基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較研究甜高粱幼苗響應(yīng)干旱和鹽脅迫的生理特征

王志恒，魏玉清，趙延蓉，王悅娟

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

干旱和鹽脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的兩大非生物逆境，也是我國(guó)西北干旱和半干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一［1］。植物對(duì)鹽分和干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，植物會(huì)從生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、活性氧代謝、滲透調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因的表達(dá)調(diào)控、次生代謝產(chǎn)物、膜運(yùn)輸和能量代謝等多個(gè)層次對(duì)脅迫做出響應(yīng)［2-5］。以往植物耐鹽性和抗旱性的研究主要在生態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平上進(jìn)行。近年來(lái)大量與干旱和鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因和代謝途徑已被發(fā)現(xiàn)，這些脅迫響應(yīng)基因涉及光合作用（1，5-二磷酸核酮糖、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸磷酸雙激酶）、水分運(yùn)輸（水通道蛋白）、離子轉(zhuǎn)運(yùn)（質(zhì)膜H+-ATP 酶）、細(xì)胞膜完整性（脯氨酸、甜菜堿、甘露醇）、植物激素（脫落酸、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素）、清除自由基（超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶）以及其他蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶）等，以不同的方式幫助植物抵御干旱和鹽脅迫［6-8］。滲透調(diào)節(jié)和細(xì)胞壁相關(guān)基因的表達(dá)是玉米（Zea mays）幼苗耐旱性較強(qiáng)的主要原因［9］，玉米幼苗通過(guò)上調(diào)表達(dá)清除活性氧的過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽基轉(zhuǎn)移酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶基因增強(qiáng)了其耐鹽性［10］；高粱（Sorghum bicolor）的類黃酮生物合成代謝途徑可能是其耐鹽性強(qiáng)弱的重要原因之一［11-12］，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳代謝、苯丙素的生物合成在甜高粱（Sorghum dochna）幼苗抵御干旱脅迫中起到主要作用［13］；鹽脅迫下，甜高粱幼苗根系通過(guò)編碼質(zhì)膜ATPase 和液泡膜質(zhì)子泵相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)多余Na+的排出，并且清除活性氧的水通道蛋白和抗氧化劑基因也參與了鹽脅迫下甜高粱幼苗根系的拒鹽分子機(jī)制［14］；可見通過(guò)研究植物對(duì)不同非生物脅迫的耐受性是挖掘植物抗逆相關(guān)基因的常用策略。

甜高粱屬C4高光效植物，是普通粒用高粱的一個(gè)變種，具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、生物產(chǎn)量高等特點(diǎn)，作為飼料青貯后質(zhì)地細(xì)軟，適口性極好，有較高的飼用價(jià)值，在我國(guó)西北地區(qū)種植前景廣闊［15-16］。目前對(duì)甜高粱的抗逆分子機(jī)制主要集中在抗旱或耐鹽基因挖掘方面，對(duì)于比較分析甜高粱在干旱和鹽脅迫下的生理變化和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析方面研究較少。本研究以‘遼甜1 號(hào)’甜高粱為材料，通過(guò)測(cè)定中度干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗光合氣體交換參數(shù)、有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、內(nèi)源激素含量和抗氧化物酶活性變化，并采用RNA-seq 方法分析不同脅迫下的差異基因，比較其生物學(xué)功能及所參與的代謝途徑，期望在生理生化和分子水平上揭示甜高粱適應(yīng)干旱和鹽脅迫的共同機(jī)制和不同機(jī)制，以期為甜高粱抗逆栽培和育種奠定研究基礎(chǔ)，這對(duì)于發(fā)展甜高粱作為草食家畜的優(yōu)質(zhì)飼草具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供‘遼甜1 號(hào)’甜高粱。

