苦瓜皂苷與乳清蛋白水解物協(xié)同對(duì)二肽基肽酶-IV的抑制活性

于海坤，熱罕古麗，吳尚儀，陳佳麗，夏扣娜，李墨翰，岳喜慶

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝內(nèi)分泌疾病，主要由胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足、胰島素抵抗而引起的[1,2]，通常伴有多種慢性并發(fā)癥，導(dǎo)致多種器官系統(tǒng)嚴(yán)重受到損害，發(fā)病率極高，已成為一種常見(jiàn)且多發(fā)的疾病，對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害[3,4]。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)顯示，全球患糖尿病成人在2013年約有3.87億人，2019年已增至4.63億人，預(yù)計(jì)到2030年將超過(guò)5億，2045年高達(dá)7億左右[5]。目前臨床上對(duì)糖尿病的治療以口服降糖藥物和胰島素治療為主，如雙胍類[6,7]、促胰島素分泌劑類[8,9]、α-葡萄糖苷酶抑制劑類[10,11]、噻唑烷二酮類[12]、磺酰脲類等[13]。使用口服降糖藥在維持血糖控制方面有一定的效果，但不能預(yù)防糖尿病的長(zhǎng)期并發(fā)癥，長(zhǎng)期使用會(huì)伴有嚴(yán)重副作用[14,15]。而天然來(lái)源的二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）抑制劑能夠延長(zhǎng)腸促胰島素的有效時(shí)間，降低餐后血糖濃度，具有安全性能高，不易誘發(fā)體重增長(zhǎng)、低血糖等不良反應(yīng)，有效性及耐受性較好等優(yōu)點(diǎn)，是近些年新興治療二型糖尿病的一種方法[16,17]。因此毒副作用低且具有降低血糖活性的天然植物及其生物活性成分、功能因子是目前的研究熱點(diǎn)。

苦瓜享有“植物胰島素”之稱，其主要生物活性成分是皂苷和多糖，在降血糖方面有較好的功效，是迄今為止受贊譽(yù)最多、輔助治療糖尿病研究最廣泛的植物之一[18]。其中苦瓜皂苷（momordica saponins，MS）能夠一定程度上改善胰島素抵抗和增加胰島素敏感性能[19,20]，同時(shí)可以修復(fù)受損β細(xì)胞[21]，抑制腸道對(duì)葡萄糖的吸收[22]。此外，MS與其他降糖藥疊加使用可以更好的血糖控制。牛乳是一種低血糖指數(shù)（glycemic index，GI）食品，牛乳中的乳清蛋白可以顯著提高糖尿病人高 GI飲食時(shí)的胰島素水平，具有穩(wěn)定餐后血糖水平的作用[23]。臨床證實(shí)，乳清蛋白水解物比乳清蛋白本身更有助于糖尿病人的血糖控制[24]，乳清蛋白水解物中的生物活性肽具有抑制DPP-IV的活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性、改善胰島素抵抗等作用[25]，通過(guò)促進(jìn)胰高糖素肽分泌、提升腸促胰素含量、調(diào)節(jié)血糖、控制食物的攝入等降低餐后的血糖水平[26,27]。然而，苦瓜皂苷與乳清蛋白水解物協(xié)同降血糖的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。目前對(duì)于糖尿病的治療早已不單單依賴調(diào)節(jié)血糖藥物，而是通過(guò)藥物控制血糖，同時(shí)結(jié)合合理的膳食及適度的運(yùn)動(dòng)，因而尋找天然來(lái)源的DPP-IV抑制劑具有較高的研究?jī)r(jià)值，動(dòng)物源抑制劑與植物源抑制劑協(xié)同作用調(diào)節(jié)血糖有待進(jìn)一步研究。

本文研究乳清蛋白胃蛋白酶水解物（whey protein pepsin hydrolysates，WPPHs）、乳清蛋白胰蛋白酶水解物（whey protein trypsin hydrolysates，WPTHs）及MS的DPP-IV抑制活性，并進(jìn)行協(xié)同試驗(yàn)，測(cè)定消化后水解物及MS的DPP-IV抑制活性變化，并對(duì)其消化特性進(jìn)行評(píng)估，旨在通過(guò)此研究補(bǔ)充動(dòng)植物源抑制劑協(xié)同作用調(diào)節(jié)血糖作用機(jī)理，進(jìn)一步推進(jìn) DPP-IV抑制類降血糖功能性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜皂苷粉，市售苦瓜皂苷粉（皂苷含量為10%）；分離乳清蛋白粉（92%，食品級(jí)），新西蘭恒天然公司；鄰苯二甲醛（OPA），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶（酶活力≥250 U/mg），上海麥克林生化科技有限公司；胰蛋白酶（酶活力≥250 U/mg），鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DPP-IV抑制活性試劑盒，Abnova艾美捷科技有限公司

