3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的合成及抗腫瘤活性研究

仝紅娟，高艷蓉，唐文強(qiáng)，劉 斌

(1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046；2.陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 陜西 西安 712046)

天然藥物是新藥的主要來源途徑之一[1]，其在人類疾病的預(yù)防、治療等方面發(fā)揮著巨大的作用。白藜蘆醇(resveratrol)，化學(xué)名3,5,4′-三羥基二苯乙烯，是一類具有二苯乙烯結(jié)構(gòu)的天然非黃酮類多酚化合物[2-3]，具有多種生物活性，如抗氧化[4]、抗癌[5]、抗炎[6]、降糖[7]等，但由于半衰期短、靶點(diǎn)多、水溶性差和生物利用度低等不足，其應(yīng)用受到了很大限制[8]。因此，開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、活性優(yōu)異的白藜蘆醇衍生物已成為新藥研究的一個重要領(lǐng)域。為了進(jìn)一步提高白藜蘆醇的生物活性、改善其理化性能，近年來,科研人員對白藜蘆醇開展了大量的結(jié)構(gòu)修飾研究，以期獲得高活性的白藜蘆醇衍生物[9-11]。例如，在2020年，Bosquesi等[12]將呋咱氮氧化物通過酯化反應(yīng)引入到白藜蘆醇的酚羥基上，構(gòu)建了一系列新型的含有呋咱氮氧基團(tuán)的白藜蘆醇衍生物，這類化合物可以通過釋放一氧化氮對鐮狀細(xì)胞類疾病有良好的治療效果。

作者以3-甲氧基芐基磷酸二乙酯(Ⅰ)為原料，經(jīng)過三溴化硼脫甲基得到中間體3-羥基芐基磷酸二乙酯(Ⅱ)，隨后在甲醇鈉的催化下與3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅲ)發(fā)生Wittig-Horner反應(yīng)得到一個白藜蘆醇衍生物3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚(Ⅳ)，通過核磁共振氫譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，優(yōu)化反應(yīng)條件，并評價(jià)3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚對腫瘤細(xì)胞MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2的抑制活性。3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的合成路線見圖1。

圖1 3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的合成路線Fig.1 Synthetic route of 3-(3,5-dimethoxystyryl)phenol

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

MCF-7細(xì)胞、PC-3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞。

3-甲氧基芐基磷酸二乙酯、3,5-二甲氧基苯甲醛、甲醇鈉、三溴化硼(BBr3)、18/6 冠醚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，北京百靈威科技有限公司；其它試劑均為市售分析純；柱層析硅膠(200～300目)，青島海洋化工廠；CCK-8試劑盒，市售。

AV400型核磁共振波譜儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))，德國Bruker公司；EUROSTAR20型攪拌機(jī)，艾卡儀器設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，西安予輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，蘇州國飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；ELx800型酶標(biāo)儀，美國博騰儀器有限公司。

1.2 合成方法

1.2.1 3-羥基芐基磷酸二乙酯(Ⅱ)的合成

在氬氣保護(hù)、無水無氧條件下，將3-甲氧基芐基磷酸二乙酯(2.58 g，10.0 mmol)溶于30 mL干燥的二氯甲烷中，將反應(yīng)液冷卻至-20 ℃，再將BBr3(2.8 mL，30.0 mmol)慢慢滴加其中，然后在-20 ℃下繼續(xù)反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中慢慢滴加甲醇(2 mL)，淬滅反應(yīng)，隨后將反應(yīng)液一次性倒入冰水中，有白色沉淀析出，過濾，濾餅真空干燥，然后用乙醇重結(jié)晶，得到白色固體化合物Ⅱ2.26 g，收率92.4%。1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：7.07～7.13(m,1H),7.01(d,J=7.6 Hz,1H),6.92(d,J=8.0 Hz,1H),6.82(s,1H),6.08(s,2H),4.15～4.21(m,4H),1.31(s,6H)。

1.2.2 3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚(Ⅳ)的合成

在氬氣保護(hù)、無水無氧條件下，將化合物Ⅱ(1.95 g，8.0 mmol)溶于20 mL干燥的DMF中，加入甲醇鈉(648 mg，12.0 mmol)和18/6 冠醚(1.06 g，4.0 mmol)，在70 ℃下反應(yīng)1.5 h后，將反應(yīng)液冷卻至室溫；再加入3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅲ)，加熱至120 ℃反應(yīng)5 h，將反應(yīng)液冷卻至室溫；加入150 mL冰水，并用2 mol·L-1稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH=3，有白色沉淀析出，過濾，濾餅真空干燥，然后用乙醇重結(jié)晶，得到白色固體化合物Ⅳ1.49 g，收率72.8%。1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：7.28(t,J=7.6 Hz,1H),7.11(d,J=7.6 Hz,1H),6.97～7.09(m,3H),6.79～6.81(m,1H),6.70(d,J=2.4 Hz,2H),6.45(t,J=2.4 Hz,1H),3.86(s,6H)。

1.3 抗腫瘤活性測試

取對數(shù)生長期的MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2細(xì)胞用胰酶消化，鋪至96孔板中，每孔細(xì)胞密度約為1×104個。將細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h，棄去培養(yǎng)液；再加入不同濃度(100、50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0，μmol·L-1)的化合物Ⅳ，繼續(xù)孵育3 d，棄去培養(yǎng)液；每孔加入CCK-8溶液(20 μL)和培養(yǎng)基(100 μL)，繼續(xù)孵育4 h，然后用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度(OD)，計(jì)算化合物Ⅳ的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的核磁共振氫譜見圖2。