1.2 試驗(yàn)處理

本試驗(yàn)于2019 年7-9 月在北方民族大學(xué)植物逆境生理生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用盆栽試驗(yàn)方法，將種子用體積分?jǐn)?shù)為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，用無(wú)菌水沖洗7～8 次，直至干凈無(wú)味，將種子移至裝有等量石英砂（直徑約為0.3 cm 左右）的塑料花盆中，每盆15 粒種子，后置于光照周期為光照12 h（25 ℃）/黑暗12 h（20 ℃）的室內(nèi)智能人工氣候箱（上海博訊，BIC800）內(nèi)進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每周更換1 次Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。待苗四周齡時(shí)，每盆定苗8 株，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了10%的PEG-6000 和0.9%的NaCl 分別為甜高粱幼苗中度干旱和鹽脅迫濃度，在本試驗(yàn)中共設(shè)置了3 個(gè)處理，分別為：1）對(duì)照（CK），正常施加Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液；2）干旱脅迫（drought，D），采用10%的PEG-6000 進(jìn)行模擬中度干旱脅迫，將其與Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液混合后施加；3）鹽脅迫（salt，S），采用0.9%的NaCl 進(jìn)行模擬中度鹽脅迫，將其與Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液混合后施加。在處理后的第2 天和第7 天，將甜高粱幼苗葉片包入錫箔紙，做好編號(hào)后用液氮速凍，貯存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于內(nèi)源激素含量、有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化物酶活性測(cè)定。

1.3 光合氣體交換參數(shù)

在試驗(yàn)處理第2 天和第7 天的9：00-11：00，選擇甜高粱幼苗受光方向一致、大小相同的最上面完全展開葉，采用美國(guó)LI-COR 公司LI-6400XT 便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，Tr）測(cè)定，設(shè)定溫度為25 ℃，F(xiàn)low 值為500 μmol·s-1，CO2為400 μmol·mol-1，光強(qiáng)為1000 μmol·mol-2·s-1，具體參考郝正剛［16］的方法，重復(fù)3 次。

1.4 內(nèi)源激素含量的測(cè)定

脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長(zhǎng)素（auxin，IAA）、細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）含量通過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒進(jìn)行測(cè)定［17］，重復(fù)3 次。

1.5 有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定

使用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒對(duì)可溶性糖和脯氨酸（proline，Pro）含量進(jìn)行測(cè)定，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定可溶性蛋白含量，重復(fù)3 次。

1.6 抗氧化物酶活性的測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用紫外吸收比色法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性；參考孫云［18］的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性；每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

在甜高粱幼苗處理第2 天和第7 天時(shí)，將新鮮葉片組織置入液氮中，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用TRIzol（Invitrogen）法提取樣本中的總RNA，通過(guò)質(zhì)量檢測(cè)進(jìn)入Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，使用Illumina Truseq TM RNA sample prep Kit 方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，將質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)，即過(guò)濾后數(shù)據(jù)（clean data，reads），與參考基因組（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=sorghum）比對(duì)，獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝、表達(dá)量計(jì)算等的數(shù)據(jù)，同時(shí)對(duì)RNA-seq 的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司自主研發(fā)的云平臺(tái)進(jìn)行分析。

1.8 差異基因的篩選

將樣品處理兩兩比較得到差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），使用DEG-Seq 軟件進(jìn)行計(jì)算，使用FDR（false discover rate）作為篩選差異變量的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系矯正最后的P值，利用RSEM 得到的基因reads 數(shù)目數(shù)據(jù)開展差異表達(dá)計(jì)算DEGs，基因發(fā)生顯著差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：表達(dá)倍數(shù)≥2、P-value＜0.05。

1.9 差異基因GO 和KEGG 富集分析

使用軟件Goatools 進(jìn)行GO 富集分析，使用方法為Fisher 精確檢驗(yàn)，當(dāng)經(jīng)過(guò)校正的P值≤0.05 時(shí)，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集情況。使用KOBAS（https://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）進(jìn)行KEGG 富集分析，計(jì)算原理同GO 富集分析，使用Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，經(jīng)過(guò)校正的P值以0.05 為閾值，滿足此條件的KEGG 通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的KEGG 通路。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證

隨機(jī)挑選10 個(gè)差異基因，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成引物設(shè)計(jì)（表1）及合成，內(nèi)參基因β-Actin，引物序列為：β-Actin-F AGATGGTGTCAGCCACACTG，β-Actin-R CGAGCTTCTCCTTCATGTCC，擴(kuò)增體系：95 ℃3 min；95 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃40 s，35 個(gè)循環(huán)。

表1 差異基因引物序列Table 1 Differential gene primer sequences

1.11 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Office Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)的變化

干旱和鹽脅迫下，甜高粱幼苗葉片Pn顯著下降，Gs和Tr也均低于CK，而Ci高于CK；Pn和Tr在CK 和干旱脅迫下隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)，在鹽脅迫下呈逐漸降低趨勢(shì)；CK 處理的Gs隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，干旱和鹽脅迫下呈逐漸降低趨勢(shì)；不同處理下的Ci隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，其中鹽脅迫下降低幅度最大（圖1）。

圖1 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)的變化Fig.1 Changes in leaf photosynthetic parameters of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