1.2 儀器與設(shè)備

JB-1型磁力攪拌器，天津市歐譜儀器儀表有限公司；VS-1渦旋儀，北京中時(shí)維興儀器設(shè)備公司；CR-21G離心機(jī)，日立公司；熒光酶標(biāo)儀，Eppendorf公司；FD5-3型真空低溫冷凍干燥機(jī)，上海龍捷儀器有限公司；7200-紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳清蛋白水解

乳清蛋白→配成質(zhì)量濃度為0.05 g/100 mL溶液→水浴處理(80 ℃10 min)→加蛋白酶水解→調(diào)節(jié)pH值→滅酶（90 ℃10 min）→冷卻至室溫→離心→取上清液備用

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以水解度及DPP-IV抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在不同影響因素下對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 胃蛋白酶、胰蛋白酶水解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)Table 1 Single factor test for optimizing hydrolysis conditions of pepsin and trypsin

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取 pH值（A）、酶解時(shí)間（B）、不同酶添加量（C）為自變量，以DPP-IV抑制率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2、3。

表2 胃蛋白酶水解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment for optimization of pepsin hydrolysis conditions

表3 胰蛋白酶水解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of response surface experiment for optimization of trypsin hydrolysis conditions

1.3.4 水解度測(cè)定

將400 μL去離子水、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液分別加入到盛有3 mL OPA試管中作為空白樣、標(biāo)準(zhǔn)樣、樣品，精準(zhǔn)反應(yīng)2 min，立即測(cè)定其在340 nm波長(zhǎng)下的吸光度。為避免試驗(yàn)順序?qū)Y(jié)果產(chǎn)生影響，在試驗(yàn)開(kāi)始、結(jié)束時(shí)分別測(cè)定絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次并取均值。水解度如下式計(jì)算：

式中：

h——水解肽鍵數(shù)；

htot——總肽鍵數(shù)；

ODS1——樣品吸光值；

ODS2——標(biāo)準(zhǔn)樣絲氨酸吸光值；

ODB——空白樣去離子水吸光值；

M——絲氨酸溶液濃度，mol/L；

X——樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 DPP-IV抑制率測(cè)定

參考 Matheeussen等[28]的方法略有修改。將DPP-IV分析緩沖液、人重組 DPP-IV（DPP-IV與DPP-IV分析緩沖液體積比為 1:5）、質(zhì)量濃度為 1 mmol/L西他列汀陽(yáng)性對(duì)照抑制劑、DPP-IV底物按順序準(zhǔn)確移取至96孔板中，加樣量見(jiàn)表4。

放置烘箱中37 ℃溫育30 min，在激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm的熒光酶標(biāo)儀中測(cè)定其熒光強(qiáng)度，DPP-IV抑制率按下式計(jì)算：

式中：

I——樣品DPP-IV抑制率；

OD1——陰性對(duì)照組熒光吸光度；

OD2——樣品組熒光吸光度。

表4 各試劑添加量和順序Table 4 Addition amount and order of each reagent (unit: μL)

1.3.6 與乳清水解物協(xié)同作用

將濃度為1 mg/mL乳清蛋白胃蛋白酶水解物、乳清蛋白胰蛋白酶水解物分別與0.2 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL MS混合均勻，以DPP-IV抑制率作為指標(biāo)考察其協(xié)同作用。

1.3.7 胃腸道消化模擬試驗(yàn)

模擬胃消化：取適量樣品在 5%甲酸中溶解為質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液，胃蛋白酶添加量為1%，在37 ℃條件下孵育1 h。在100 ℃水中加熱5 min后停止反應(yīng)，每種樣品至少重復(fù)三次試驗(yàn)。

模擬腸道消化：取適量樣品溶解于磷酸鹽緩沖液（pH=7.0），其中彈性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶添加量分別為0.2%、1%和1%，在37 ℃條件下孵育1 h。在100 ℃水中加熱5 min后停止反應(yīng)，每種樣品至少重復(fù)三次試驗(yàn)[29]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù) 3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，選用SPSS（version 22.0）統(tǒng)計(jì)分析及Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為該數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)乳清蛋白水解度及 DPP-IV抑制率的影響

