微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草生長的影響

撖冬榮，姚拓*，李海云，黃書超，楊琰珊，高亞敏，李昌寧，張銀翠

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

我國是化肥使用大國，施用化肥是保障植物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要措施［1］，但不合理施用化肥并不能帶來持續(xù)增產(chǎn)，相反會造成資源浪費(fèi)，生態(tài)環(huán)境破壞、土壤質(zhì)量降低等一系列問題［2］。近年來，針對此類問題，國家制定了《到2020 年化肥使用量零增長行動方案》以及2019 年中央一號文件中強(qiáng)調(diào)的“加大農(nóng)業(yè)方面源污染治理力度［3］，開展農(nóng)業(yè)節(jié)肥節(jié)藥行動，實(shí)現(xiàn)化肥農(nóng)藥使用量負(fù)增長［4］”等相關(guān)政策。因此，利用有益微生物制作的菌劑來減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的化肥施用量［5］，是實(shí)現(xiàn)化肥減量的重要措施，由此對微生物肥料的研究與應(yīng)用逐漸成為社會關(guān)注的熱點(diǎn)［6］。

多年生黑麥草（Lolium perenne）屬于禾本科黑麥草屬，是營養(yǎng)價值較高的牧草之一，同時被廣泛用于我國北方城市綠地及運(yùn)動場草坪草建植［7］，其分蘗能力和適應(yīng)性強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)：在12 種多年生牧草品種引種適應(yīng)性比較中，多年生黑麥草適應(yīng)性較好，同等條件下其適應(yīng)性高于白三葉（Trifolium repens）、紅三葉（Trifolium pratense）及紫花苜蓿（Medicago sativa）［8］；目前，為提高多年生黑麥草產(chǎn)量及營養(yǎng)品質(zhì)等，研究學(xué)者在種植方式，品種及施肥方面研究較多，但從改良土壤質(zhì)量、提高肥料利用率，進(jìn)而達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的研究較少。為此，微生物肥料因具有促進(jìn)牧草對養(yǎng)分的吸收、提高土壤肥力和改良土壤質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)成為實(shí)現(xiàn)化肥減量、保護(hù)生態(tài)環(huán)境的重要途徑。但是，大量研究表明，微生物肥料不能完全取代化肥，需合理搭配化肥施用。

鑒于此，本研究以多年生黑麥草為研究對象，設(shè)置化肥減量配施不同劑量微生物肥料，測定多年生黑麥草農(nóng)藝性狀、根系形態(tài)、營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化酶活性，篩選微生物肥料與化學(xué)肥料最佳配比，以期為多年生黑麥草制定最優(yōu)施肥方案、研發(fā)多年生黑麥草專用微生物肥料，在維持多年生黑麥草正常生長和發(fā)揮生態(tài)功能的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)降低化肥施用量，減少環(huán)境污染和石化能源的消耗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 P2：普羅威登斯菌（Providencia rettgeri）；P4：克什米爾小陌生菌（Advenella kashmirensis）；P19：醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）；P35：腐敗沙雷菌（Serratia plymuthica）。供試菌株由本課題組提供，具體菌株促生特性信息見表1［9］。

表1 植物根際促生菌菌株的促生長特性Table 1 Growth promoting characteristics of plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）strains

1.1.2 供試牧草 多年生黑麥草種子購自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子市場。

1.1.3 微生物肥料 1）菌懸液制作：將菌株P(guān)2、P4、P19、P35 分別單接種于無菌LB（luria-bertani）液體培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)2～3 d（180 r·min-1，28 ℃），各菌液含菌量達(dá)108cfu·mL-1時，將菌液等比例混合，備用［10］。2）微生物肥料制作：將木炭、草炭和粉碎的玉米（Zea mays）秸稈3 種載體等比例混合，間接性滅菌（121 ℃，26 min）兩次，將滅菌完的載體放入超凈工作臺降至室溫后取1 kg 裝入聚乙烯袋中，加適量無菌水再加混合菌液80 mL，封口并用無菌針扎小孔，以便透氣，并置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d。