2.2 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片內(nèi)源激素含量的變化

干旱和鹽脅迫下，甜高粱幼苗葉片ABA 含量均高于CK，其中鹽脅迫下最高，IAA 和CTK 含量均低于CK，其中鹽脅迫下均最低。ABA 含量在CK 和鹽脅迫下隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，干旱脅迫下呈升高趨勢(shì)；IAA 含量在CK 處理下隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，在干旱和鹽脅迫下呈升高趨勢(shì)；CTK 含量在CK 處理下隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，在干旱和鹽脅迫下呈降低趨勢(shì)（圖2）。

圖2 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片內(nèi)源激素含量的變化Fig.2 Changes in leaf endogenous hormone content of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

2.3 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片主要有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro 含量均高于CK，并隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)，其中干旱脅迫下可溶性糖含量顯著高于CK 和鹽脅迫，而可溶性蛋白和Pro 含量低于鹽脅迫，說(shuō)明甜高粱幼苗在干旱脅迫下可溶性糖是其主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而鹽脅迫下可溶性蛋白和Pro 起主要滲透調(diào)節(jié)作用（圖3）。

圖3 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片主要有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化Fig.3 Changes in leaf osmotic adjustment substance content in sweet sorghum seedling under drought and salt stress

2.4 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片抗氧化物酶活性的變化

干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片的SOD、POD、CAT 和APX 活性均高于CK，并隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)，其中干旱脅迫下升高幅度低于鹽脅迫，說(shuō)明甜高粱幼苗在鹽脅迫下活性氧產(chǎn)物多于干旱脅迫，因而抗氧化物酶活性較高，能夠清除多余的活性氧產(chǎn)物，從而減輕對(duì)甜高粱幼苗的傷害（圖4）。

圖4 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片抗氧化物酶活性的變化Fig.4 Changes in leaf antioxidant enzyme activity of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估

為了研究干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗基因表達(dá)情況的變化，分別對(duì)CK、D、S 處理2 和7 d 時(shí)甜高粱幼苗葉片進(jìn)行RNA-seq，RNA-seq 共建立18 個(gè)cDNA 文庫(kù)，每個(gè)測(cè)序文庫(kù)的原始測(cè)序數(shù)據(jù)見表2。18 個(gè)樣品RNA-seq 過(guò)濾后數(shù)據(jù)為48330116～60983370，Q20值均超過(guò)98.29%，Q30值均超過(guò)94.98%，GC 含量為54.97%～57.72%，錯(cuò)誤率不超過(guò)0.0226%，分別將各樣品的clean reads 與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)率為95.88%～96.78%，測(cè)得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高，數(shù)據(jù)質(zhì)量好，利于后期數(shù)據(jù)的分析。

表2 樣品測(cè)序和數(shù)據(jù)比對(duì)統(tǒng)計(jì)Table 2 Sample sequencing and data comparison statistics

2.6 差異基因篩選

干旱脅迫響應(yīng)基因相關(guān)分析顯示（圖5），甜高粱幼苗在干旱脅迫2 d 時(shí)共有1897 個(gè)差異基因，包括922 個(gè)上調(diào)基因和975 個(gè)下調(diào)基因，干旱脅迫7 d 時(shí)共有211 個(gè)差異基因，其中包括157 個(gè)上調(diào)基因和54 個(gè)下調(diào)基因，CK 處理7 d 相比于2 d 產(chǎn)生861 個(gè)上調(diào)基因和556 個(gè)下調(diào)基因，在CK2_vs_D2 和CK7_vs_D7 兩組兩兩比較的重疊差異基因CK2_vs_CK7 相比有40 個(gè)差異表達(dá)基因，稱其為干旱脅迫響應(yīng)基因。甜高粱幼苗在鹽脅迫2 d 時(shí)共有3761個(gè)差異基因，包括2047 個(gè)上調(diào)基因和1714 個(gè)下調(diào)基因，鹽脅迫7 d 時(shí)共有1517 個(gè)差異基因，其中包括795 個(gè)上調(diào)基因和722 個(gè)下調(diào)基因，在CK2_vs_S2 和CK7_vs_S7 兩組兩兩比較的重疊差異基因CK2_vs_CK7 相比有493 個(gè)差異表達(dá)基因，稱其為鹽脅迫響應(yīng)基因。

圖5 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)和韋恩圖Fig.5 DEG statistics graph and Venn diagram

