miR-let-7b-5p對(duì)急性胰腺炎AR42J細(xì)胞凋亡及自噬的作用研究*

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000)

急性胰腺炎是消化系統(tǒng)常見疾病之一，一旦發(fā)展為重癥，病死率高。有研究表明，在急性胰腺炎的病情發(fā)展過程中，凋亡和自噬起著重要的作用[1]。miRNA是一種短鏈非編碼RNA，能通過抑制轉(zhuǎn)錄或者降解mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在凋亡和自噬的信號(hào)通路調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-494抑制急性胰腺炎時(shí)促凋亡蛋白R(shí)OCK1和PTEN的表達(dá)，進(jìn)而抑制胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，促進(jìn)急性胰腺炎的發(fā)展[2]。miR-155通過靶向Rictor加重雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎AR42J細(xì)胞自噬受損[3]。miR-let-7家族是miRNA的一員，可通過直接或間接的方式有效抑制蛋白質(zhì)的翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和生長，在多種疾病中起著調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-let-7家族成員與胰腺疾病有關(guān)[4]，同時(shí)，miR-let-7家族也與凋亡、自噬密切相關(guān)[5-7]，miR-let-7b-5p作為miR-let-7家族的重要亞型之一，在多種疾病中被發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)節(jié)凋亡和自噬水平影響疾病進(jìn)展[8-9]，但是能否通過調(diào)控凋亡和自噬來影響急性胰腺炎的發(fā)病，目前尚未見報(bào)道。本文研究miR-let-7b-5p對(duì)急性胰腺炎AR42J凋亡和自噬的作用，以期為急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制以及臨床診療提供理論依據(jù)和研究思路。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J、Ham’s F-12K培養(yǎng)基 、多聚賴氨酸均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清購自Gibco公司；青-鏈霉素、胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2其他相關(guān)試劑和儀器 雨蛙素購自上海源葉生物科技有限公司；慢病毒購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司；TRIZOL 試劑購自賽默飛世爾科技公司，RT-qPCR引物、miRNA 第一鏈cDNA試劑盒購自上海生工；SYBR Green擴(kuò)增試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；mRNA第一鏈cDNA試劑盒、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、SDS-PAGE快速凝膠配制試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、20×TBST、封閉液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；彩虹Marker、Caspase-3抗體購自英國Abcam；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(4×)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；LC3抗體購自Proteintech；GAPDH抗體、兔抗鼠IgG HRP購自Affinity；PVDF膜購自美國 Millpore公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 將處于對(duì)數(shù)生長期的AR42J以1×105個(gè)/毫升濃度種板，含20%胎牛血清+1%青鏈霉素+Ham’s F-12K培養(yǎng)基，于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2～3 d換1次液，1周時(shí)以1∶2～1∶4的比例傳代。傳代后24 h貼壁，貼壁困難時(shí)，可采用0.1 mg/ml的多聚賴氨酸提前包被培養(yǎng)瓶。包被好的培養(yǎng)瓶，封口膜封口后存于4 ℃冰箱，1周內(nèi)用完。實(shí)驗(yàn)共分為4組，正常對(duì)照組：AR42J細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；陰性對(duì)照組：在完全培養(yǎng)基中添加含1×10-8mol/L的雨蛙素培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)染空載體慢病毒；miR-let-7b-5p過表達(dá)組：含1×10-8mol/L雨蛙素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，按照MOI=15，在培養(yǎng)基中添加LV-rno-MiR-let-7b-5p-mimic及HiTransG P病毒感染試劑，共培養(yǎng)16 h后更換新的完全培養(yǎng)基；miR-let-7b-5p低表達(dá)組：含1×10-8mol/L雨蛙素的完全培養(yǎng)基，按照MOI=10，在培養(yǎng)基中添加LV-rno-MiR-let-7b-5p-inhibition及HiTransG P病毒感染試劑，共培養(yǎng)16 h后更換新的完全培養(yǎng)基。

