液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在多囊卵巢綜合征診療中的應(yīng)用

楊覲瑜

多囊卵巢綜合癥（PCOS）是在育齡女性中普遍出現(xiàn)的以生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，以及內(nèi)分泌與新陳代謝功能失調(diào)為特點(diǎn)的臨床綜合征，通?；疾〉呐砸部捎捎跓o法實(shí)現(xiàn)正常排卵而發(fā)生月經(jīng)發(fā)育異常，更嚴(yán)重的時(shí)候甚至?xí)适芰虬l(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn);在此病的影響下又因內(nèi)分泌與新陳代謝失調(diào)，直接導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期新陳代謝紊亂，對(duì)患者的身體健康與生命安全帶來損害?；谠摷膊∫讓?dǎo)致內(nèi)分泌及代謝紊亂，而高雄激素血癥是診斷該病的主要依據(jù)，為此我們認(rèn)為利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）可精準(zhǔn)檢測血液中的雄激素水平，將對(duì)PCOS診斷有較好的應(yīng)用價(jià)值。

1液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

質(zhì)譜自1897年問世以來，就是一部多學(xué)科的交叉科學(xué)進(jìn)步史，將近有十幾項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)包括物理獎(jiǎng)以及化學(xué)獎(jiǎng)在內(nèi)，頒發(fā)給了與質(zhì)譜技術(shù)有關(guān)的科學(xué)研究和應(yīng)用，是當(dāng)代高精尖技術(shù)平臺(tái)之一。目前，液相分離色譜-質(zhì)譜聯(lián)用制備工藝方法（LC-MS/MS）已應(yīng)用于醫(yī)療、環(huán)境、食物、化學(xué)等多個(gè)行業(yè);質(zhì)譜儀研究是指將物質(zhì)轉(zhuǎn)換為帶電粒子，并按照各種物質(zhì)的質(zhì)荷比（m/z），把各種待測成分轉(zhuǎn)換到不同的質(zhì)量分析器來完成樣品研究，目前的質(zhì)量分析器一般包括如下幾類：四級(jí)桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器及飛行時(shí)間質(zhì)量分析器等。在醫(yī)療檢驗(yàn)領(lǐng)域，由于人體血液或生物樣品組成比較復(fù)雜，前處理需要純化和隔離后進(jìn)行精準(zhǔn)的檢測，質(zhì)譜儀擁有比液相色譜更有效的隔離速率和分離度，具有高靈敏度和高特異性特點(diǎn)，且一針進(jìn)樣即可測得多靶標(biāo)值，目前已作為臨床應(yīng)用檢驗(yàn)領(lǐng)域中最有前瞻性和創(chuàng)新性的技術(shù)手段之一，在臨床應(yīng)用檢測和疾病診斷方面都具有較好的應(yīng)用價(jià)值，也因此高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)代表了當(dāng)今的精確醫(yī)學(xué)中的精準(zhǔn)檢測，可以進(jìn)行多重解析物的同時(shí)檢測，因此對(duì)于健康評(píng)價(jià)和疾病診斷方面都有著重要意義。

