、血漿粘度、凝血時間、凝血粘度等均上升。沈欣等[28]用自由落體打擊儀擊打健康SD大鼠右小腿外側(cè)，大鼠的皮下、肌肉的肌外膜、肌束膜及肌纖維均有不同程度的出血瘀斑以及軟組織腫脹的表現(xiàn)擊打健康的SD大鼠右小腿外側(cè)，大鼠出現(xiàn)皮下出血、肌肉的肌外膜、肌束膜、及肌纖維均有不同程度的出血、瘀斑以及軟組織腫脹的表現(xiàn)。之后的外傷瘀血證動物模型的造模均采用重物擊打方法。

2.6 氣虛血瘀證

1997年龐樹玲等[29]第1次采用饑餓、疲勞、寒涼復(fù)合因素來進行氣虛血瘀證動物模型的造模，第1周給中年Wistar大鼠喂正常食量的1/3，第2周加上疲勞冰水游泳，每次直至力竭撈出，造模3周大鼠出現(xiàn)倦怠少動、毛色枯槁、體重下降、尾部發(fā)涼、皮下瘀斑的表現(xiàn)。2001年趙輝等[30]加以改進，增加了驚恐因素并配合高脂飲食，造模10天，大鼠同樣出現(xiàn)了精神萎靡，倦怠乏力，不思飲食，舌、尾紫暗，眼球由暗紅轉(zhuǎn)為淡紅的表現(xiàn)。張錦等[31]將大鼠按照4% ± 0.5%體重負(fù)重然后放入泳池中。水溫控制在（20 ± 1）℃，強迫其不停的游泳直至力竭撈出，力竭的標(biāo)準(zhǔn)為游泳動作失調(diào)、水淹沒鼻尖、身體下沉超過10 s不能浮出水面，持續(xù)21 d，從而制備氣虛血瘀證動物模型。大鼠均出現(xiàn)體重減輕、食欲減退和舌質(zhì)紫黯的表現(xiàn)。黃爍等[32]將大鼠飼養(yǎng)在22-25℃、濕度40%-55%的環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1天，自由飲食飲水，并且進行2天適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練。造模2周，逐漸增加強度，通過跑步疲勞建立模型。大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動度降低、皮毛枯黃無光澤、嗜睡以及對外界刺激反應(yīng)遲鈍、稀便和唇舌變紫變暗的表現(xiàn)。彭桂原等[33]采用耗氣破氣加饑飽失常法制備氣虛血瘀證豚鼠模型，具體方法為：采用“足量給食-限量給食”的循環(huán)方法，使用“小承氣湯”作為破氣苦降藥，造模前10天，隔日灌藥10 mL·kg-1的小承氣湯，給藥當(dāng)日禁食，次日自由進食；最后5天，給豚鼠灌服200%濃度10 mL·kg-1的小承氣湯，給藥當(dāng)日禁食，次日限制飲食。模型組豚鼠精神萎靡、行動遲緩、便溏、被毛枯槁脫落。該模型操作性強、重復(fù)性好，但用藥劑量、造模時間及施加變量的刺激程度尚不統(tǒng)一，若涉及具體疾病時應(yīng)注意服用苦寒藥物過久易致陽虛，且把握施加變量的度，減少因刺激程度過大而導(dǎo)致造模動物抑郁或突然情緒激烈的現(xiàn)象。

2.7 陽虛血瘀證

1993年鄭小偉等[34]第1次用低溫冰箱（-15℃）冷凍4 h的方法來制備陽虛血瘀證動物模型，大鼠出現(xiàn)畏寒蜷縮、喜暖少動、耳色暗紅的表現(xiàn)。賈云波等[35]做了改進，在籠中加入0-1℃冰水，再將其置于4℃冰箱中，造模30天，大鼠出現(xiàn)懶動、便溏、皮下瘀紫的表現(xiàn)。低溫冰箱冷凍法是最常用的制備陽虛血瘀證模型的方法，但是要延長造模時間才更貼近人體“久病成瘀”的特點。