1.2.2慢病毒載體轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的篩選 常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞以1×105個(gè)/毫升的密度種板，慢病毒轉(zhuǎn)染24～72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，選取感染效率為80%左右的病毒濃度作為慢病毒的最終感染濃度。常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞稀釋到1000個(gè)/毫升種板，100～1000 μg/ml濃度范圍內(nèi)設(shè)置濃度梯度，選擇在10～14 d內(nèi)殺死全部細(xì)胞的新霉素濃度作為穩(wěn)轉(zhuǎn)株的最適篩選濃度，維持濃度減半。

1.2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) TRIZOL法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定所提取RNA的純度及濃度，試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6作為miR-let-7b-5p的內(nèi)參，GAPDH作為Caspase-3和LC3 Ⅱ的內(nèi)參，SYBR Green 、兩步法檢測擴(kuò)增效率，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。見表1。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)各基因引物序列

1.2.4Western Blot實(shí)驗(yàn) 采用添加了1%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液(強(qiáng))提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定各組樣品蛋白的濃度，以20 μg蛋白濃度進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜后，5%牛血清白蛋白封閉2 h，分別用1∶16 500的鼠抗兔單克隆抗體GAPDH、1∶1 000鼠抗兔的單克隆抗體Caspase-3和1∶3 000的鼠抗兔多克隆抗體LC3 Ⅱ 的一抗4 ℃搖床孵育過夜，IgG-HRP標(biāo)記的鼠抗兔二抗4 ℃搖床孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光( ECL) 顯影。利用 Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，用Caspase-3和LC3 Ⅱ蛋白條帶與GAPDH灰度值的比值計(jì)算各自的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad prism 9.0做圖。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)。兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析。P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1成功培養(yǎng)AR42J細(xì)胞 AR42J細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞貼壁生長，狀態(tài)良好。細(xì)胞生長緩慢，呈中空球形集落，上皮細(xì)胞樣，團(tuán)簇狀生長。給藥24 h后，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡。

2.2慢病毒轉(zhuǎn)染成功 轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到明亮紅色熒光，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有熒光，轉(zhuǎn)染效率>80%可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如圖1A所示。最終篩選出過表達(dá)慢病毒MOI=15，低表達(dá)慢病毒MOI=10，陰性對(duì)照組慢病毒MOI=10，最適遺傳新篩選濃度為400 μg/ml，維持濃度為200 μg/ml。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-let-7b-5p過表達(dá)/低表達(dá)慢病毒的轉(zhuǎn)染效果，我們用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測了轉(zhuǎn)染兩種慢病毒前后miR-let-7b-5p 的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)相比于陰性對(duì)照組，過表達(dá)組miR-let-7b-5p表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)，而低表達(dá)組miR-let-7b-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，如圖1B所示。

A：急性胰腺炎AR42J細(xì)胞；B：RT-qPCR驗(yàn)證慢病

2.3RT-qPCR檢測miR-let-7b-5p和Caspase-3、LC3 Ⅱ 的相對(duì)表達(dá)量 相比于正常對(duì)照組，陰性對(duì)照組的miR-let-7b-5p表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，Caspase-3 mRNA水平顯著升高(P<0.01)，LC3 Ⅱ mRNA水平顯著升高(P<0.01)，如圖2A所示。相比于陰性對(duì)照組，miR-let-7b-5p過表達(dá)組Caspase-3 mRNA水平降低(P<0.05)，LC3 Ⅱ mRNA水平顯著降低(P<0.01)；而miR-let-7b-5p低表達(dá)組Caspase-3 mRNA(P<0.01)水平顯著升高，LC3 Ⅱ mRNA水平顯著升高(P<0.01)，如圖2B所示。

2.4Western blot檢測Caspase-3和LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量 與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組的Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，如圖3A所示。與陰性對(duì)照組相比，miR-let-7b-5p過表達(dá)組Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)；而miR-let-7b-5p低表達(dá)組Caspase-3蛋白表達(dá)量增高(P<0.05)，LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量增高(P<0.05)，如圖3B所示。

