精液中冷凍保護劑加入比例對冷凍復蘇后精子活動力的影響研究

李洪成

精子冷凍是生殖輔助技術中的一種,也是精子庫的重要工作內容。在精子冷凍復蘇后,精子成活率直接關系冷凍精子用于輔助生殖的效果［1］。有研究表 明［2］,精子冷凍后的活動力與諸多因素有關,主要包括精子質量、冷凍方法、冷凍保護劑的使用,其中冷凍保護劑使用情況在精子冷凍中發(fā)揮重要作用。目前常用的精子冷凍保護劑為蛋黃甘油復合型冷凍保護劑,在使用該過程中冷凍保護劑與精液的配比對精子冷凍保護效果有一定的影響［3］。為了探討冷凍保護劑與精液配比對精子冷凍復蘇后的活動力影響,本文選擇1∶1、1∶3 配比冷凍的精子進行觀察,分析復蘇后前向運動精子百分比及精子活力情況,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本收集 選擇2019 年3 月～2020 年6 月遼寧省婦幼保健院人類精子庫精子捐獻志愿者20 例,取得志愿者知情同意后進行實驗,均禁欲7 d 后,手淫法留取精液4 ml 置于無菌取精杯中,在37℃水浴箱中液化處理。根據《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊(第5 版)》的相關要求［4］,對精液進行處理。所有留取精液液化時間均≤1 h,精子濃度≥50× 106/ml,精子活力≥50%。

1.2 方法

1.2.1 冷凍保護劑配置 采用蛋黃甘油復合型冷凍劑作為冷凍保護劑,制備過程如下：向37.4 ml 葡萄糖溶液(5%)中加入58.6 ml 的枸櫞酸鈉溶液(2.9%),在向混合溶液中加入56 ml 甘油,充分混勻后,采用微孔過濾器過濾,孔徑選擇0.45 μm。過濾后的溶液中加入 48 ml 的新鮮蛋黃,調節(jié)pH 值至6.8～7.2。然后加入 0.5 ml 慶大霉素(8 IU)進行細菌培養(yǎng)試驗,將完成配置的冷凍保護劑在超凈工作臺上進行分裝,每份10 ml,置于-80℃凍存,冷凍保護劑需3 個月內使用。

1.2.2 實驗分組 取20 例志愿者精液,按照1∶3 分為甲組(1 ml)、乙組(3 ml)。取制備的蛋黃甘油復合型冷凍保護劑,按照1∶1、1∶3 的保護劑/精漿配比,分別向甲組、乙組中各加入1 ml 冷凍保護劑,完成實驗分組。

1.2.3 冷凍與復蘇方法 完成兩組樣本制備后轉入凍存管中,置于4℃冰箱平衡10 min,然后經10 min 的液氮薰蒸,最后在液氮中凍存。待48 h 后,取出凍存精液,放在37℃的恒溫水浴箱中進行精子冷凍后復蘇。

1.2.4 精子活動力檢查 精子活動力分別以精子前向運動百分比、活力檢測并評價,按照《手冊》標準和 要求,采用北京偉力彩色計算機輔助精液分析系統進行復蘇后精液的處理分析,測定冷凍前及復蘇后前向運動與精子活力。前向運動(PR)是精子主動呈現的直線或大圓周運動,非前向運動(NP)表示所有他非前向的精子運動,比如小圓周泳動及尾部擺動等。精子活力即精子總的活動率,以NP+PR 表示。

1.3 觀察指標 對比兩組冷凍前、冷凍復蘇后前向運動精子百分比及精子活力。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數 ± 標準差()表示,采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組冷凍前、冷凍復蘇后前向運動精子百分比對比 冷凍前,兩組前向運動精子百分比對比差異無統計學意義(P＞0.05)；冷凍復蘇后,兩組前向運動精子百分比均較冷凍前明顯下降,但乙組高于甲組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組冷凍前、冷凍復蘇后前向運動精子百分比對比(,%)

表1 兩組冷凍前、冷凍復蘇后前向運動精子百分比對比(,%)

注：與本組冷凍前對比,aP＜0.05；與甲組冷凍復蘇后對比,bP＜0.05

2.2 兩組冷凍前、冷凍復蘇后精子活力對比 冷凍前,兩組精子活力對比差異無統計學意義(P＞0.05)；冷凍復蘇后,兩組精子活力均較本組冷凍前明顯下降,但乙組高于甲組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組冷凍前、冷凍復蘇后精子活力對比(,%)

表2 兩組冷凍前、冷凍復蘇后精子活力對比(,%)

