云南野生番石榴青果中多糖和多酚等活性成分的提取條件研究*

龔英， 聶森， 譚雪， 鐘金鳳， 陶雪， 晏勻清， 張婉嫕， 陳繼平

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

番石榴是一種原產(chǎn)美洲的熱帶水果，通過引種傳播后，現(xiàn)已廣泛分布在全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國南方很多省區(qū)均有分布[1-5].由于從栽培區(qū)逃逸，四川攀枝花市和云南麗江華坪縣現(xiàn)有大量野生番石榴(圖1)[6].野生番石榴果實呈球形，幼果外皮為青色，成熟時外皮為金黃色，果肉為紅色，果籽為黃色.

圖1 野生番石榴及未成熟青果的切片

番石榴果實的季節(jié)性強，外皮非常薄，不耐儲存，極易變質(zhì).研究證實，即使采用氣調(diào)包裝番石榴全果[7]、用生物膜包覆番石榴全果[8-11]、切片[12]或利用超聲波輔助干燥番石榴切片[5,13]都僅僅能短暫延長番石榴的保存期，并不能從根本上克服番石榴水果的季節(jié)特性，這嚴重影響對其進一步開發(fā)利用.

番石榴全身是寶，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值.番石榴葉富含多糖、多酚和黃酮類活性物質(zhì)，具有抗氧化和抗糖化[14-18]、抗真菌[19]、抑制細菌[20]、治療急性傳染性腹瀉[21]、抗炎[22]及抗癌[3,23]等作用.番石榴果實也含有類似的活性物質(zhì)，具有一定的藥用價值.郭開平等人研究發(fā)現(xiàn)從番石榴果實中提取的多糖能顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平[24].據(jù)廣東省中藥標準(第一冊)收載，未成熟番石榴幼果的果汁具有降血糖作用[25].此外，番石榴中多酚和黃酮等活性成分具有抗氧化作用[26-27].因此如何高效提取番石榴果實中多糖、多酚和黃酮三類活性組分，成為番石榴功能性食品開發(fā)的關(guān)鍵問題.以云南野生番石榴未成熟青果為原料，擬采用表面活性劑輔助水提法提取多糖、多酚和黃酮三類活性組分.先通過單因素實驗對三組分的提取工藝條件進行初步篩選，再通過正交試驗進一步優(yōu)化提取條件，以期為云南野生番石榴的功能性食品開發(fā)提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生番石榴未成熟青果采自云南省麗江市華坪縣，采集時間為2021年6月.將青果切成各邊長度為3～5 mm的方塊，自然晾干，備用.

標準品沒食子酸的純度為99%，蘆丁的純度為95%，均購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；標準品D(+)-無水葡萄糖的純度為99%，購買于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)為分析純，購買于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鎢酸鈉、磷鉬酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、蒽酮、濃硫酸和磷酸為常規(guī)化學(xué)試劑，均為分析純.

電子天平(型號PR224ZH/E，奧豪斯儀器(常州)有限公司)；恒溫振蕩器(型號SHZ-82，常州國華電器有限公司)；紫外可見分光光度計(型號UV-1800，上海美譜達儀器有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 提取操作簡介

稱取一定量的番石榴原料，按比例加入預(yù)先調(diào)整好SDS濃度和pH值的蒸餾水，在規(guī)定的溫度條件下，振蕩提取至適當時間后，過濾得提取液.

1.2.2 單因素實驗

按照1.2.1所述實驗方法，以干的番石榴青果為原料，設(shè)計料液比(1∶8、1∶10、1∶12，質(zhì)量比)、單次提取時間(2 h、3 h、4 h)、提取次數(shù)(1次、2次、3次)、振蕩速度(30 r/min、60 r/min、90 r/min)、SDS濃度(0、0.2%、0.4%，質(zhì)量分數(shù))、提取pH值(5、7、9)、提取溫度(15 ℃、30 ℃、45 ℃)七組單因素實驗，研究七個因素對多糖、多酚和黃酮三種活性組分提取量的影響.在單因素實驗中，除要考察的那個因素外，其余因素均固定為中間值水平.

1.2.3 正交試驗

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，選取影響最大的4個因素，設(shè)計四因素三水平正交試驗，進一步優(yōu)化提取條件.正交試驗設(shè)計中未考查的3個因素，取單因素實驗確定的水平.