2.7 GO 富集分析

干旱脅迫響應(yīng)基因GO 富集分析結(jié)果表明（圖6），在40 個(gè)干旱脅迫響應(yīng)基因中共有31 個(gè)GO 條目顯著富集，其中生物過(guò)程包括24 個(gè)，分子功能包括7 個(gè)；而細(xì)胞組分無(wú)顯著富集的GO 條目，富集程度前10 的基因均分布在生物過(guò)程中，主要與脅迫響應(yīng)相關(guān)。493 個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因GO 富集分析表明共有16 個(gè)GO 條目顯著富集，生物過(guò)程包括15 個(gè)；分子功能包括1 個(gè)；而細(xì)胞組分無(wú)顯著富集的GO 條目，富集程度前10 的基因均分布在生物過(guò)程中，主要與脅迫響應(yīng)相關(guān)。在干旱和鹽脅迫響應(yīng)基因中，除了與干旱、鹽脅迫相關(guān)的“對(duì)水的響應(yīng)（response to water）”“對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)（response to salt stress）”“對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)（response to osmotic stress）”等得到顯著富集外，其他非生物逆境脅迫響應(yīng)途徑如：“對(duì)溫度刺激的響應(yīng)（response to temperature stimulus）”“對(duì)光強(qiáng)度的響應(yīng)（response to light intensity）”“對(duì)熱的響應(yīng)（response to heat）”“對(duì)冷的響應(yīng)（response to cold）”也在干旱或鹽脅迫響應(yīng)基因中顯著富集，說(shuō)明植物對(duì)不同的非生物逆境脅迫的響應(yīng)是相互聯(lián)系且交織在一起的，植物可能會(huì)利用同一種響應(yīng)機(jī)制來(lái)抵御不同的非生物逆境脅迫。

圖6 干旱和鹽脅迫響應(yīng)差異基因GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of DEG in response to drought and salt stress

2.8 KEGG 富集分析

干旱脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行KEGG 富集分析表明，有2 個(gè)代謝通路顯著富集，分別為“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（protein processing in endoplasmic reticulum）”和“剪接體（spliceosome）”，這2 個(gè)通路均屬于“遺傳信息加工”代謝通路（圖7）。將鹽脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行KEGG 富集分析后只有1 個(gè)代謝通路顯著富集（圖7），為“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）”，這個(gè)通路屬于“環(huán)境信息加工”代謝通路。表明甜高粱幼苗通過(guò)激活與干旱脅迫防御相關(guān)蛋白的表達(dá)和誘導(dǎo)參與碳水化合物代謝相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力，維持細(xì)胞膨壓來(lái)響應(yīng)干旱脅迫；而通過(guò)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)響應(yīng)鹽脅迫。

圖7 干旱和鹽脅迫響應(yīng)差異基因KEGG 富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEG in response to drought and salt stress

2.9 干旱和鹽脅迫下的相關(guān)差異基因分析

根據(jù)RNA-seq 結(jié)果分析，甜高粱幼苗在干旱和鹽脅迫下有23 個(gè)差異基因定位到光合作用代謝途徑上，這些差異基因參與光系統(tǒng)I、光系統(tǒng)Ⅱ、細(xì)胞色素b6/f 復(fù)合體、光合電子傳遞鏈、ATP 酶、天線蛋白和碳同化（圖8A）。注釋導(dǎo)天線蛋白代謝通路的基因有Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4和Lhcb5；定位到光系統(tǒng)I 的基因有Psa D、Psa E、Psa O、Psa N、Psa G、Psa L、Psa F和Psa H；編碼光系統(tǒng)Ⅱ的基因主要有Psb P和Psb Y；參與光合電子傳遞途徑的差異表達(dá)基因主要有Pet E；編碼細(xì)胞色素b6/f 復(fù)合體的為Pet C；編碼ATP 酶的基因主要有delta和b；各有1個(gè) 基 因 編 碼 核 酮 糖-1，5- 二 磷 酸（ribulose-1，5-diphosphate，RuBP）、磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）、丙酮酸磷酸二 激酶（pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK）和NADP-蘋果酸酶（NADP-malic enzyme，NADP-ME）。除了PEPC 外，其余注釋到光合作用上的基因整體表現(xiàn)為鹽脅迫下調(diào)幅度明顯高于干旱脅迫（圖2），干旱脅迫2 d 時(shí)大多數(shù)基因呈下調(diào)狀態(tài)，而在7 d 時(shí)則呈上調(diào)狀態(tài)，不過(guò)上調(diào)的幅度不如CK；PEPC 在干旱和鹽脅迫2 d 時(shí)基因下調(diào)，鹽脅迫基因下調(diào)倍數(shù)高于干旱脅迫，在處理7 d 時(shí)脅迫下PEPC 呈上調(diào)狀態(tài)，鹽脅迫下基因上調(diào)倍數(shù)最大。