1.1.4 化學(xué)肥料 產(chǎn)自湖北新洋豐肥業(yè)股份有限公司，養(yǎng)分含量≥45%（N∶P2O5∶K2O=14∶16∶15）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年7 月在智能生長室進(jìn)行，模擬室外生長條件，白天：光照16 h，濕度45%，溫度23 ℃；夜晚：黑暗8 h，濕度45%，溫度19 ℃。準(zhǔn)確稱取1.2 kg土壤于花盆中，花盆規(guī)格（上口直徑15 cm，底面直徑12 cm，高13.5 cm）。選取20 粒大小一致且顆粒飽滿的多年生黑麥草種子進(jìn)行消毒，將種子與微生物肥料和化肥拌種，均勻種植于花盆中，種子出苗后，定量澆水，每盆留15 株長勢均一健康的多年生黑麥草。試驗(yàn)共設(shè)11 個處理，每個處理4 次重復(fù)，具體設(shè)置見表2。

表2 試驗(yàn)處理詳情Table 2 Test treatment details

1.3 測定方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀測定 每個花盆隨機(jī)選取10 株進(jìn)行農(nóng)藝性狀測定：采用直尺法［11］測定株高（自然高度）；采用游標(biāo)卡尺法［11］測定莖粗（相同位置）；采用烘干法［11］測定生物量。

1.3.2 根系形態(tài) 采用LA2400 scanner（Epson Expression 1000 XL，北京）型根系掃描儀測定根系形態(tài)相關(guān)指標(biāo)［12］。

1.3.3 營養(yǎng)品質(zhì)測定 采用凱氏定氮法［13］測定粗蛋白（crude protein，CP）含量；采用粗脂肪測定儀（SZC-D，杭州）［14］測定粗脂肪（ether extract，EE）含量；采用Van Soets 法［15］測定酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）和中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量。計(jì)算公式：ADF（NDF）（%）=（m2-m1）/m×100%［15］（m為試樣質(zhì)量，m1為濾網(wǎng)袋質(zhì)量，m2為ADF 或NDF 和濾網(wǎng)袋質(zhì)量）。

1.3.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量測定 采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxydase，POD）活性［16］，POD（U·g-1FW）=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）［16］，ΔA470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，W為樣品鮮重（g），t為反應(yīng)時間（min），Vt為提取酶液總體積（mL），Vs為測定時取用酶液體積（mL）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法測定［16］，SOD（U·g-1FW）＝［（Ack-AE）×V］/（1/2Ack×W×Vt）［16］，Ack為對照管的吸光度，AE為樣品管的吸光度，V為樣品液總體積（mL），Vt為測定時的酶液用量（mL），W為樣品鮮重（g）?？箟难徇^氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）活性采用過氧化氫比色法測定［16］，APX（U·g-1FW）=ΔA290×VT/（0.01Vs×t×W）［16］，ΔA290為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，VT為提取液總體積（mL），Vs為酶液的體積（mL），W為葉片的鮮重（g），t為反應(yīng)時間（min）。丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量采 用 硫 代 巴 比 妥 酸 法 測 定［16］，C（μmol·L-1）=6.45（A532-A600）-0.56A450［16］，MDA（μmol·g-1FW）=C×V/W［16］，V為提取液體積（mL），W為樣品鮮重（g）。C 為MDA 濃度，A532、A600、A450分別代表532、600、450 nm 處的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan 新復(fù)極差法差異顯著性檢驗(yàn)和主成分分析，用Excel 2010 制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草農(nóng)藝性狀的影響

B2株高最高（表3），較CK 提高12.35%。B3莖粗提高最大，較CK 提高29.41%，其次為C5和B2，分別較CK 提高8.40%和5.88%。B3、B4和C4處理下，地上生物量較CK 分別提高16.84%、6.86%和11.04%；80%CF 配施120 kg·hm-2MF，地下生物量較CK 增加最多。

表3 多年生黑麥草農(nóng)藝性狀特征變化Table 3 Changes in agronomic characteristics of perennial ryegrass

