盤基網(wǎng)柄菌RasD蛋白的生物信息學(xué)分析及趨電性研究*

王家家, 葛曉雪, 王曉燕, 高晶, 高潤(rùn)池

(1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,云南 昆明 650500;2.云南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,云南 昆明 650500)

Ras是一個(gè)小分子的鳥苷三磷酸酶，它能夠在與GTP(Guanosine Triphosphate,GTP)結(jié)合的活性狀態(tài)和與GDP(Guanosine diphosphate,GDP)結(jié)合的非活性狀態(tài)之間循環(huán)[1].三磷酸腺苷與Ras結(jié)合后，激活一系列下游的信號(hào)通路，比如有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞的存活及分化[2-3].哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在四個(gè)Ras蛋白，即H-Ras、N-Ras、K-Ras 4A和K-Ras 4B[4]，研究表明這些Ras亞型的改變能夠引起不同細(xì)胞的癌變，比如K-Ras突變通常引起結(jié)直腸癌、膽管癌、胰腺癌、肺癌和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[5]；在黑色素瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，則常常發(fā)生N-Ras突變；而肝癌、甲狀腺癌和膀胱癌中，H-Ras突變則比較多見[6].

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，正常組織癌變后，在腫瘤區(qū)域產(chǎn)生生物電場(chǎng)，且該電場(chǎng)指導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展.然而，由于哺乳動(dòng)物腫瘤組織的復(fù)雜性，人們常常需要借助一些模式生物來研究其中的病理機(jī)理，例如盤基網(wǎng)柄菌(Dictyosteliumdiscoideum).盤基網(wǎng)柄菌是一種低等的真核微生物，具有特殊的單細(xì)胞和多細(xì)胞生命周期，常作為模式生物來研究真核生物細(xì)胞發(fā)育、趨化運(yùn)動(dòng)和信號(hào)傳導(dǎo)等[7].盤基網(wǎng)柄菌的單細(xì)胞還能夠在直流電場(chǎng)發(fā)生朝向陰極的定向運(yùn)動(dòng)[8]，該現(xiàn)象也被稱為細(xì)胞的趨電性，因此它也被作為研究細(xì)胞趨電性的理想模型[9].研究證明，盤基網(wǎng)柄菌單細(xì)胞的趨電性受基因的調(diào)控，例如，piaA(PIAnissimo，piaA)和rasG(RAt Sarcoma viral oncogene homolog，rasG)主要調(diào)控盤基網(wǎng)柄菌在直流電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向[8-10]，Gβ則主要調(diào)控盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞在直流電場(chǎng)中的遷移速度[11].盤基網(wǎng)柄菌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與高等真核生物非常相似，許多生物信息學(xué)分析證明盤基網(wǎng)柄菌可用于研究阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理[12]、人類無腦回疾病以及細(xì)胞癌變機(jī)制[13]、藥物作用機(jī)理、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)退行性病變等[14].

由于盤基網(wǎng)柄菌中存在較多的人類Ras基因家族的同源基因，包括rasB、rasC、rasD、rasG和rasS，因此，盤基網(wǎng)柄菌可作為人類Ras基因的研究模型.本文首先對(duì)盤基網(wǎng)柄菌RasD蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再對(duì)rasD基因缺陷株的趨電性進(jìn)行研究，以期為研究哺乳動(dòng)物腫瘤發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞(AX2)和rasD缺陷型細(xì)胞(rasD-)購自日本National BioResource Project.

1.1.2 氨基酸序列

從UniProt網(wǎng)站上獲得盤基網(wǎng)柄菌RasD蛋白的氨基酸序列，通過對(duì)RasD(NP_P03967)蛋白序列進(jìn)行BLASTP比對(duì)，獲得與之相似的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其中包括盤基網(wǎng)柄菌RasG(NP_P15064)、人類H-Ras4A (NP_P01112-1)、人類H-RasIDX (NP_P01112-2)、人類N-Ras(NP_P01111)、人類K-Ras 4A (NP_P01116-1)、人類K-Ras 4B(NP_P01116-2)、小鼠(NP_P32883)、果蠅(NP_P08646)、斑馬魚(NP_Q6AZA4)和秀麗隱桿線蟲(NP_Q03206).