海藻糖合成酶（trehalose synthase，TPS）能夠催化UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為海藻糖-6-磷酸（trehalose-6-phosphate，T6P），在這個(gè)重要代謝通路中，干旱脅迫下甜高粱幼苗可能合成了大量的海藻糖（圖8B），脅迫2 和7 d 時(shí)4 個(gè)編碼TPS 的基因均全部上調(diào)表達(dá)；而鹽脅迫2 d 時(shí)3 個(gè)上調(diào)表達(dá)，1 個(gè)下調(diào)表達(dá)，7 d 時(shí)4 個(gè)均下調(diào)表達(dá)；在另一個(gè)關(guān)鍵通路T6P 被TPP 或者TPS 轉(zhuǎn)化為海藻糖的反應(yīng)中，在干旱和鹽脅迫2 d 時(shí)均下調(diào)表達(dá)，7 d 時(shí)均上調(diào)表達(dá)，其中干旱脅迫下的上調(diào)幅度高于鹽脅迫。蔗糖也是常見的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）基因在干旱和鹽脅迫2 d 時(shí)均上調(diào)表達(dá)，7 d 時(shí)鹽脅迫上調(diào)表達(dá)，干旱脅迫下調(diào)表達(dá)，蔗糖-磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase，SPS）的2 個(gè)基因在干旱脅迫2 和7 d 的均上調(diào)表達(dá)，而鹽脅迫只有一個(gè)上調(diào)表達(dá)；在淀粉降解的相關(guān)代謝通路中，編碼α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase，glgP）和β-淀粉酶（βamylase，BAM）各有2 個(gè)基因，glgP 和BAM 基因在鹽脅迫下出現(xiàn)明顯上調(diào)現(xiàn)象，而干旱脅迫下大多為下調(diào)表達(dá)，表明鹽脅迫下淀粉的降解可能被加強(qiáng)。

參與活性氧清除的相關(guān)抗氧化物酶在植物抗逆性中起到重要作用，有2 個(gè)編碼SOD 基因和1 個(gè)編碼POD 基因在脅迫下均上調(diào)表達(dá)（圖8），其中編碼SOD 基因的1 個(gè)基因注釋到Cu-Zn 家族超氧化物歧化酶，1 個(gè)基因注釋到Cu-Mn 家族超氧化物歧化酶，編碼POD 基因的為POD-2C，編碼CAT 基因的為CAT-2和CAT-3，編碼APX的 基 因 為APX-1和APX-2，鹽 脅 迫 下 編 碼SOD 的2 個(gè) 基 因、POD 的1 個(gè) 基 因、CAT 的2 個(gè) 基 因 和APX 的2 個(gè) 基因上調(diào)幅度均高于干旱脅迫，相比于脅迫處理2 d，鹽脅迫處理7 d 時(shí)基因上調(diào)幅度明顯大于干旱脅迫，這一結(jié)果與抗氧化物酶活性的變化相符合。

圖8 干旱和鹽脅迫下的相關(guān)差異基因表達(dá)水平值熱圖Fig.8 Heat map of elated DEGs expression levels under drought and salt stress

植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。根據(jù)RNA-seq 結(jié)果（圖8D～F），在ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，有2 個(gè)基因注釋到受體pyrabactin resistant/PYR-like（PYR/PYL）中，有6 個(gè)基因注釋到負(fù)調(diào)控因子2C 類蛋白磷酸酶（type 2C protein phosphates，PP2C）反應(yīng)元件中，各有一個(gè)基因注釋到SNF1 相關(guān)的蛋白激酶2（SNF1-related protein kinase 2，SnRK2）和結(jié)合因子（ABRE binding factors，ABF）中；在注釋到IAA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的14 個(gè)基因中，其中2 個(gè)基因注釋到gretchen Hagen3（GH3）中，有4 個(gè)基因注釋到small auxin-up RNA（SAUR）中，1 個(gè)基因注釋到auxin resistant 1（AUX1）上，1 個(gè)基因注釋到transport inhibitor response 1（TIR1）上，3個(gè)基因注釋到ARF 上，3 個(gè)基因注釋到auxin resistant 1/like aux 1（AUX/IAA）上；在注釋到CTK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的14個(gè)基因中，其中1 個(gè)基因注釋到cytokinin response 1（CRE1）中，4 個(gè) 基 因 注 釋 到arabidopsis histidinephosphotransfer proteins（AHP）中，3 個(gè)基因注釋到Barabidopsis response regulators（B-ARR）中，6 個(gè)基因注釋到A-arabidopsis response regulators（A-ARR）中；注釋到植物激素信號(hào)通路的這些同源基因在不同處理中表達(dá)模式不同。