注：與本組冷凍前對比,aP＜0.05；與甲組冷凍復蘇后對比,bP＜0.05

3 討論

精子庫冷凍精子是用于人類輔助生殖的重要技術,精子冷凍后復蘇成活率直接關系著輔助生殖的效果［5］。在冷凍處理過程中,細胞外液會形成冰晶,使細胞外水分逐漸減少,增加了細胞外液的濃度,形成滲透壓差,從而使細胞內水分流向細胞外,細胞脫水皺縮,從而形成凍存效果［6］。但精子冷凍過程還會產生活性氧,對精子細胞膜產生一定的破壞作用,使細胞內也產生冰晶,導致細胞內外滲透壓差不明顯,影響凍存效果。而細胞內冰晶的產生,還會影響精子的運動能力,且對精子的脫氧核糖核酸、線粒體功能等也會帶來損傷,致使精子活動力降低,甚至導致精子死亡［7］。同時,正常的精漿中含有抗氧化物質,能夠清除活性氧。凍存時,細胞表面的超氧化物自由基、羥基會明顯增多,對精子保存不利。精子質膜脂質的過氧化在凍存時加劇,導致復蘇后精子功能受損,精子活動力下降［8］。研究表明［9］,在精子凍融過程中,精子的頭部漿膜會發(fā)生破損、腫脹情況,增加精子膜結構的不完整率,頂體膜及內容物脫落、丟失,精子活性降低。通過提升精子的能量代謝,有助于使精子復蘇率和精子活力提升,保證精子細胞膜的完整性和通透性,防止凍存帶來的損傷。

基于此,很多學者一直在尋找冷凍保護的有效措施,目前除了選擇恰當的冷凍方法,冷凍過程使用冷凍保護劑顯得尤為重要。冷凍保護劑的使用,使冷凍保護劑能夠通過融入精液中形成保護環(huán)境,減少冷凍造成的氧化損傷。并且,保護劑的加入能夠降低細胞外液的電解質濃度,還有助于減輕對精子細胞產生的不利影響。所以,需要在精液凍存時加入冷凍保護劑,形成對精子細胞的保護。但實際上冷凍保護劑的加入比例會影響凍存保護效果,不同的保護劑/精漿配比產生的保護效果不同,并不是冷凍保護劑使用的越多越好［10］。精漿本身對精子的保護效果就很好,如果過多的加入冷凍保護劑,可能會破壞精漿的保護作用,起到反效果。因此,恰當的保護劑/精漿配比在精液凍存中具有重要價值,對提升冷凍復蘇后精子活動力具有一定的作用。目前常采用的保護劑/精漿配比為1∶1,但經過實際工作經驗總結發(fā)現,不同配比會影響精子復蘇后的活動力,并且冷凍保護劑的制備和消耗會增加精子凍存成本?；诖?結合經驗認為1∶3 的保護劑/ 精漿配比也許不僅能夠達到理想的凍存保護作用,還能夠降低凍存保護劑使用量,節(jié)約成本。

為了進一步驗證1∶1、1∶3 保護劑/精漿配比冷凍保護劑使用對冷凍復蘇后精子活動力的影響,本次研究通過取志愿者精液進行處理,按照保護劑/精漿配比1∶1 和1∶3 分為甲組和乙組,并進行凍存-復蘇實驗,利用實驗前后兩組的精子活動力變化分析精液中加入冷凍保護劑比例帶來的影響。研究結果顯示,冷凍復蘇后,兩組前向運動精子百分比均較冷凍前明顯下降,但乙組前向運動精子百分比(42.36±4.63)%高于甲組的(33.48±4.56)%,差異具有統計學意義(P＜0.05)。冷凍復蘇后,兩組精子活力均較本組冷凍前明顯下降,但乙組精子活力(55.64±3.12)%高于甲組的(52.14±3.08)%,差異具有統計學意義(P＜0.05)。證實冷凍保存雖然能夠減緩精子失效速度,但仍然會降低冷凍復蘇后精子活動力。而乙組冷凍復蘇后的前向運動精子百分比、精子活力均明顯高于甲組,則說明1∶3 的精液中冷凍保護劑加入比例,能夠更好的發(fā)揮保護作用,減緩冰凍帶來的損傷,改善凍存復蘇后精子活動力。

綜上所述,不同精液中冷凍保護劑加入比例可對冷凍復蘇后精子活動力產生影響,相比于保護劑/精漿配比1∶1,配比1∶3 復蘇后精子活動力保護的更好,下降幅度更小,減少了冷凍帶來的精子活動力損傷。