1.1.3 溶液的配制

HL5培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨 10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鈉 0.965 g，磷酸二氫鉀 0.485 g，鏈霉素0.03 g，雙蒸水定容至1 L，pH6.5.在121 ℃高溫滅菌30 min后，自然冷卻，4 ℃保存(6個(gè)月).

10×Steinberg′s緩沖液：氯化鈉35.064 g，氯化鉀0.522 g，硫酸鎂1.972 g，硝酸鈣0.708 g，三羥甲基氨基甲烷1.696 g，雙蒸水定容至1 L ，pH 7.5，室溫保存.

DB緩沖液：磷酸氫二鈉1.269 g，磷酸二氫鉀0.680 g，硫酸鎂0.32 g，氯化鈣0.022 g，雙蒸水定容至1 L ，pH 6.5，室溫保存.

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

使用Paragram和ProtScale軟件分析該蛋白的理化性質(zhì)以及親水性/疏水性.利用MEGA-X軟件的近鄰相接法(neighbor-joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.通過PSIPRED軟件對(duì)RasD的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè).運(yùn)用軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)RasD的三級(jí)結(jié)構(gòu).利用STRING網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析(PPI)獲得RasD的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖，分析與RasD發(fā)生互作的蛋白質(zhì)及其發(fā)生互作后執(zhí)行的生物學(xué)功能.

1.2.2 細(xì)胞趨電性實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

取-80 ℃保存的菌株，置于超凈工作臺(tái)上，室溫下使其溶解.將菌液轉(zhuǎn)移到裝有10 mL HL5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).復(fù)蘇后的細(xì)胞需傳代3次后才能進(jìn)行趨電性實(shí)驗(yàn).

參考文獻(xiàn)[8]的方法，當(dāng)細(xì)胞饑餓3 h發(fā)生極化后，取適量的細(xì)胞種植于特制的加電小室中，貼壁10 min左右后，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加電刺激.電場(chǎng)強(qiáng)度為12 V/cm，并用實(shí)時(shí)錄像系統(tǒng)記錄細(xì)胞30 min的運(yùn)動(dòng)軌跡.用ImageJ軟件對(duì)細(xì)胞30 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)，最終獲得趨電方向性指數(shù)、方向持續(xù)性、軌跡速度和位移速度四個(gè)參數(shù)值.在數(shù)據(jù)分析時(shí)，所有數(shù)據(jù)至少是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.使用SPSS軟件(SPSS，Inc.，芝加哥，伊利諾伊州，美國(guó))進(jìn)行獨(dú)立性t檢驗(yàn)確定樣本處理之間的差異性，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 RasD蛋白的理化性質(zhì)

軟件分析顯示RasD含有187個(gè)氨基酸殘基，分子量為21 201.03，等電點(diǎn)為5.36，負(fù)電荷殘基數(shù)為30，正電荷殘基數(shù)為26，脂肪酸氨基酸指數(shù)為85.99，不穩(wěn)定指數(shù)為45.93，親水性平均指數(shù)為-0.493.親水性最強(qiáng)的氨基酸位于179，分值為-2.789，這個(gè)位點(diǎn)是賴氨酸；疏水性最強(qiáng)的氨基酸位于10，分值為2.144，這個(gè)位點(diǎn)是甘氨酸(圖1)，親水性肽鏈多于疏水性肽鏈，結(jié)合親水性平均指數(shù)為負(fù)值，說明 RasD是親水性蛋白質(zhì).

圖1 RasD的親水性/疏水性分析圖

2.2 RasD蛋白的同源性及進(jìn)化分析

盤基網(wǎng)柄菌RasD與人類(Homosapiens)N-Ras相似性最高，為72.29%;與人類H-Ras4A和H-RasIDX相似性分別為70.66%和71.33%；與人類K-Ras 4A和K-Ras 4B的相似性分別為64.92%和70.66%；與小鼠(Musmusculus)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、斑馬魚(Daniarerio)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的相似性分別是70.66%、65.45%、70.06%和29.85%.