2.8 陰虛血瘀證

1991年馬治中等[36]第1次通過注射氫化可的松和腎上腺素的方法來制備陰虛血瘀證動物模型，造模時間為14天，大鼠的紅細(xì)胞（Red blood cell，RBC）聚集性增強、紅細(xì)胞比容（Red blood cell volume，HCT）增高、RBC變形能力降低。卞慧敏等[37]每日SD大鼠皮下注射D-半乳糖48 mg·kg-1，從第32天肌肉注射地塞米松1.5 mg·kg-1。大鼠出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、口唇紫紺、結(jié)膜出血、精神萎靡、蜷臥或抽搐驚、舌質(zhì)欠潤色深紅或暗紫的表現(xiàn)。目前陰虛血瘀證動物模型大多是通過注射氫化可的松來模擬陰虛證的發(fā)病。但陰虛血瘀證是由于陰虛生內(nèi)熱而致瘀，采用注射氫化可的松和腎上腺素的方法是分別模擬陰虛和火旺，無法體現(xiàn)血瘀證的自然發(fā)展過程，但該方法可重復(fù)性較好。通過每天少量注射氫化可的松，并延長造模時間可更好還原人體血瘀證的發(fā)生發(fā)展過程。

2.9 血虛血瘀證

2007年謝萍等[38]人第1次采用放血的方法來進行血虛血瘀證動物模型的造模，將雌性SD大鼠按照1 mL·kg-1體重從眼眶底血管叢放血，隔日1次，進行5次放血造模，且最后1次放血后從眼眶底血管叢取血20 μL，用于各項指標(biāo)的檢查，通過失血過多模擬血虛。該實驗用產(chǎn)舒顆粒顯著提高大鼠的RBC、血紅蛋白（HB）濃度，可反證造模成功。也有通過注射乙酰苯肼[39]、照射60Co-γ射線[40]的方法來制備損傷型血虛血瘀證模型的。但這些方法造模時間較短，多次放血的造模方法更貼近人類的發(fā)病規(guī)律。

2.10 復(fù)合因素法

在血瘀的形成過程中，往往有多個因素影響血液運行，從而導(dǎo)致血瘀。故近期實驗大多是由多因素造模的方法。李煒等[41]根據(jù)上述理論在14天皮下注射腎上腺素0.9 mg·kg-1，4 h后給予不可預(yù)見性刺激，分別為晝夜顛倒、冰水游泳、烤箱熱烘、噪音刺激、懸尾實驗，出現(xiàn)神疲少神、精神萎靡、淡漠的表現(xiàn)，且行為學(xué)實驗中水平及垂直運動次數(shù)均減少，全血粘度增加。氣滯血瘀證模型的造模方法就是運用多個因素來進行造模[19]。

表1 血瘀證病因造模方法

現(xiàn)在關(guān)于血瘀證的研究越來越多，且血瘀證的病機也很復(fù)雜，所以對不同的造模方法以及采用的模型動物、造模方法、評價指標(biāo)做了一個總結(jié)，詳見表1。

3 西醫(yī)病理造模方法

3.1 鹽酸腎上腺素注射液

目前應(yīng)用最多的血瘀證造模方法就是皮下注射腎上腺素，腎上腺素與去甲腎上腺素可以誘發(fā)焦慮，所以這種方法制備的血瘀證模型具有“氣滯”的證候?qū)傩訹41]。符合《血證論》所說的“氣結(jié)則血凝”。趙玲等[42]根據(jù)上述理論，制備慢性血瘀證動物模型和急性血瘀證動物模型，給大鼠皮下注射腎上腺素，且配合冰水游泳來制備血瘀證動物模型。

3.2 高分子右旋糖苷

尹軍祥等[43]給大鼠尾部靜脈注射0.05 mL·kg-1的10%高分子右旋糖苷共3次。大鼠出現(xiàn)舌質(zhì)紫暗和舌下脈絡(luò)增粗增長、微血管密度增加、眼球暗紅、尾根隱顯靜脈的表現(xiàn)。且全血粘度各項指標(biāo)明顯升高，紅細(xì)胞壓積、聚集指數(shù)和聚集面積顯著升高。

3.3 CCl4

任宏義等[20]第1天給大鼠皮下注射0.5 mL·100 g-1體重的CCl4，之后每隔4日皮下注射0.3 mL/·100 g-1體重，一共10次。由于鱉甲煎丸是治療氣滯血瘀證的著名成方，用鱉甲煎丸以方測證進行治療，癥狀得到緩解，可反證氣滯血瘀證造模成功。

3.4 病證結(jié)合造模方法

在分析傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的過程中我們可以發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)的優(yōu)勢在于辨證論治，包括整體辨證、局部辨證與微觀辨證。在社會中有很多病其實只是“證”和“癥”，而這些“病”是很難用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢查出來的，也無法獲得現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的診斷。雖然辯證是中醫(yī)的優(yōu)勢，也是中醫(yī)診療過程中主要的一步，但是對于現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)的發(fā)展來說是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。中醫(yī)學(xué)的主要問題在于對病的認(rèn)識不足，而這恰巧是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢。以病為基礎(chǔ)上，再根據(jù)不同證型造模更符合實際。