1.2.4 提取液的分析

多糖含量的測定：以葡萄糖為標準品，采用蒽酮-硫酸溶液顯色法，測定番石榴提取液中多糖含量.然后，依據(jù)提取過程的料液比，計算出番石榴青果多糖提取量.

多酚含量的測定：以沒食子酸為標準品，采用Folin-酚法，測定番石榴提取液中多酚含量.然后，依據(jù)提取過程的料液比，計算出番石榴青果多酚提取量.

黃酮含量的測定：以蘆丁為標準品，采用離子絡(luò)合法，測定番石榴提取液中黃酮含量.然后，依據(jù)提取過程的料液比，計算出番石榴青果黃酮提取量.

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗平行測定3次，采用OriginPro 8 SR3軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，求得平均值和標準偏差，并進行繪圖.在正交試驗中，分別取多糖、多酚和黃酮提取量的平均值，利用正交助手軟件，采用極差法，分析各因素對三組分提取量的影響，并優(yōu)化提取條件.

2 實驗結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對三組分提取量的影響

料液比是指番石榴原料與提取溶液的質(zhì)量比.料液比對番石榴青果中多糖、多酚和黃酮三種活性組分提取量的影響如圖2所示.由圖2可知，隨著料液比增加，三組分的提取量呈明顯上升趨勢.當料液比由1∶8提高到1∶10時，多糖、多酚和黃酮的提取量分別增加了25.0%、21.0%和14.4%，但是當料液比從1∶10提高到1∶12時，三組分提取量增長幅度明顯變小，分別為2.0%、1.3%和5.3%.在保證提取量的前提下，從降低提取用水量考慮，可將料液比固定為1∶10.

圖2 料液比對三組分提取量的影響

2.1.2 單次提取時間對三組分提取量的影響

單次提取時間對番石榴青果中多糖、多酚和黃酮提取量的影響如圖3所示.由圖3可知，隨著單次提取時間增加，三組分的提取量呈明顯上升趨勢.當單次提取時間從2 h延長至3 h時，多糖、多酚和黃酮的提取量分別增加了16.2%、17.9%和6.8%，但是當單次提取時間從3 h延長到4 h時，三組分提取量的增長幅度降低，分別為5.1%、4.4%和3.3%.這是因為初始時隨著提取時間的增加，番石榴固體原料中三種活性組分溶出量增加，并不斷向溶液中轉(zhuǎn)移，從而提高提取量.但當提取溶液與番石榴原料中三組分濃度達到平衡時，繼續(xù)延長提取時間對于提取量影響變小.因此，從縮短提取時間考慮，可將單次提取時間固定為3 h.

圖3 提取時間對三組分提取量的影響

2.1.3 提取次數(shù)對三組分提取量的影響

提取次數(shù)對番石榴青果中多糖、多酚和黃酮三種活性組分提取量的影響如圖4所示.由圖4可知，隨著提取次數(shù)增加，三組分的提取量呈上升趨勢.當提取次數(shù)從1次增加到2次時，多糖、多酚和黃酮的提取量分別增加了69.7%、60.2%和42.5%，但是當提取次數(shù)增加到3次時，三組分提取量僅分別增加了16.8%、15.8%和7.0%.因此，從簡化提取流程考慮，可將提取次數(shù)固定為2次.

圖4 提取次數(shù)對三組分提取量的影響

2.1.4 振蕩速度對三組分提取量的影響

振蕩速度對番石榴青果中多糖、多酚和黃酮三種活性組分提取量的影響如圖5所示.由圖5可知，隨著振蕩速度增加，三組分的提取量僅略微上升.當振蕩速度從30 r/min提高到60 r/min時，多糖、多酚和黃酮的提取量分別增加了3.4%、7.4%和7.9%；當振蕩速度從60 r/min提高到90 r/min，三組分的提取量分別增加了1.9%、0.5%和3.9%.提高振蕩速度，有助于水分子在提取溶液與番石榴原料中運動交換，從而加速三組分的溶出.但是，當振蕩速度提高到一定量時，水分子運動對于組分溶出的影響變小.因此，從降低能耗考慮，可將振蕩速度固定為60 r/min.