LC-MS/MS分析的臨床應(yīng)用主要在以下幾方面：1.全譜氨基酸與全譜維生素的測定方法：因?yàn)?，全譜氨基酸與全譜維生素在人類之中都處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡點(diǎn)，而一旦這種均衡點(diǎn)被打破，便會(huì)引起身體的多種疾病變化。而維生素與氨基酸則在人類中包括了細(xì)胞免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、激素生成、營養(yǎng)物質(zhì)新陳代謝與能源新陳代謝等許多環(huán)節(jié)構(gòu)成。所以，其測定方法對(duì)保健評(píng)估與病癥判斷均更具意義。時(shí)正媛等人采用UPLC-MS/M方法，確定了人類血清中13種氨基酸含量測定方法的新方法，將新鮮血清樣本先通過蛋白沉淀前的處理方法，提取上清液后再利用UPLC-MS/MS方法進(jìn)行分析，分析方法時(shí)間短、特殊性強(qiáng)、靈敏度高，為全譜氨基酸檢測技術(shù)創(chuàng)造了試驗(yàn)基礎(chǔ)。2.同型半胱氨酸檢測：高同形半胱氨酸（HCY）是引起心腦血管病變的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)原因之一。Mccully首先給出了高同型半胱氨酸血癥可能導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化疾病的假說。該假說認(rèn)為HCY能引起毛細(xì)血管內(nèi)皮系統(tǒng)的損傷，從而刺激了血管平滑肌細(xì)胞的生長，對(duì)低密度脂蛋白的抗氧化形成產(chǎn)生負(fù)面影響，同時(shí)提高血小板功能，從而促使血栓的生成。所以，檢測HCY對(duì)心腦血管疾病的有效防治和早期治療有著重要意義。3.類固醇激素檢查：類固醇激素是一種弱極化的小分子物質(zhì)，一般由腎上腺質(zhì)、胎盤和生殖腺組成，一般包括雄激素、雌激素、孕激素、糖皮質(zhì)激素以及鹽皮質(zhì)激素等，而類固醇激素的變化也可以作為對(duì)內(nèi)分泌病變等診斷的依據(jù)所在，均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)有關(guān)激素水平的變化，如原發(fā)性醛固酮增生癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫欣綜合征和高雄血癥等。所以，對(duì)人體類固醇激素技術(shù)水平的檢測，才能成為疾病診斷的重要基礎(chǔ)。高潔等人利用固相含量提取法技術(shù)，結(jié)合了UPLC-MS/MS，成功建立了五十二種類固醇激素的測定方法，使用電噴霧正/負(fù)分子多反應(yīng)檢測模型（MRM），靈敏度較高，基本能夠測量在pg級(jí)以下，為利用質(zhì)譜分析法技術(shù)確定類固醇激素濃度的臨床提供可信證據(jù)，打下了基礎(chǔ)。4.膽汁酸譜測定：膽汁酸是關(guān)鍵的信息分子，在調(diào)控類脂、葡萄糖刺激和人體代謝方面起著主要功能。在肝膽疾病中，由于肝臟合成、代謝和清除以及胃腸消化吸收上的障礙，會(huì)影響膽汁酸在各個(gè)部位中的含量和分配。而膽汁酸品種也很多，因?yàn)槠鋫?cè)鏈的構(gòu)造、立體化學(xué)性質(zhì)和氫氧基的數(shù)量與位置等差異，表現(xiàn)出多樣化甚至相反的生化和生理特性。非乙醇性脂肪性肝臟疾病是一類慢性的發(fā)生性肝臟疾病，涉及各種肝損傷，一般是脂類改性、非乙醇性脂性肝炎、纖維化和肝變硬。在非乙醇性脂肪性肝臟疾病中，肝功能膽汁酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化或許會(huì)變化最重要的膽汁酸類型，進(jìn)而直接影響餐后膽汁酸的依賴性信息傳遞，和調(diào)控肝炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)速度。肝細(xì)胞癌為最常見的原發(fā)性高血壓肝癌類型，占所有該類惡性腫瘤的80%～90%。研究表明，鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸等膽汁酸成分，能對(duì)肝腎中星形細(xì)胞（HSCs）內(nèi)NLRP3炎性細(xì)胞小體的活力產(chǎn)生雙向調(diào)控，進(jìn)而直接影響肝細(xì)胞癌生成。膽汁酸譜檢測適合慢性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、膽囊炎、胰腺炎、肝癌、肝膽胰外科手術(shù)患者等。

2多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（PCOS）為育齡女人中較普遍的，以月經(jīng)周期失調(diào)、排卵障礙、內(nèi)分泌和代謝紊亂并伴發(fā)多囊卵巢（PCO）為主要癥狀的臨床綜合征，于1935年由Stein和Leventhal最早報(bào)告故也簡稱為Stein—Leventhal綜合癥，據(jù)國外報(bào)告在育齡婦女中的發(fā)生率僅為5%-10%，據(jù)中國報(bào)告則為百分之五點(diǎn)六;高發(fā)年齡段約為20～35歲;目前該病的原因和發(fā)生機(jī)理尚不清楚;但與基因和環(huán)境因素有關(guān)，并包括神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分泌和免疫的復(fù)雜調(diào)節(jié)。家系分析結(jié)果顯示，雖然PCOS呈常染色體遺傳或x染色體連鎖顯性遺傳，但并不全部遵循孟德爾的遺傳規(guī)則。PCO S也是一種基因組病，目前的侯選物基因研究對(duì)象還有牛胰島素副作用有關(guān)基因組、高雄激素有關(guān)基因組和慢性炎癥因子有關(guān)基因等。同時(shí)，環(huán)境因素也參與了PCO S的形成、進(jìn)展。尤其是在宮內(nèi)高雄激素的過多環(huán)境、環(huán)境內(nèi)分泌影響物如雙酚A、持久性的有機(jī)污染如多溴聯(lián)苯（PCBs）、抗癲癇藥、營養(yǎng)過剩和不良生活方式等都可以提高PCOS發(fā)病的危險(xiǎn)性。在美國，與PCOS相關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用每年預(yù)估為11.6億美元。