黃爍等[45]根據(jù)上述理論將Wistar大鼠麻醉，用止血鉗撐開大鼠左側(cè)3、4肋間，用0號手術(shù)線結(jié)扎左前降支根部。制備心肌梗死模型，然后配合2周中強度的跑臺運動，從而制備氣虛血瘀冠心病模型。大鼠出現(xiàn)精神萎、靡活動度降低以及便稀，舌尖、口唇、掌心變紫變暗的表現(xiàn)。郭文鶴等[46]給雄性W1istar大鼠灌10 mL·kg-1脂肪乳（25%豬油、10%膽固醇、1%丙基硫氧嘧啶、2%脫氧膽酸鈉、25%吐溫80、20% 1,2丙二醇、17%水）持續(xù)進行3周，促進動脈粥樣硬化的發(fā)病。配合每日冰水浴20 min，持續(xù)2-3周造模從而制備氣滯血瘀證動脈粥樣硬化的病癥結(jié)合模型。

雖然西醫(yī)造模方法更為精準(zhǔn)，可重復(fù)性高，在國際上也受到認(rèn)可，但是不符合中醫(yī)理論，應(yīng)將中醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相結(jié)合，才能更好推動血瘀證以及相關(guān)臨床疾病的研究進程。

4 血瘀證模型的評價方法

4.1 宏觀表征

血瘀證以疼痛、出血、腫塊、舌紫和脈澀為主要特征。理想的血瘀證造模方法應(yīng)當(dāng)具備以下條件：①模型典型癥狀應(yīng)與血瘀證典型臨床表現(xiàn)相一致；②具有重復(fù)性，保證同一方法、相同實驗材料、同一條件下所得到的結(jié)果之間應(yīng)該具有一致性；③實驗簡單、易于操作、可控性要強。例如跑臺運動建造氣虛血瘀模型，干預(yù)因素主要有動物種類、持續(xù)時間和速度。干預(yù)因素易于控制、操作簡單，可重復(fù)性較高。又如風(fēng)寒實驗所致寒凝血瘀模型，對于環(huán)境溫度、濕度以及風(fēng)力要求較高，較復(fù)雜難以控制，故其可重復(fù)性較差。但是在閱讀近些年的文獻中發(fā)現(xiàn)對于造模后的中醫(yī)宏觀癥狀比較忽視，且在模型復(fù)制過程中也無法體現(xiàn)舌象和脈象，通過宏觀表征也無法采集四診信息，很難辨證論治，現(xiàn)在大多以微觀指標(biāo)作為判斷造模是否成功的標(biāo)準(zhǔn)[47]。

血瘀證模型宏觀表征的共同特點為舌、爪尾部紫暗，毛發(fā)無光澤。但不同的造模方法所致的血瘀證模型具有其獨特的個性特征。寒凝血瘀模型[3]伴有嗜臥少動、行動遲緩、蜷臥喜扎堆、大便溏、小便清長；氣滯血瘀證模型[48]伴有活動量減少、攻擊性增強、進食減少和體重增長緩慢；痰濁血瘀證模型[49]伴有體質(zhì)量下降、進食量下降；熱毒血瘀證模型[22]可見高熱、血管明顯充血、心跳加快以及呼吸急促的特點；外傷血瘀證模型[27]伴見傷肢腫脹、皮下瘀血以及軟組織損傷、局部皮膚以及深部肌組織、小血管受損、嚴(yán)重者出現(xiàn)肌纖維以及膠原纖維的斷裂以及組織充血壞死；氣虛血瘀證模型[31]伴見食欲減退、進食速度減慢；陽虛血瘀證模型[33]伴有大便溏稀、喜暖少動以及體溫下降；血虛血瘀證模型[50]伴有食欲下降、行動緩慢、團縮嗜睡、毛蓬豎無光澤、尾蒼白而涼；陰虛血瘀證模型[51]伴有體重下降、躁動不安、飲水增加、糞便干結(jié)量少；復(fù)合因素法更加滿足疾病的病因病機，但是個性特征并不明顯；西藥法不符合中醫(yī)疾病的病因病機。相關(guān)評價詳見表2。

4.2 微觀指標(biāo)