由圖1可知，在試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)，胃蛋白酶、胰蛋白酶水解乳清蛋白的水解度呈遞增趨勢(shì)（p＜0.05），在不同時(shí)間段內(nèi)水解度增大趨勢(shì)存在明顯差異，剛開(kāi)始水解時(shí)由于酶可作用的肽鍵數(shù)較多，水解度增加明顯，底物濃度隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)而降低，可被催化的酶切位點(diǎn)逐漸減少，導(dǎo)致水解度增加趨勢(shì)減緩。水解物 DPP-IV抑制率的變化趨勢(shì)為先上升后下降，WPPHs、WPTHs的DPP-IV抑制率分別在2 h時(shí)、4 h時(shí)最高，DPP-IV抑制率均為14.05%，隨著酶解時(shí)間逐漸延長(zhǎng)DPP-IV抑制率顯著下降（p＜0.05），與吉薇[30]對(duì)南極磷蝦蛋白源 DPP-IV抑制肽的研究結(jié)論一致?？赡苁堑鞍踪|(zhì)水解生成的肽含量增多，DPP-IV抑制率不斷上升，但持續(xù)水解，酶解程度過(guò)大，導(dǎo)致得到活性多肽進(jìn)一步水解成氨基酸，多肽含量降低，DPP-IV抑制活性也隨之降低[31]。

2.1.2 水解pH值對(duì)乳清蛋白水解度及DPP-IV抑制率的影響

不同蛋白酶存在最適pH范圍，由圖2可知，胃蛋白酶、胰蛋白酶水解乳清蛋白水解度及水解物DPP-IV抑制率隨pH值增加均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。pH值分別在2.5、8時(shí)，二者均達(dá)到最大值，隨著pH值繼續(xù)增大水解度及DPP-IV抑制活性顯著降低（p＜0.05），與劉利軍等[32]在酶法水解乳清蛋白過(guò)程中對(duì)pH的優(yōu)化研究結(jié)果相近。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是pH影響酶分子的構(gòu)象以及酶與底物的結(jié)合和催化，在酸堿不適宜條件下，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的許多非共價(jià)鍵受到干擾，使蛋白酶的空間構(gòu)型產(chǎn)生變化，導(dǎo)致酶活力降低甚至失活[33]；推測(cè)也可能是DPP-IV抑制肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使其活性下降。因此胃蛋白酶、胰蛋白酶水解乳清蛋白最優(yōu)pH值分別為2.5和8。

2.1.3 酶添加量對(duì)乳清蛋白水解度及 DPP-IV抑制率的影響

由圖 3可知，胃蛋白酶、胰蛋白酶水解乳清蛋白水解度隨著酶添加量增加呈上升趨勢(shì)，在 2%～4%與5%～6%時(shí)水解度顯著增高（p＜0.05）。酶添加量較小時(shí)，底物濃度過(guò)高，底物大多都堆積在酶活動(dòng)中心，阻礙產(chǎn)物分子的擴(kuò)散及水解速度；酶添加量適宜時(shí)，酶能夠很好地作用于均勻分布在酶周圍的底物，水解度增加；酶添加量過(guò)大時(shí)，雖然底物分散的更均勻，酶的濃度卻降低，酶解反應(yīng)速度減緩[34]。水解物DPP-IV抑制率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)逐漸分解，DPP-IV抑制率增大，在4%時(shí)DPP-IV抑制活性達(dá)到最大，WPPHs、WPTHs的DPP-IV抑制率分別為15.18%、14.97%。繼續(xù)添加蛋白酶后，蛋白分子水解完全，導(dǎo)致 DPP-IV抑制活性的多肽分子減少，這與Nongonierma等[35]的結(jié)論相似。

2.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶水解乳清蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 胃蛋白酶水解乳清蛋白響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表 5。將數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得各因素回歸方程為：Y=15.45+0.95A-0.23B+0.43C+0.35AB+0.51AC+0.78B C-1.08A2-0.92B2-2.24C2，利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 胃蛋白酶水解乳清蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of response surface test of pepsin hydrolysis of whey protein

由表6可知，該回歸模型F值為28.36，p＜0.01，差異極顯著，失擬項(xiàng)F值為1.78，p＞0.05，差異不顯著，且R2為0.9733，R2adj為0.9390，表明該WPPHs模型成立且設(shè)計(jì)合理。由 F值可以判斷出各因素對(duì)WPPHs的DPP-IV抑制率的影響順序?yàn)椋簆H值（A）＞酶添加量（C）＞酶解時(shí)間（B）。