2.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNA-seq 數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選10 個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的驗(yàn)證，驗(yàn)證基因的表達(dá)水平以2-△△CT方法計(jì)算。結(jié)果表明：通過(guò)RNAseq 確定的大多數(shù)基因的表達(dá)模式與qRT-PCR 所確定的相似，大多數(shù)RNA-seq 結(jié)果與qRT-PCR 結(jié)果顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9193，P＜0.0001（圖9）。這些數(shù)據(jù)表明，RNA-seq 數(shù)據(jù)與本試驗(yàn)中qRT-PCR 分析所確定的表達(dá)模式具有很好的一致性。

圖9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證RNA-seq 數(shù)據(jù)Fig. 9 Real-time fluorescence quantitative PCR validation RNA-seq data

3 討論

植物響應(yīng)干旱和鹽脅迫既有相同的機(jī)制也有不同的機(jī)制，基因作為植物應(yīng)答環(huán)境脅迫的早期響應(yīng)分子，對(duì)調(diào)控植物應(yīng)對(duì)脅迫條件并逐漸適應(yīng)起到關(guān)鍵作用，隨著組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，RNA-seq 在高粱抗逆性研究中得到廣泛應(yīng)用［12-14，19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)干旱和鹽脅迫2 d 時(shí)甜高粱差異基因數(shù)目分別是7 d 時(shí)的9.0 和2.5 倍，鹽脅迫2 和7 d 時(shí)差異基因數(shù)目是干旱脅迫的2.0 和7.2 倍，這表明甜高粱幼苗在脅迫2 d 時(shí)調(diào)動(dòng)大量基因和生物學(xué)過(guò)程以響應(yīng)脅迫，隨著脅迫時(shí)間的增加，干旱脅迫下差異基因的數(shù)量大幅度減少，并顯著高于鹽脅迫，說(shuō)明甜高粱幼苗響應(yīng)干旱脅迫的生物學(xué)過(guò)程達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，而其對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)還沒(méi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，說(shuō)明甜高粱在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)穩(wěn)態(tài)落后于干旱脅迫。

基于GO 富集分析發(fā)現(xiàn)甜高粱在干旱和鹽處理下差異基因顯著富集于響應(yīng)逆境脅迫調(diào)控；基于KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)甜高粱干旱脅迫響應(yīng)基因顯著富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工和剪接體上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和折疊加工的場(chǎng)所，植物在非生物脅迫條件下會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，剪接體變化能夠影響脅迫環(huán)境中植物mRNA 的穩(wěn)定性。鹽脅迫響應(yīng)基因顯著富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，說(shuō)明甜高粱響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。甜高粱幼苗在響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中能夠誘導(dǎo)參與碳水化合物代謝、次級(jí)代謝以及RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)；激活與干旱脅迫防御和解毒相關(guān)蛋白的表達(dá)，有效維持蛋白加工和降解的平衡，同時(shí)增強(qiáng)了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子，電子和蛋白以及細(xì)胞壁調(diào)節(jié)能力；有效地促進(jìn)關(guān)鍵代謝物的合成代謝途徑（淀粉與蔗糖代謝和苯丙烷類生物合成），提高滲透調(diào)節(jié)能力和細(xì)胞膜穩(wěn)定性，從而更好地抵御干旱脅迫。而鹽脅迫下甜高粱幼苗通過(guò)調(diào)節(jié)植物激素提升植物抗氧化能力和減少細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度，植物激素作為重要的次級(jí)信號(hào)分子，可以激活抗氧化物酶基因的表達(dá)，從而提高抗氧化物酶活性，增強(qiáng)活性氧的清除能力［22］。