PCOS臨床是一種復(fù)雜性多樣的、多系統(tǒng)的慢性內(nèi)分泌機(jī)能阻礙，如經(jīng)期反常、多毛、痤瘡以及伴隨肥大癥、高脂血癥、過多雄活性激素化等的各類癥狀，囊狀卵泡、胰島素抵抗、不孕癥和流產(chǎn)等，但大部分患者都僅明顯體現(xiàn)其中一些，臨床應(yīng)用異質(zhì)化也是目前缺乏統(tǒng)一治療規(guī)范的主要因素。對(duì)于PCOS疾病的檢查，主要通過臨床表現(xiàn)、超聲影像以及內(nèi)分泌特征來診斷。目前，PCOS最廣泛使用的三大診斷標(biāo)準(zhǔn)是鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)、NIH標(biāo)準(zhǔn)，以及AES標(biāo)準(zhǔn)。

1990年的由美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）制定的NIH指標(biāo)包括（1）高雄性素的藥物臨床治療和/或高雄激素血癥;（2）慢性無排卵;（3）排除了具有這些病變中的某些有關(guān)病變，如高泌乳素血癥和甲狀腺病變、先天性腎上腺皮質(zhì)增生等。需注意的是，在該檢查標(biāo)準(zhǔn)中，卵巢為多囊樣的結(jié)構(gòu)改變（PCO）并沒有被用作檢查的客觀準(zhǔn)則，并且該規(guī)范也沒有對(duì)規(guī)范的每一項(xiàng)內(nèi)容進(jìn)行具體闡述。

2003年，由歐洲人生殖健康和胚胎發(fā)育學(xué)會(huì)（ESHRE）與美洲生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)（ASRM）舉行的鹿特丹PCOS專項(xiàng)大會(huì)對(duì)NIH診斷規(guī)范做出了修改，并制訂了"PCOS鹿特丹診斷規(guī)范"。成為全世界最廣泛使用的規(guī)范，鹿特丹對(duì)PCOS的定義如下：（1）排卵過少或無排卵;（2）存在對(duì)較高水平雄性素的臨床治療和/或生物學(xué)危害;（3）超聲檢查到女性卵巢多囊樣的改變，女性卵巢容積≥10mL（女性卵巢容積=0.5×長×寬×厚），和/或同一條切面上口徑為2～9mm的卵泡數(shù)≥12個(gè)。在上述三條中最大的前二項(xiàng)條件得到滿足而排除了其他病變時(shí)，即可開展PCOS檢測。鹿特丹號(hào)標(biāo)準(zhǔn)在原NIH標(biāo)準(zhǔn)表型上增加了PCO這一技術(shù)指標(biāo)，是對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步延伸，并將使確診為PCOS的目標(biāo)人群比重大幅度地增加。

2006年，美國雄激素水平過多學(xué)會(huì)（AES）所制定的AES規(guī)范，對(duì)PCOS的界定如下：高雄激素血癥的先決條件，有排卵過少/無排卵，并排除其他有這些癥狀的疾病。AES標(biāo)準(zhǔn)涵蓋的患者范圍比NIH標(biāo)準(zhǔn)更廣泛，但比鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)要窄。