有關(guān)血瘀證動物模型的微觀指標(biāo)還有些混亂，沒有形成固定的微觀指標(biāo)評價體系，但是其評價指標(biāo)較為客觀，其中血液流變學(xué)的改變是現(xiàn)在比較公認(rèn)的客觀評價指標(biāo)，也和凝血功能、血小板相關(guān)指標(biāo)有關(guān)。故將常見的與血瘀證聯(lián)系密切的指標(biāo)進行總結(jié)，詳見表3。

4.3 反證方劑

反證方劑是驗證血瘀證動物模型是否造模成功的一種方法。不同的證型具有不同的造模方法，所以反證方劑也各不相同。以四君子湯加血府逐瘀湯為例，四君子湯[59]方中以人參為君藥，健脾養(yǎng)胃，白術(shù)健脾燥濕，加強益氣助運之力，使以炙甘草，益氣和胃，調(diào)和諸藥。主要治療脾胃氣虛證，作為氣虛證的反佐方劑。血府逐瘀湯[59]方中用桃仁破血行滯、紅花活血祛瘀止痛共為君藥，赤芍、川芎助君藥活血祛瘀，牛膝活血祛瘀痛經(jīng)，引血下行，共為臣藥，與其他藥共同作用起到活血祛瘀止痛的作用，并作為血瘀證的反佐方劑。丹七片[60]以丹參活血祛瘀，三七祛瘀消腫，作為血瘀證的反佐方劑。補陽還五湯[61]用黃芪補氣，歸尾、川芎、赤芍、桃仁、紅花活血，來作為氣虛血瘀證的反佐方劑。氣滯血瘀以香附四物湯[62]為例，由于香附四物湯是氣滯血瘀的代表方劑，故其給予香附四物湯以后發(fā)生病理變化的指標(biāo)可以發(fā)生改善，再用其他癥型代表方劑少腹逐瘀湯，發(fā)現(xiàn)微觀指標(biāo)無明顯變化，則可反推模型具有氣滯血瘀的特點。但是現(xiàn)在運用反證方劑來驗證造模是否成功的并不多，且各個用于反證的方劑也各不相同，存在一定的不規(guī)范之處。

表2 血瘀證模型宏觀表征的評價

表3 血瘀證微觀模型的評價

5 討論

對于各個中醫(yī)證型的模型制備，要根據(jù)疾病的病因病機演變規(guī)律，2000年左右血瘀證動物模型多采用單因素造模，而近些年多采用復(fù)合因素的方法進行造模，更加符合疾病發(fā)展特點?，F(xiàn)在血瘀證動物模型的造模方法主要存在以下幾個問題：①中醫(yī)造模方法存在證型特點不明顯的情況，以及造模時間長短不一，復(fù)合因素雖然造模比較成功，但是癥狀并不典型。②現(xiàn)代醫(yī)學(xué)造模方法不符合中醫(yī)病因病機的發(fā)展規(guī)律。③某一因素制備模型的同時也會導(dǎo)致其他的疾病，例如寒凝血瘀模型的制備同時也會導(dǎo)致寒邪傷陽的情況。寒凝血瘀的造模方法和陽虛血瘀的造模方法模糊不清，2000年左右的寒凝血瘀證和陽虛血瘀證的造模方法均采用低溫冰箱冷凍法。④血瘀證模型評價不確切。⑤反證方劑的選擇比較隨意。

中醫(yī)造模方法主要是分為單因素造模和復(fù)合因素造模。復(fù)合因素造模是現(xiàn)在采用最多的一種造模方法，但是該造模方法雖然對于血瘀證造模效果較好，但是對于復(fù)合證型的造模來說癥狀并不典型。而單一造模方法雖然癥狀典型但是造模效果并不好。且一種病因可以導(dǎo)致其他證型，演變成其他疾病。例如：寒凝血瘀證和陽虛血瘀證的造模方法極其相似。僅用低溫冰箱冷凍的造模方法會導(dǎo)致實證虛證的模糊。該方法既在寒凝血瘀證動物模型的造模過程中使用過，也在陽虛血瘀證動物模型的造模過程中使用過，會導(dǎo)致寒邪傷陽的情況。故應(yīng)該將實證和虛證分開，進而來決定造模時間的長短。像氣滯血瘀用冰水浴加腎上腺素的方法來進行造模，氣滯血瘀的造模過程中可能還會夾雜著寒凝甚至是陽虛的證型。每一個模型的制備過程中都會或多或少的夾雜著其他癥型的表現(xiàn)，與典型的血瘀證分型都會存在一定差異。由此可見血瘀證的造模方法需要進一步規(guī)范區(qū)分。