2.2 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草根系形態(tài)的影響

B3處理下，總根長、總根表面積、總根體積和根尖數(shù)增加最多（表4），分別較CK 提高21.15%、14.59%、166.67%和47.35%；B2處理分枝數(shù)最多，較CK 提高60.40%；B1處理交叉數(shù)最多，較CK 提高85.10%。

表4 多年生黑麥草根系形態(tài)特征變化Table 4 Changes in root morphological characteristics of perennial ryegrass

2.3 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草營養(yǎng)品質(zhì)的影響

化肥減量配施微生物肥料，粗蛋白含量顯著升高（表5），其中較CK 提高10%以上的為處理B4、B5、C4，分別提高14.71%、20.92%和10.01%，差異顯著（P＜0.05）。B3處理下，粗脂肪含量提高最多（P＜0.05），較CK 提高37.98%。80%CF 配施60，120 和150 kg·hm-2MF，ADF 含量較CK 增加，其余各處理ADF 含量均低于對照，60%CF 配施150 kg·hm-2MF，ADF 含量最低，較CK 降低16.11%；各處理水平下NDF 含量較CK 均降低，C2處理NDF 含量最小，較CK 降低28.03%。

表5 多年生黑麥草營養(yǎng)品質(zhì)變化規(guī)律Table 5 Changes in nutritional quality of perennial ryegrass

2.4 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

APX 活性在不同處理間差異不顯著（P＞0.05），其活性為0.019～0.035 U·g-1FW（圖1）。B1處理MDA 含量最低，較CK 降低19.29%，其次為B2處理，較CK 降低15.22%。80%CF 配施不同劑量微生物肥料，POD 活性隨微生物肥料增加，呈下降趨勢，差異顯著（P＜0.05），C2處理下降最多，較CK 下降43.41%。B3處理SOD 活性下降最多，較CK 下降10.66%，差異顯著（P＜0.05）。

圖1 多年生黑麥草抗氧化酶活性和丙二醛含量變化特征Fig.1 The change characteristics of antioxidant enzyme activity and malonaldehyde content of perennial ryegrass

3 討論

3.1 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草農(nóng)藝性狀的影響

株高、莖粗、生物量是衡量牧草生長發(fā)育狀況的重要指標(biāo)，可作為描述牧草生長狀況及產(chǎn)量的直觀表象［16］。研究結(jié)果表明，當(dāng)化肥減量20%（240 kg·hm-2）配施90 kg·hm-2微生物肥料，多年生黑麥草株高最高，較CK 增長12.35%；當(dāng)化肥減量20%（240 kg·hm-2）配施120 kg·hm-2微生物肥料，多年生黑麥草莖粗、地上生物量和地下生物量均最高，較CK 分別提高29.41%、16.84%和45.54%，郭艷娥等［17］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌增加了黑麥草的生物量和養(yǎng)分含量，本研究結(jié)果與此一致；研究還發(fā)現(xiàn)化肥減量20%配施5 種劑量微生物肥料，株高、莖粗、地上生物量和地下生物量均隨微生物肥料劑量增大呈先上升后下降的趨勢。紀(jì)開萍等［18］在小?？Х龋–offea arabica）苗接種暗褐網(wǎng)柄牛肝菌純培養(yǎng)菌種后，小?？Х让纾洌┑母o、主根及側(cè)根被茶褐色的菌索和菌膜包裹，因此出現(xiàn)該變化規(guī)律的原因可能是大劑量微生物肥料會在植物根系形成一層菌膜，抑制根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響植株生長發(fā)育。

3.2 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草根系形態(tài)的影響

根系是土壤養(yǎng)分的利用者和產(chǎn)量的貢獻(xiàn)者［19］，對植株起固定作用，同時根系是作物吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的主要通道，以供植物體正常生長發(fā)育［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化肥減量20%（240 kg·hm-2），多年生黑麥草總根長、總根表面積和總根體積普遍高于化肥減量40%（180 kg·hm-2）。其中，B2處理下，總根長、總根表面積和總根體積分別較CK（全量化肥）提高21.15%、14.59%、166.67%。陳香碧等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在干濕交替的稻田土壤中，化肥減量使水稻（Oryza sativa）根長密度、根重密度、根表面積、根活性吸收面積和根系氧化能力比全化肥處理大幅度增加（約40%），有利于水稻良好根系形態(tài)的形成，本研究結(jié)果與此一致。