隨著科學(xué)研究的開展，有研究人員證實(shí)了東南亞種族和歐美人種之間在血清雄激素水平、臨床高雄性素水平表達(dá)、新陳代謝狀況等方面有著顯著的人種差別。2008年，衛(wèi)生部門開始研究建立"多囊卵巢綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)"以形成更符合于我國人群的治療規(guī)范，2011年出臺(tái)基于有關(guān)文獻(xiàn)和面向我國人的循證醫(yī)學(xué)研究成果的《PCOS確診和防治技術(shù)專家合作共識(shí)》。該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PCOS的危害原因、癥狀等作出了定義，并標(biāo)準(zhǔn)了輔助檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查方法，是由衛(wèi)生部門統(tǒng)一頒布的標(biāo)準(zhǔn)文本，廣泛應(yīng)用于我國各個(gè)醫(yī)學(xué)行業(yè)，具備了權(quán)威性、實(shí)用性和重要的臨床指導(dǎo)意義。與國外規(guī)范不同，我國多囊卵巢綜合癥檢查規(guī)范第一次明確提出"疑似PCOS"這一定義。該規(guī)范認(rèn)為，經(jīng)期稀發(fā)、閉經(jīng)及不規(guī)則子宮出血是檢查的必要要求。另外，如再符合下列二項(xiàng)中的條l項(xiàng)，也可能診斷為疑似PCOS病：（1）高于正常雄激素水平的臨床或血癥;（2）超聲波檢測結(jié)果顯示為PCO。在滿足以上的疑似PCOS確診要求以后還需要逐一排查任何可以導(dǎo)致高安特靈水平的病癥，以及導(dǎo)致排卵異常的病變方可明確診斷。

2018年，由中華醫(yī)師總會(huì)內(nèi)分泌物細(xì)胞代謝素科醫(yī)學(xué)分部制定的《多囊卵巢綜合征治療內(nèi)分泌物專業(yè)合作意見》中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科專業(yè)學(xué)分會(huì)內(nèi)分泌學(xué)組制定的《多囊卵巢綜合征國家治療指引》，均通過了2011年的有關(guān)PCOS的診斷規(guī)范。

高雄激素血癥在PCOS的病理過程中起著重要作用，被認(rèn)為是PCOS最穩(wěn)定和最重要的診斷組成部分。然而，哪種雄激素檢測來輔助診斷PCOS仍然存在一定爭議。臨床上，人們普遍地把血清中總睪酮增高程度視為高雄激素血癥的主要診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是事實(shí)上只有游離睪酮和部分與白蛋白以非特異性或最低親和度結(jié)合的總睪酮，才是真正有生物效性的總睪酮。常規(guī)檢測血清中總睪酮水平的方法并不能確定為高雄激素血癥的最靈敏指標(biāo)。理想狀況下，建議應(yīng)用于新鮮的血清睪酮（T）、雄烯二酮（AD）、硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）、或二氫睪酮（DHT）和17-羥孕酮（17-OHP）的水平來評(píng)估女性過度雄激素的起源和程度。北京市婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科根據(jù)曹正教授等人的研究，進(jìn)行了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）同時(shí)對(duì)睪酮（T）、雄烯二酮（AD）、硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）、二氫睪酮（DHT）和17-羥孕激素（17-OHP）進(jìn)行定量分析的方法。根據(jù)國際臨床與實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）指南EP28-A3C，采用非參數(shù)方法結(jié)果表明，部分PCOS患者僅出現(xiàn)非T雄激素增加，因而同時(shí)定量這四種雄激素在PCOS診斷中的潛在臨床效用很高。

患有PCOS的女性中，不僅卵巢分泌的雄激素增加，且高達(dá)50%的患者DHEAS水平也升高。在女性中，DHEAS幾乎都是由腎上腺分泌的，睪酮來自卵巢25%、腎上腺（25%）和其他雄激素的外周轉(zhuǎn)化。有研究比較了DHEAS/睪酮比率對(duì)PCOS患者代謝參數(shù)的影響，他們都指出，具有高DHEAS/睪酮比率的PCOS患者具有更有益的代謝特征，使用DHEAS/睪酮比率有利于評(píng)估PCOS患者的代謝風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)PCOS的進(jìn)一步檢查還需要排查其他有關(guān)病變，如高泌乳素血癥和副甲狀腺病變、腎上腺皮質(zhì)增生等。二十一羥化酶缺乏非典型腎上腺增生?。∟C-CAH）是一個(gè)很常見的常染色體隱性遺傳綜合征，NC-CAH的主要臨床特征為多毛癥、排卵性和月經(jīng)功能障礙，另外還有胰島素抵抗和多囊卵巢形態(tài)。僅基于臨床表現(xiàn)，很難區(qū)分NC-CAH與PCOS。在一篇回顧性比較PCOS和NC-CAH的文章中，平均41.87%的NCAH患者和25%的PCOS患者顯示血清17-OHP水平升高，這是區(qū)分這兩種綜合征推薦的篩查指標(biāo)。相比之下，T和DHEAS等常見的雄激素在NC-CAH中也有所升高，但是在區(qū)分NC-CAH和PCOS方?jīng)]有太大意義?？紤]到測量17-OHP作為排除NC-CAH的廣泛接受度，因此臨床實(shí)驗(yàn)室可以方便地將其納入用于PCOS診斷的雄激素中。