圖5 振蕩速度對三組分提取量的影響

2.1.5 SDS濃度對三組分提取量的影響

表面活性劑SDS濃度對番石榴青果中多糖、多酚和黃酮三種活性組分提取量的影響如圖6所示.由圖6可知，加入0.2%SDS后，多糖、多酚和黃酮三組分的提取量顯著增加，增長幅度分別為43.7%、65.9%和52.6%.當SDS濃度從0.2%提高到0.4%時，三組分提取量的增長量變小，增長幅度分別為3.9%、3.8%和5.6%.25 ℃時，SDS的臨界膠束濃度(CMC)為0.008 mol/L，即質(zhì)量濃度為0.2%.當SDS濃度達到CMC時，溶液中會形成大量的膠束，可將三組分增溶于膠束內(nèi)核，從而增強三組分的溶解和提取.當SDS濃度進一步增高到0.4%時，溶液中膠束量會進一步增加，但是當三組分在番石榴原料和溶液中濃度達到平衡時，SDS膠束濃度對于提取量影響較小.基于此，從降低物質(zhì)消耗考慮，可將表面活性劑濃度固定為0.2%.

圖6 SDS濃度對三組分提取量的影響

2.1.6 提取pH值對三組分提取量的影響

提取pH值對番石榴青果中多糖、多酚和黃酮三種活性組分提取量的影響如圖7所示.由圖7可知，不同pH值時三組分的提取量顯著不同.總體而言，在酸性和堿性條件下，三組分提取量均高于中性條件.這是因為在酸性或堿性條件下，多糖、多酚和黃酮三組分能夠發(fā)生離解，以增加其水溶性，從而提高提取量.此外，當pH值為5時，三組分的提取量均略高于pH值為9時.因此，可以采用酸提法促進三組分的提取，即將提取液的pH值調(diào)整為5.

圖7 提取pH值對三組分提取量的影響

2.1.7 提取溫度對三組分提取量的影響

提取溫度對番石榴青果中多糖、多酚和黃酮三種活性組分提取量的影響如圖8所示.由圖8可知，隨著提取溫度增加，三組分的提取量呈明顯上升趨勢.當提取溫度從15 ℃提高到30 ℃時，多糖、多酚和黃酮的提取量分別增加了7.4%、7.5%和11.2%；當提取溫度繼續(xù)提高到45 ℃時，三組分的提取量進一步提高，增加量分別為11.4%、9.7%和19.1%.隨著提取溫度的升高，水分子在提取溶液與番石榴原料中運動交換速度加快，從而加速三組分的溶出，提高提取量.

圖8 提取溫度對三組分提取量的影響

考慮到昆明地區(qū)水沸騰溫度在94 ℃左右，前期預(yù)備實驗考查了90、75、60、45 ℃和15 ℃五個溫度條件下三組分的提取量，發(fā)現(xiàn)溫度≥60 ℃時，三組分的提取量明顯低于45 ℃，因此，實驗中溫度因素僅展示了15、30 ℃和45℃三個條件的提取結(jié)果.其原因可能為：多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，多酚是一類具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物，黃酮類物質(zhì)是由兩個具有酚羥基的苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳原子相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，這三類組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)在高溫下不穩(wěn)定，易被氧化破壞，導(dǎo)致較高溫度條件下的提取量更低.因此，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，可將提取溫度設(shè)定為45 ℃.

2.1.8 單因素實驗結(jié)果的分析

綜合上述單因素實驗研究發(fā)現(xiàn)，在番石榴未成熟青果中，多糖含量最高，其次是黃酮，最少的是多酚.根據(jù)各因素水平改變后多糖、多酚和黃酮提取量的變化值，綜合能耗、物質(zhì)消耗及時間成本等，由單因素實驗初步篩選的各因素水平如下：料液比為1∶10，單次提取時間為3 h，提取次數(shù)為2次，振蕩速度為60 r/min，SDS濃度為0.2%，提取pH值為5，提取溫度為45 ℃.經(jīng)實驗測定，在此條件下，多糖、多酚和黃酮的提取量分別為(246.68±4.58)mg/g、(24.78±0.79)mg/g和(73.63±1.27)mg/g，略高于前面展示的所有單因素實驗的最大提取結(jié)果.

基于單因素實驗的提取結(jié)果，進一步計算得到七個因素對三組分提取量的影響如表1所示.根據(jù)三組分總的變化幅度數(shù)值的高低，七個因素的影響大小次序為提取次數(shù)、SDS濃度、料液比、提取溫度、單次提取時間、提取pH值和振蕩速度.選取影響最大的前4個因素，設(shè)計正交試驗如表2所示，分析9個實驗中多糖、多酚和黃酮提取量.在正交試驗中，其余三個因素的水平按照單因素實驗結(jié)果確定如下：單次提取時間為3 h，提取pH值為5，振蕩速度為60 r/min.