在響應(yīng)面分析中，響應(yīng)面曲面傾斜度、等高線形狀反映交互作用的程度，響應(yīng)面曲面越陡、等高線形狀越接近橢圓形因素間的交互作用顯著，反之，則交互作用不顯著[36,37]。通過(guò)對(duì)圖4中的響應(yīng)面及等高線的形狀分析發(fā)現(xiàn)，與AB相比，AC、BC等高線的形狀更接近橢圓形，響應(yīng)面傾斜度更陡峭，因此判斷酶添加量與pH值及酶解時(shí)間之間的交互作用比pH值與酶解時(shí)間之間的交互作用對(duì)DPP-Ⅳ抑制率影響較顯著。

2.2.2 胰蛋白酶水解乳清蛋白響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 胰蛋白酶水解乳清蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7 Design and results of response surface test for trypsin hydrolysis of whey protein

表8 乳清蛋白胰蛋白酶水解物DPP-IV抑制活性回歸模型方差分析Table 8 Regression model variance analysis to inhibition rate of DPP-IV of pepsin hydrolysis

響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表 7。將數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得各因素回歸方程為：Y=15.57+0.15A+0.092B+0.14C+0.13AB+0.79AC+0.17 BC-0.93A2-1.21B2-2.05C2，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8可知，該回歸模型F值為38.65，p＜0.01，差異極顯著，失擬項(xiàng)F值為5.99，p＞0.05，差異不顯著，且R2為0.9803，R2adj為0.9549，表明該WPTHs模型成立且設(shè)計(jì)合理。由 F值可以判斷出各因素對(duì)WPTHs的DPP-IV抑制率的影響順序?yàn)椋簆H值（A）＞酶添加量（C）＞酶解時(shí)間（B）。

由圖5可知，pH值與酶添加量及酶解時(shí)間與酶添加量之間的交互作用響應(yīng)面傾斜度更陡峭，等高線的形狀更接近橢圓形，說(shuō)明它們二者的交互作用對(duì)WPTHs的DPP-IV抑制率的影響較大，pH值與酶解時(shí)間的交互作用影響較小，與表8的方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 水解最優(yōu)工藝條件及結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)試驗(yàn)分析得出乳清蛋白胃蛋白酶水解優(yōu)化通過(guò)回歸方程求解得到最佳提取工藝條件為pH值2.74、酶解時(shí)間2.02 h、酶添加量4.15%，根據(jù)實(shí)際操作調(diào)整為pH值2.7，酶解時(shí)間2 h，酶添加量4%。按照優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取均值得此水解物的DPP-IV抑制率為15.43%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差僅為 0.28%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠；對(duì)乳清蛋白胰蛋白酶水解優(yōu)化，通過(guò)回歸方程求解得到最佳提取條件為pH值7.57、酶解時(shí)間3.99 h、酶添加量3.87%，根據(jù)實(shí)際操作調(diào)整為pH值7.6、酶解時(shí)間4 h、酶添加量4%。據(jù)以上最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證可得此水解物的DPP-IV抑制率為14.62%，與預(yù)測(cè)值14.80%幾乎一致，充分驗(yàn)證了試驗(yàn)效果較好。

2.3 DPP-IV抑制率測(cè)定結(jié)果

將優(yōu)化條件下得到的WPPHs、WPTHs及MS分別配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL，測(cè)定其DPP-IV抑制率。WPPHs質(zhì)量濃度與其 DPP-IV 抑制率的擬方程為y=0.0864x+0.0014（R2=0.9992）；WPTHs質(zhì)量濃度與其 DPP-IV抑制率擬方程為 y=0.0685x+0.0012（R2=0.9990）；MS質(zhì)量濃度與其DPP-IV抑制率的擬方程為 y=0.0955x+0.0036（R2=0.9992），將抑制率為50%代入公式可得胃蛋白酶水解物抑制 DPP-IV的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為5.77 mg/mL；胰蛋白酶水解物抑制DPP-IV的IC50為 7.28 mg/mL；MS抑制 DPP-IV 的 IC50為 7.28 mg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論相似[38,39]。