一項(xiàng)前瞻性研究表明，如果AD包含在雄激素檢測通道中，對(duì)PCOS的診斷率可增加約9%。DHT由T經(jīng)5α還原酶作用形成，與雄激素受體結(jié)合的親和力更高，使DHT在其靶細(xì)胞中更活躍。所以，DHT是PCOS病人高雄激素血癥檢測與處理中的主要靶向雄激素之一，這也表明T+DHT檢測在PCOS鑒別方面優(yōu)于任何單一雄激素。由此可見，在PCOS診斷過程中，T、AD、DHEAS和DHT的組合測定提供了更好的診斷能力，同時(shí)對(duì)17-OHP的測定還可以排除NC-CAH的影響。對(duì)雄激素的組合測定，用于評(píng)估女性過度雄激素的起源和程度，對(duì)臨床醫(yī)生進(jìn)行PCOS診斷提供有力支持。

3質(zhì)譜技術(shù)在多囊卵巢綜合征中的應(yīng)用

因?yàn)轭惞檀技に胤肿咏Y(jié)構(gòu)相似，而大多數(shù)活性激素在人體內(nèi)的濃度極微，且一般測定水平都在nmoL/L至pmoL/l數(shù)量級(jí)之間，故精密定量分析類固醇活性激素對(duì)儀器設(shè)備的敏感度和方法的精度都有很大的需求。目前，類固醇激素的檢測方式主要有化學(xué)免疫技術(shù)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方式。二十世紀(jì)以前，傳統(tǒng)化學(xué)免疫法由于操作簡便快捷，在臨床上廣泛應(yīng)用。但傳統(tǒng)的化學(xué)免疫法也具有許多弊端：一是對(duì)敏感度低下，在樣品含量很低時(shí)，就要求用很大的樣本量富集、提純;二是適用性較差，待測物的抗體易與和分子結(jié)構(gòu)相同的內(nèi)源性化合物以及代謝產(chǎn)物形成交叉反應(yīng)，從而形成假陽性結(jié)果;三是分析效能低下，一般人一次只檢測一種化學(xué)物質(zhì)，就無法同時(shí)完成幾種激素的定性與定量分析。所以，化學(xué)免疫法已逐步被生物色譜法所取代。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)敏感度較高，但通常要求苛細(xì)的衍生化過程和較長的分析時(shí)限（通?！?0min），而且目前沒有一個(gè)適合于各種類固醇激素的衍生化試劑。而LC-MS/MS則減少了傳統(tǒng)氣相色譜法中苛細(xì)的衍生化過程，而且特異性較強(qiáng)，可以很好地消除對(duì)基質(zhì)中類似結(jié)構(gòu)化合物的影響，是各種類固醇激素中目前最安全的測定方式。另外，對(duì)LC-MS/MS的敏感度也最高，可以達(dá)到臨床實(shí)驗(yàn)室中大多數(shù)類固醇激素的測試條件，并且通量高，可以一次檢測類固醇激素整條代謝通路，提供了更加豐富的診斷依據(jù)。值得注意的是，2013年美國內(nèi)分泌學(xué)會(huì)指出：對(duì)于具有高影響力的臨床研究，類固醇免疫分析時(shí)代正逐漸接近尾聲。自2015年1月1日起，投稿至臨床內(nèi)分泌與代謝雜志的性激素?cái)?shù)據(jù)必須來源于質(zhì)譜法檢測。預(yù)計(jì)基于質(zhì)譜法檢測的要求未來將擴(kuò)展到腎上腺類固醇激素和維生素D。

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