模式生物Ras蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示，盤基網(wǎng)柄菌RasD蛋白與人類親緣關(guān)系最近，與小鼠、果蠅和斑馬魚的親緣關(guān)系較近，與秀麗隱桿線蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹圖

2.3 RasD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

RasD的二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖3，RasD屬于混合型蛋白，其中α螺旋有87個(gè)氨基酸，占46.52%，β折疊有12個(gè)氨基酸，占6.42%，無規(guī)則卷曲有50個(gè)氨基酸，占26.74%.

AA:氨基酸殘基; Conf:預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的可信度;Pred:預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu);Cart:預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的集合.

2.4 RasD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì) RasD蛋白進(jìn)行同源建模得到的最佳三維結(jié)構(gòu)模型如圖4，RasD蛋白建模圖的可信度值為0.79.所得到的三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板4dst.1有64.86%的一致性，覆蓋率達(dá)到0.99.

圖4 RasD三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 RasD蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

RasD的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)見圖5，分析比較發(fā)現(xiàn)RasD參與了許多生物過程(表1)，包括細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、對(duì)胞外刺激的調(diào)控、趨化性的調(diào)控和肌動(dòng)蛋白聚集的調(diào)控等，此外RasD還參與MAPK途徑的激活、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的調(diào)控和Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控等，說明RasD對(duì)于調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)非常重要.

圖5 RasD的蛋白互作圖

表1 RasD參與的生物過程

2.6 rasD缺陷型細(xì)胞的趨電性

野生型的盤基網(wǎng)柄菌在直流電場(chǎng)中朝向電場(chǎng)負(fù)極運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象稱為盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的趨電性(圖6A).從表2可以看出，在強(qiáng)度為12 V/cm的外源性直流電場(chǎng)中，野生型盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞株AX2的方向性為0.79±0.01，軌跡速度為(4.57±0.05)μm/min；rasD缺陷型細(xì)胞在相同強(qiáng)度的直流電場(chǎng)中的方向性為0.48±0.01，軌跡速度為(6.10±0.05)μm/min；野生型盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞AX2的位移速度是(1.73±0.03)μm/min，而rasD缺陷型細(xì)胞是(1.98±0.03)μm/min；野生型盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞AX2的方向持續(xù)性是0.37±0.004，而rasD缺陷型細(xì)胞是0.32±0.004，兩者有顯著性差異.以上結(jié)果表明，盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞中的rasD基因不僅參與了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，而且還參與調(diào)控細(xì)胞在電場(chǎng)中對(duì)方向的響應(yīng).

A:在強(qiáng)度為12 V/cm的外源性直流電場(chǎng)下,野生型AX2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡圖;B:在強(qiáng)度為12 V/cm的外源性直流電場(chǎng)下,rasD缺陷型細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡圖.

表2 rasD缺陷型細(xì)胞的趨電性結(jié)果

3 討論

生物信息學(xué)分析表明盤基網(wǎng)柄菌中RasD蛋白序列長(zhǎng)度為187個(gè)氨基酸殘基，屬于親水性蛋白，它與人類Ras蛋白家族成員之間的相似性較高.趨電性實(shí)驗(yàn)表明，缺失rasD基因的突變株在強(qiáng)度為12 V/cm的直流電場(chǎng)中朝向負(fù)極遷移的方向性顯著降低，然而速度卻顯著增加，說明rasD基因是參與盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞趨電性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，但rasD在電場(chǎng)中調(diào)控速度和方向的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

生物電信號(hào)是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞的趨電性以及由此形成的定向遷移具有較大的應(yīng)用潛能[15-17].例如，一些研究者嘗試用直流電場(chǎng)治療一些接近淺表部位的腫瘤[11]；或者利用特定頻率和強(qiáng)度的交流電場(chǎng)選擇性地破壞癌細(xì)胞的有絲分裂，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療的目的[18]；甚至有一些臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)應(yīng)用于對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療[19-20].然而，人們對(duì)細(xì)胞趨電性機(jī)制研究的滯后，限制了臨床上對(duì)生物電信號(hào)的應(yīng)用.因此，借助一些模式生物來揭示細(xì)胞趨電運(yùn)動(dòng)的機(jī)制勢(shì)在必行，也是開發(fā)生物電信號(hào)資源的前提和基礎(chǔ).