腎上腺素、高分子右旋糖苷、CCl4等西藥造模方法不符合中醫(yī)的病因病機規(guī)律，多是通過單純的病理損傷來模擬血瘀證的某些癥狀來建立模型。注射腎上腺素是模擬在生氣的時候所分泌的物質(zhì)，雖然簡單易操作，但是持續(xù)時間較短。大劑量的腎上腺素結(jié)合冰水應(yīng)激可加快血瘀的形成，模擬暴怒時釋放大量腎上腺素，也證實了腎上腺增多可以導(dǎo)致血瘀證的形成。而高分子右旋糖苷從微觀指標(biāo)來看制備血瘀證模型效果更好，但是其血瘀證表現(xiàn)在2 h內(nèi)就會消失。CCl4雖然在一定程度上模擬了病因，損傷肝臟從而導(dǎo)致氣滯，但是缺點是不易操作、可控性差且容易造成模型的死亡。腎上腺素和中醫(yī)造模聯(lián)合應(yīng)用時也會出現(xiàn)時間偏倚。

在制備寒凝血瘀證動物模型與陽虛血瘀證動物模型中所出現(xiàn)的表征大多相似，且在造模方法上也有許多相似的地方，故其宏觀表征也基本一致。應(yīng)該將實證和虛證區(qū)分開，進而來決定造模時間的長短。同一個血瘀證的造模方法可以導(dǎo)致不同的癥型，因此模型評價的標(biāo)準(zhǔn)不夠嚴(yán)謹(jǐn)，并且癥狀和體征依賴于主觀評價，容易造成主觀偏倚[63]。例如氣滯血瘀用冰水浴加腎上腺素的方法來進行造模，氣滯血瘀的造模過程中可能還會夾雜著寒凝甚至是陽虛的證型。每一個模型的制備過程中都會或多或少的夾雜著其他癥型的表現(xiàn)，與典型的血瘀證分型都會存在一定差異。由此可見血瘀證的造模方法需要進一步規(guī)范區(qū)分。

目前血瘀證評價指標(biāo)仍存在爭議，尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。在模型的評價過程中主要有兩個方面：①動物模型的宏觀表征來直接辨別中醫(yī)證型；②現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微觀指標(biāo)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微觀指標(biāo)是血瘀證模型中較常用的判斷動物模型是否制備成功的標(biāo)準(zhǔn)，但宏觀表征比較不常用。血液流變學(xué)是研究血液及其組分以及與血液接觸的血管的流變性質(zhì)的學(xué)科，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛運用在臨床中[64]。且在利用宏觀表征評價模型時，隨意性強、缺乏客觀量化的指標(biāo)且判定較模糊。

反證方劑是通過“以方測證”的逆向思維來驗證造模是否成功。模型制備完成后，運用相應(yīng)證型的經(jīng)典方劑來進行驗證。現(xiàn)在反證方劑運用的還不是很廣泛，且存在一些不合理的地方。像方劑的選擇較隨意，沒有固定的標(biāo)準(zhǔn)，其結(jié)果的可靠性受到質(zhì)疑等問題。

目前血瘀證模型所選用的動物主要包括SD大鼠、Wistar大鼠、昆明小鼠、家兔等。而豬、猴等大型哺乳動物則更接近人的生理生化標(biāo)準(zhǔn)。故可以考慮將血瘀證動物模型擴展到此類動物更好的模擬血瘀證的病因病機。且血瘀證病證結(jié)合模型較少，大多是血瘀證冠心病、血瘀證痛經(jīng)運用病證結(jié)合的造模方法。將疾病與癥候隔離開，與臨床實際不符。通過采用傳統(tǒng)中醫(yī)病因復(fù)制證候，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病因復(fù)制疾病，使動物模型同時具有癥候和疾病的特征，更加符合臨床試驗。

6 結(jié)語

中醫(yī)動物模型的制備仍然是一個探索性的工作，仍然存在一定的局限性。但今后在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，在造模的過程中加強對病因病機規(guī)范化制備。避免過多的干擾因素，保證動物模型的可重復(fù)性。注重反證方劑的運用，注重將中醫(yī)理論、癥候與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病理相結(jié)合，在實踐中不斷提高，必將進一步推進血瘀證動物模型制備的規(guī)范化、客觀化。