表1 七個因素對三組分提取量的影響大小

當提取pH值改變時，三組分提取量的變化幅度取絕對值；總變化量為多糖、多酚和黃酮提取量的變化幅度之和.

表2 正交試驗設(shè)計

正交試驗因素的排列順序按照單因素實驗的開展順序列舉.

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗中多糖、多酚和黃酮的提取量測定結(jié)果分別如表3、表4和表5所示.表中3種活性物質(zhì)的提取量為3次測定結(jié)果的平均，然后進一步利用提取量的平均值進行極差分析.考查的四個因素對多糖、多酚和黃酮提取量的影響大小次序均為提取次數(shù)(B)>SDS濃度(C)>料液比(A)>提取溫度(D)，這個影響規(guī)律與單因素實驗的結(jié)論是一致的.對于考查的4個因素，優(yōu)選的實驗組合為A3B3C3D3.在此優(yōu)選條件下，多糖、多酚和黃酮的提取量分別為(289.27±5.15)mg/g、(41.09±0.91)mg/g和(88.55±1.19)mg/g，此結(jié)果略高于9個正交試驗的提取量結(jié)果.相對于單因素實驗初步篩選確定出來的提取條件，在正交試驗優(yōu)化的條件中，料液比更大，為1∶12；提取次數(shù)更多，為3次，SDS濃度更高，為0.4%；因此，在正交試驗優(yōu)選條件下，三組分提取量略高于單因素實驗的優(yōu)選條件.

表3 正交試驗中多糖提取量

表4 正交試驗中多酚提取量

表5 正交試驗中黃酮提取量

綜上所述，為進一步提高三組分的提取量，根據(jù)正交試驗結(jié)果，可將番石榴未成熟青果中多糖、多酚和黃酮的提取條件優(yōu)選確定如下：料液比為1∶12，單次提取時間為3 h，提取次數(shù)為3次，振蕩速度為60 r/min，SDS濃度為0.4%，提取pH值為5，提取溫度為45 ℃.

3 討論

產(chǎn)地對于番石榴果實的組分含量具有重要影響，例如采摘于廣東省湛江市河唇鎮(zhèn)的珍珠番石榴果干粉中多糖含量為56.8 mg/g，多酚含量為1.81 mg/g，黃酮含量為1.94 mg/g[28]；泰國產(chǎn)三種常見番石榴鮮果中多酚含量為0.32～1.15 mg/g、黃酮含量為0.36～3.18 mg/g[3].此外，提取方法不同，番石榴果實中活性組分的提取量也會存在明顯差異.例如，鄺高波利用微波輔助提取廣東湛江產(chǎn)的番石榴，發(fā)現(xiàn)多酚的提取量為(1.78±0.38)mg/g[26]，而曹增梅等人利用超聲波輔助提取廣東湛江產(chǎn)的番石榴，發(fā)現(xiàn)多酚的提取量為4.65 mg/g[27]；以80%丙酮為提取溶劑，華南地區(qū)紅心番石榴鮮果的果皮和果肉提取物中多酚含量分別為10.80 mg/g和4.48 mg/g，黃酮含量分別為5.05 mg/g和2.13 mg/g[29].

對比文獻資料發(fā)現(xiàn)：(1)云南省華坪縣野生番石榴青果中多糖、多酚和黃酮活性組分含量明顯高于其他地區(qū)的栽培品種.多糖、多酚和黃酮是番石榴果實中已經(jīng)證實的生理活性組分，說明云南野生番石榴提取物具有藥食兩用價值，有進一步開發(fā)利用的潛力.(2)研究以水為提取溶劑，利用符合藥用安全的低濃度的表面活性劑SDS(《中國藥典》(2020版))為助溶劑，能同時增強水溶性多糖、多酚和黃酮這三種組分的提取溶出，為賦予番石榴多功能特性提供物質(zhì)基礎(chǔ)，此方法能克服有機溶劑的毒性問題，具有安全高效的特點.

4 結(jié)語

以多糖、多酚和黃酮三組分提取量為指標，經(jīng)單因素實驗對云南野生番石榴未成熟青果中三組分的提取工藝條件進行初步篩選.再通過正交試驗進一步優(yōu)化提取條件.在7個實驗因素中，對三組分提取量影響最大的兩個因素是提取次數(shù)和表面活性劑SDS濃度.下一步將會考慮將野生番石榴提取液制備成固體產(chǎn)品，從而延長番石榴的保存期，豐富番石榴產(chǎn)品的種類.