A：與正常對(duì)照組相比，*為P<0.01；B：與陰性

A：與正常對(duì)照組相比，*為P<0.01，#為P<0.05；

3 討論

急性胰腺炎是一種臨床常見的疾病，目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制為胰腺分泌的胰蛋白酶原被過早激活，導(dǎo)致胰腺本身的自我消化，但是這一機(jī)制發(fā)生的具體調(diào)節(jié)過程目前尚不清楚。多項(xiàng)研究證實(shí)急性胰腺炎的發(fā)病與凋亡和自噬水平的升高密切相關(guān)[10-11]。在正常的胰腺中存在一定量的基礎(chǔ)凋亡和基礎(chǔ)自噬，有利于維護(hù)胰腺的健康狀態(tài)[12]，但是在某些致病因素的刺激下，凋亡和自噬發(fā)生異常，可導(dǎo)致這一過程出現(xiàn)紊亂，引發(fā)疾病。自噬與凋亡往往在急性胰腺炎中共同參與對(duì)胰腺細(xì)胞的調(diào)控，腺泡細(xì)胞凋亡常常被認(rèn)為是一種保護(hù)機(jī)制，而自噬則參與了胰蛋白酶原的激活[13]。抑制胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡可加重急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡可使炎癥反應(yīng)減輕，即細(xì)胞凋亡在急性胰腺炎的發(fā)病過程中起著保護(hù)作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎早期，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量明顯增多，并且這種變化與胰酶原的異常激活密切相關(guān)，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的自噬損傷可引發(fā)多種胰腺疾病，包括急性胰腺炎、慢性胰腺炎[15]，甚至是胰腺癌[16-17]。MiR-let-7b-5p作為miR-let-7家族的重要成員，在胰腺疾病中也有異常表達(dá)：miR-let-7家族存在于正常胰腺細(xì)胞內(nèi)，但在分化差的胰腺導(dǎo)管腺癌樣本中丟失[18]。

大鼠胰腺外分泌細(xì)胞株AR42J具有與胰腺外分泌細(xì)胞極其相似的生物學(xué)特性，這使得體外AR42J細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果能夠在很大程度上代表體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎主要引起胰腺腺泡細(xì)胞的損傷。Caspase-3是凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵蛋白之一，Caspase-3蛋白含量的改變，可反映出早期的細(xì)胞凋亡水平的變化。誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠腺泡細(xì)胞凋亡數(shù)量增加后，Caspase-3 活性明顯增加，急性胰腺炎的病理損傷和炎癥反應(yīng)減輕[19]。槲皮素3-O-蕓香糖苷可以引起凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)增加，促進(jìn)胰腺細(xì)胞的凋亡，減輕急性胰腺炎[20]。三七總皂苷可通過增加Caspase-3的表達(dá)減輕牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎病情[21]。LC3 Ⅱ的含量與自噬成正相關(guān)，LC3 Ⅱ蛋白的相對(duì)表達(dá)量，通?？梢杂脕矸从匙允傻幕钚宰兓?。研究發(fā)現(xiàn)LC3 Ⅱ在急性胰腺炎組織中，隨著炎癥的加重與炎癥反應(yīng)時(shí)間的推移，表達(dá)持續(xù)增高[22]。抑制急性胰腺炎AR42J細(xì)胞的AMPK磷酸化水平，可導(dǎo)致自噬通量受損，細(xì)胞內(nèi)自噬空泡的數(shù)量明顯增多[23]。本研究發(fā)現(xiàn)雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎AR42J細(xì)胞Caspase-3、LC3 Ⅱ mRNA和蛋白水平升高，與前人研究一致。

目前急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡、自噬的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)miR-let-7家族與凋亡、自噬和疾病進(jìn)展有關(guān)[8-9]，但是是否與急性胰腺炎細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)尚不明確。我們通過建立雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎細(xì)胞miR-let-7b-5p水平與正常對(duì)照組相比明顯降低。利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式上調(diào)急性胰腺炎細(xì)胞模型的miR-let-7b-5p的表達(dá)水平后，凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ表達(dá)降低，而下調(diào)miR-let-7b-5p的表達(dá)水平后，凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ表達(dá)升高，提示miR-let-7b-5p可能通過調(diào)控凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ的水平來進(jìn)一步調(diào)控急性胰腺炎的凋亡和自噬。

綜上所述，miR-let-7b-5p可通過調(diào)控凋亡蛋白Caspase-3和自噬蛋白LC3 Ⅱ的水平來進(jìn)一步調(diào)控急性胰腺炎的凋亡和自噬水平，miR-let-7b-5p或許能成為急性胰腺炎的新的診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。