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要生理過(guò)程，光合作用大多數(shù)能量來(lái)源于原初反應(yīng)中捕光天線復(fù)合體（1ight harvesting complex，LHC）所吸收的光能，LHC 包括大部分葉綠素a 和全部葉綠素b 及類胡蘿卜素［23-24］。本研究中，有5 個(gè)基因注釋到光合作用-天線蛋白上，并且在脅迫條件下均呈下調(diào)表達(dá)，在鹽脅迫下這些基因的下調(diào)幅度高于干旱脅迫，這可能是由于為了維持鹽脅迫下細(xì)胞的生理生化活動(dòng)，LHC 多個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，從而降低光合速率適應(yīng)脅迫環(huán)境，并且傷害越高基因下調(diào)倍數(shù)越大。RuBP、PEPC、PPDK 和NADP-ME 是碳同化過(guò)程的關(guān)鍵酶，大量研究發(fā)現(xiàn)C4植物在非生物脅迫下PEPC 活性增加，說(shuō)明PEPC 的高表達(dá)可能有助于減緩脅迫引起的光合速率下降［25］。在本研究中，干旱和鹽脅迫下編碼RuBP 的基因呈下調(diào)狀態(tài)，但不同脅迫下基因的變化情況不同，總的來(lái)說(shuō)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，干旱脅迫編碼RuBP 的基因下調(diào)幅度縮小，而鹽脅迫的下調(diào)幅度增大，編碼PEPC 的基因在脅迫7 d 時(shí)呈上調(diào)變化，并且鹽脅迫下上調(diào)倍數(shù)最大，這些都表明干旱和鹽脅迫抑制了甜高粱幼苗的光合作用，并且鹽脅迫的抑制程度要高于干旱脅迫，這與光合生理參數(shù)的變化是相符合的。

植物內(nèi)源激素作為信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，其含量變化在植物響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［26］。當(dāng)受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生大量的ABA，觸發(fā)ABA 誘導(dǎo)的下游生理過(guò)程［27］。在本研究中，干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片ABA 含量和編碼ABA 信號(hào)通路基因的表達(dá)不盡相同，脅迫2 d 時(shí)，干旱脅迫下葉片ABA 含量變化不顯著，鹽脅迫下ABA 含量顯著高于干旱脅迫和CK，CK 和干旱脅迫下編碼ABA 受體PYR/PYL、PP2C、ABF 和SnRK2 基因表達(dá)模式基本相同，而鹽脅迫下的編碼基因表達(dá)模式與CK 和干旱脅迫相反；脅迫7 d 時(shí)，干旱和鹽脅迫下葉片ABA 含量均顯著升高，其中鹽脅迫下ABA 含量顯著高于CK 和干旱脅迫，干旱脅迫 下 編 碼ABA 受 體PYR/PYL、SnRK2 和1 個(gè)PP2C 基 因 下 調(diào) 表 達(dá)，4 個(gè) 編 碼PP2C 和1 個(gè) 編 碼ABF 的 基 因 上 調(diào)表達(dá)，鹽脅迫下編碼ABA 受體PYR/PYL 基因下調(diào)表達(dá)，編碼PP2C、SnRK2 和ABF 基因均上調(diào)表達(dá)，CK 編碼ABA 信號(hào)通路的基因表達(dá)模式與鹽脅迫剛好相反；這可能是由于鹽脅迫早期，甜高粱通過(guò)上調(diào)ABA 合成基因NCED來(lái)促進(jìn)ABA 的合成，從而減少氣孔導(dǎo)度和降低蒸騰速率來(lái)提高甜高粱幼苗的耐鹽能力。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，甜高粱幼苗體內(nèi)的ABA 積累過(guò)量，為了減少ABA 過(guò)量對(duì)其帶來(lái)的不利影響，甜高粱幼苗會(huì)通過(guò)激活A(yù)BA的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)減少ABA 含量，當(dāng)ABA 積累過(guò)量，會(huì)抑制ABA 受體蛋白PYR/PYL 基因表達(dá)，減少ABA與ABA 受體蛋白PYR/PYL 結(jié)合，PYR/PYL 不能與PP2C 互作，但PP2C 能與去磷酸化的SnRK2 結(jié)合，使SnRK2 處于失活狀態(tài)，無(wú)法磷酸化激活下游途徑，抑制下游ABA 應(yīng)答基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而減少ABA 的合成；因此推測(cè)甜高粱幼苗可能依賴植物激素ABA 相關(guān)調(diào)控來(lái)應(yīng)答鹽脅迫，與鹽脅迫相比，干旱脅迫下基因的變化情況表現(xiàn)出不利于ABA 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