圖2 3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的核磁共振氫譜Fig.2 1HNMR spectrum of 3-(3,5-dimethoxystyryl)phenol

由圖2可知，3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚含有2個甲氧基，在δ3.86處有一個單峰，對應(yīng)6個H，是3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚中兩個甲氧基的質(zhì)子信號；此外，在δ7.28～6.45范圍內(nèi)總共出現(xiàn)9個質(zhì)子信號，是3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚中兩個苯環(huán)及乙烯上9個H的信號。表明，產(chǎn)物3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚的結(jié)構(gòu)正確。

2.2 脫甲基化反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 脫甲基試劑對化合物Ⅱ收率的影響

在第一步反應(yīng)(脫甲基化)中，脫甲基試劑的種類和反應(yīng)條件(溶劑、溫度)對化合物Ⅱ的收率會有明顯影響?？疾烀摷谆噭┓N類及反應(yīng)條件(溶劑、溫度)對化合物Ⅱ收率的影響，結(jié)果見表1。

由表1可知，以BBr3為脫甲基試劑、CH2Cl2為溶劑，在-20 ℃下反應(yīng)時(shí)脫甲基的效果最佳，化合物Ⅱ收率達(dá)到了92.4%；以乙醇鈉或AlCl3為脫甲基試劑時(shí)，化合物Ⅱ收率不足30%；以HBr為脫甲基試劑時(shí)，沒有產(chǎn)物生成；以Al和I2作為脫甲基試劑雖然能夠使化合物Ⅱ收率達(dá)到88.7%，但是因?yàn)镮2是一種有毒物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)操作過程中容易引發(fā)安全事故。因此，確定最佳的脫甲基試劑為BBr3。

表1 脫甲基試劑種類及反應(yīng)條件對化合物Ⅱ收率的影響Tab.1 Effect of demethylation reagent and reaction condition on yield of compound Ⅱ

2.2.2 BBr3用量對化合物Ⅱ收率的影響

以BBr3為脫甲基試劑，考察BBr3用量即n(Ⅰ)∶n(BBr3)對化合物Ⅱ收率的影響，結(jié)果見表2。

表2 n(Ⅰ)∶n(BBr3)對化合物Ⅱ收率的影響Tab.2 Effect of n(Ⅰ)∶n(BBr3) on yield of compound Ⅱ

由表2可知，當(dāng)n(Ⅰ)∶n(BBr3)=1∶3時(shí)，化合物Ⅱ收率最高；若減少BBr3用量，反應(yīng)不充分，使得化合物Ⅱ收率降低；若增加BBr3用量，化合物Ⅱ收率沒有明顯變化。因此，確定最佳的BBr3用量為n(Ⅰ)∶n(BBr3)=1∶3。

2.3 Wittig-Horner反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 甲醇鈉用量對化合物Ⅳ收率的影響

在Wittig-Horner反應(yīng)中，甲醇鈉作為堿，其用量對化合物Ⅳ收率有影響?？疾旒状尖c用量即n(Ⅱ)∶n(甲醇鈉)對化合物Ⅳ收率的影響，結(jié)果見表3。

表3 n(Ⅱ)∶n(甲醇鈉)對化合物Ⅳ收率的影響Tab.3 Effect of n(Ⅱ)∶n(sodium methoxide) on yield of compound Ⅳ

由表3可知，當(dāng)n(Ⅱ)∶n(甲醇鈉)=1∶1.5時(shí)，化合物Ⅳ收率最高；若減少甲醇鈉用量，化合物Ⅳ收率逐漸降低，這可能是因?yàn)椋状尖c用量較少，造成反應(yīng)不充分；若增加甲醇鈉用量，并沒有顯著提高化合物Ⅳ收率?？紤]到成本，確定最佳的甲醇鈉用量為n(Ⅱ)∶n(甲醇鈉)=1∶1.5。

2.3.2 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對化合物Ⅳ收率的影響(表4)

表4 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對化合物Ⅳ收率的影響Tab.4 Effect of reaction temperature and reaction time on yield of compound Ⅳ

由表4可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為120 ℃、反應(yīng)時(shí)間為5 h時(shí)，化合物Ⅳ收率最高；改變反應(yīng)溫度或反應(yīng)時(shí)間，化合物Ⅳ收率均降低。因此，確定最佳的反應(yīng)條件為120 ℃反應(yīng)5 h。

2.4 抗腫瘤活性

采用CCK-8試劑盒測試化合物Ⅳ對MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2細(xì)胞的抑制活性，結(jié)果見表5。

表5 化合物Ⅳ的抗腫瘤活性(n=3)Tab.5 Antitumor activity of compound Ⅳ(n=3)

由表5可知，化合物Ⅳ對MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2細(xì)胞均有明顯的抑制活性，其中對HeLa細(xì)胞的抑制活性最強(qiáng)，其IC50值為(11.80±1.27) μmol·L-1。

3 結(jié)論

以3-甲氧基芐基磷酸二乙酯(Ⅰ)為原料，經(jīng)三溴化硼脫甲基得到中間體3-羥基芐基磷酸二乙酯(Ⅱ)，隨后中間體Ⅱ在甲醇鈉的催化下與3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅲ)發(fā)生Wittig-Horner反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物3-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯酚(Ⅳ)，總收率為67.2%。生物活性測試表明，化合物Ⅳ對腫瘤細(xì)胞MCF-7、PC-3、HeLa和HepG2均有明顯的抑制活性，尤其是抑制HeLa細(xì)胞的IC50值達(dá)到了(11.80±1.27) μmol·L-1，表明，化合物Ⅳ可作為抗腫瘤先導(dǎo)物進(jìn)行更深入的研究。