2.4 MS與乳清水解物協(xié)同作用研究

由圖6可知，將不同劑量MS與WPPHs和WPTHs的DPP-IV抑制率進(jìn)行比較可得：MS劑量不斷提高，MS的DPP-IV抑制率也逐步上升；低劑量和高劑量組MS與水解物混合物DPP-IV抑制率較兩種成分抑制率單獨(dú)累積相比無(wú)顯著性差異；而中劑量組MS與水解物混合物具有一定的協(xié)同作用，MS與 WPPHs和WPTHs復(fù)配的DPP-IV抑制率較兩種成分單獨(dú)累積相比，DPP-IV抑制率分別提高6.54%與3.76%。由此推測(cè)，當(dāng)MS與水解物體積比為1:1時(shí)具有一定的協(xié)同作用，其混合物抑制作用效果顯著高于兩者單獨(dú)累加（p＜0.05）。水解物占比過(guò)高時(shí)，抑制率主要取決于水解物或兩種成分的單獨(dú)作用，因此未產(chǎn)生相互作用與影響；當(dāng)MS的占比過(guò)高時(shí)，水解物因含量較少?gòu)亩茨鼙憩F(xiàn)出協(xié)同作用。

2.5 胃腸道消化模擬實(shí)驗(yàn)

由圖7可知，WPPHs、WPTHs及MS經(jīng)過(guò)模擬胃腸道消化后 DPP-IV抑制率均發(fā)生顯著改變（p＜0.05）。WPPHs的DPP-IV抑制率經(jīng)胃消化后降低2.02%，而經(jīng)腸道消化后DPP-IV抑制率卻升高2.23%，推測(cè)可能腸道內(nèi)的酶對(duì)WPPHs進(jìn)一步水解，使得具有DPP-IV抑制活性的肽段含量大幅度增加，因此其抑制作用增強(qiáng)；WPTHs的DPP-IV抑制率經(jīng)胃消化后升高0.99%，但是經(jīng)過(guò)腸道消化后DPP-IV抑制率降低 4.12%，推測(cè)消化過(guò)程有新的酶參與水解，使水解物的組成成分發(fā)生變化，有部分肽鏈斷裂導(dǎo)致新的小分子多肽生成[40]；MS的DPP-IV抑制率經(jīng)胃消化后顯著升高7.01%，經(jīng)腸道消化后降低2.70%，推測(cè)可能是 pH值對(duì) MS的抑制效果產(chǎn)生了影響。Velarde-Salcedo等[41]研究的莧菜蛋白水解物及董宇婷[38]研究的燕麥多肽水解產(chǎn)物在經(jīng)過(guò)胃腸消化后DPP-IV抑制率出現(xiàn)一定程度的下降；張穎等[42,43]對(duì)牛羊乳酪蛋白、鰱魚(yú)水解產(chǎn)物研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過(guò)體外消化后 DPP-IV抑制活性并沒(méi)有顯著的變化；而Nongonierma等[35]及Huang等[44]分別對(duì)乳清蛋白胰酶酶解物、三條金槍魚(yú)肉蛋白水解物的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，胃腸模擬消化會(huì)顯著增加其水解產(chǎn)物的DPP-IV抑制活性。經(jīng)腸胃消化后不同來(lái)源于蛋白水解物 DPP-IV抑制活性穩(wěn)定性存在差異，可能與所含的關(guān)鍵有效活性肽組分的氨基酸序列結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定了WPPHs及WPTHs具有DPP-IV抑制活性。當(dāng)pH值2.7，酶解時(shí)間2 h，酶添加量4%時(shí)，WPPHs的DPP-IV抑制率最高為15.43%，IC50為5.77 mg/mL；當(dāng)pH值7.6、酶解時(shí)間4 h、酶添加量4%時(shí)，WPTHs的DPP-IV抑制率最高為14.62%，IC50為7.28 mg/mL，胃蛋白酶水解物的抑制活性高于胰蛋白酶水解物。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)MS也具有DPP-IV抑制活性，IC50為5.20 mg/mL，MS與WPPHs和WPTHs復(fù)配體積比為1:1時(shí)還具有協(xié)同抑制DPP-IV活性作用，DPP-IV抑制率分別提高6.54%與 3.76%，其抑制效果顯著高于兩者單獨(dú)累加（p＜0.05）。通過(guò)體外試驗(yàn)可知，WPPHs的DPP-IV抑制率經(jīng)胃消化后顯著下降（p＜0.05），經(jīng)腸道消化后DPP-IV 抑制率卻顯著升高（p＜0.05），而 WPTHs及MS胃腸消化后結(jié)果則相反。試驗(yàn)為動(dòng)植物源DPP-IV抑制劑研究提供了新思路，也為DPP-IV抑制類降血糖功能性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)和科學(xué)參考。