3.3 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草營養(yǎng)品質(zhì)的影響

粗蛋白、粗脂肪、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維是牧草重要的營養(yǎng)指標(biāo)。Yanni 等［22］從水稻根際分離出聯(lián)合固氮細(xì)菌（nitrogen fixing bacteria）并接種于水稻，發(fā)現(xiàn)水稻CP 含量顯著增加，同時籽粒重量、籽粒粗蛋白含量和水稻收獲指數(shù)也增加。馬軍妮等［23］研究發(fā)現(xiàn)施加微生物肥料可顯著促進(jìn)玉米籽粒灌漿速度，在灌漿期，菌劑處理玉米百粒鮮重、百粒干重及單穗籽粒重較對照分別增加32.3%、83.9%及99.1%，籽粒含水量降低36.9%。本研究結(jié)果表明，微生物肥料對多年生黑麥草營養(yǎng)品質(zhì)的積累具有促進(jìn)作用，化肥減量20%配施5 種不同劑量微生物肥料，CP 含量隨微生物肥料劑量的增加呈逐漸上升趨勢，EE 含量在B3處理達(dá)最大值，化肥減量40%，ADF 和NDF 含量最低，該變化趨勢與牧草農(nóng)藝性狀變化趨勢不一致。一方面是因?yàn)椋涸撛囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)，化肥減量20%配施90 和120 kg·hm-2微生物肥料，牧草生育期會提前7 d 左右，出現(xiàn)此變化規(guī)律是由于牧草營養(yǎng)品質(zhì)會隨生育期而變化，李菲菲等［24］研究發(fā)現(xiàn)，牧草營養(yǎng)品質(zhì)隨牧草生育期呈先上升后降低趨勢，本研究中出現(xiàn)農(nóng)藝性狀與營養(yǎng)品質(zhì)變化不一致現(xiàn)象與該研究結(jié)果一致，此發(fā)現(xiàn)在后續(xù)試驗(yàn)中需進(jìn)行深入研究，以探索微生物肥料對牧草生育期的影響，篩選牧草最佳收獲期。另一方面：微生物肥料中所含的根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在土壤及植物根際的定殖情況及存活率受時間、氣候、土壤微環(huán)境等多種因素影響，因此隨時間變化，微生物存活率逐漸降低，以致微生物肥料肥效降低或失效。

3.4 微生物肥料與化肥減量配施對多年生黑麥草抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶活性在植物應(yīng)答逆境脅迫過程中具有重要作用［25］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化肥減量20%，牧草葉片中MDA 含量先下降后上升；化肥減量20%和40%，POD 活性均低于對照，可能大劑量化肥對牧草有脅迫作用，打破了植物體內(nèi)活性氧平衡［26］，POD 活性增大以消除脅迫；各處理水平下，SOD 活性變化規(guī)律性不強(qiáng)，APX 活性總體差異不顯著，原因可能是牧草的生長需要由多個生理過程協(xié)作完成，單一指標(biāo)的高低只能反映某一方面，無法準(zhǔn)確地反映其真實(shí)抗性強(qiáng)弱［27］。因此，需要綜合牧草多項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行評價，客觀全面地描述其真實(shí)抗性能力。

4 結(jié)論

1）全量化肥（300 kg·hm-2）和80%化肥（240 kg·hm-2）配施大劑量微生物肥料（＞150 kg·hm-2）對多年生黑麥草有脅迫作用。2）通過綜合評價結(jié)果表明，80%化肥（240 kg·hm-2）配施90～120 kg·hm-2微生物肥料，對促進(jìn)多年生黑麥草生長和營養(yǎng)品質(zhì)的積累效果顯著，是最佳肥料量配比。