可溶性糖是植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的主要有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，具有維持滲透平衡和增強(qiáng)植物吸水的能力［28］。其中的海藻糖具有保護(hù)生物細(xì)胞、生物活性物質(zhì)以及在脅迫中可以穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的功能［29］。研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下木薯（Manihot esculenta）［28］、牛心樸子（Cynanchum komarovii）［30］、玉米［31］中的海藻糖起到主要滲透調(diào)節(jié)作用，Li 等［29］將OsTPS1導(dǎo)入到水稻（Oryza sativa）中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的海藻糖含量顯著升高，從而提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗逆性；Han 等［32］研究發(fā)現(xiàn)木薯葉片海藻糖含量與葉片持水能力呈正相關(guān)；項(xiàng)陽(yáng)等［31］將酵母TPS1基因轉(zhuǎn)入玉米，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因玉米的根系生長(zhǎng)情況和根系活力較野生型極顯著增加；以上結(jié)果均表明海藻糖合成相關(guān)基因的表達(dá)以及海藻糖的積累能夠提高植物的抗逆性。本研究中，在TPS 能夠催化UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為T6P 這個(gè)重要代謝通路中，干旱脅迫上調(diào)的基因數(shù)目多于鹽脅迫，在下一個(gè)關(guān)鍵通路T6P 被TPP 或者TPS 轉(zhuǎn)化為海藻糖，基因上調(diào)表達(dá)的幅度在干旱脅迫下最高，同時(shí)生理數(shù)據(jù)也表明，干旱脅迫下甜高粱幼苗葉片的可溶性糖含量均顯著高于CK 和鹽脅迫，這表明糖代謝及其平衡在響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，海藻糖等可溶性糖含量的大量增加增強(qiáng)了干旱脅迫下甜高粱幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力。

逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的過(guò)量積累，過(guò)量的活性氧能啟動(dòng)質(zhì)膜過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害，為了避免活性氧產(chǎn)物的過(guò)多積累，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生SOD、POD、CAT 和APX 等抗氧化物酶清除多余活性氧產(chǎn)物，減輕對(duì)植物的傷害［33-34］。在本研究中，干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片抗氧化物酶活性均升高，尤其是在鹽脅迫7 d 時(shí)葉片抗氧化物酶活性顯著高于CK，預(yù)示此時(shí)鹽脅迫已經(jīng)導(dǎo)致甜高粱幼苗體內(nèi)生理失調(diào)并積累大量活性氧產(chǎn)物，從而產(chǎn)生次級(jí)氧化脅迫，為了維持正常生理代謝活動(dòng)，鹽脅迫下甜高粱幼苗通過(guò)更高的抗氧化物系統(tǒng)活性來(lái)清除多余活性氧產(chǎn)物，而在干旱脅迫下甜高粱幼苗葉片的抗氧化物酶活性均低于鹽脅迫，說(shuō)明干旱脅迫對(duì)甜高粱幼苗造成的氧化脅迫低于鹽脅迫。進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平來(lái)看，編碼抗氧化物酶的基因變化情況基本與酶活性變化表現(xiàn)一致，同時(shí)鹽脅迫下編碼抗氧化物酶的基因表達(dá)、抗氧化物酶活性變化與ABA 含量表現(xiàn)一致，表明脅迫下植物的ABA 與抗氧化物酶活性關(guān)系密切，這與Guo 等［35］關(guān)于ABA 可誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化物酶基因的表達(dá)，提高抗氧化物酶活性的研究結(jié)論相吻合。鹽脅迫下甜高粱幼苗通過(guò)植物激素ABA 脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)激活抗氧化物酶基因表達(dá)，提高抗氧化物酶活性，這些抗氧化物酶活性的變化和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控共同構(gòu)成甜高粱幼苗抵御鹽脅迫的機(jī)制和策略。

4 結(jié)論

中度干旱和鹽脅迫下，甜高粱幼苗的生物過(guò)程具有共同的調(diào)控途徑，包括：下調(diào)光合氣體交換參數(shù)、積累有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、增強(qiáng)抗氧化物酶活性以及調(diào)節(jié)ABA 等植物激素幫助甜高粱適應(yīng)逆境脅迫；不同的機(jī)制包括：其在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)穩(wěn)態(tài)落后于干旱脅迫，中度脅迫下甜高粱幼苗對(duì)鹽脅迫的耐受性要低于干旱脅迫，可溶性糖在甜高粱幼苗抵御干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗氧化物酶活性變化的共同調(diào)控是甜高粱幼苗對(duì)抗鹽脅迫的關(guān)鍵。