年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中P53及SIRT1的表達及臨床意義

李寧，卜京麗，李娟

白內(nèi)障是各種原因?qū)е碌木铙w混濁，目前已成為首位致盲眼病，其中最常見的是年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)[1]。在我國ARC患者約有500萬，并且每年新增的ARC患者約40萬。若白內(nèi)障病程延緩10年，ARC的發(fā)病率將降低14%，而需要通過手術(shù)治療的ARC患者將減少50%[2]。所以，深入探究ARC的發(fā)病機制，從而有效地降低其發(fā)病率，延緩白內(nèi)障病程進展，對ARC的防治有著重大意義。

晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)的功能對于維持晶狀體透明性起著至關(guān)重要的作用，LECs是ARC研究的關(guān)鍵細胞，凋亡的相關(guān)研究，成了ARC發(fā)病機制中的熱點問題。P53是調(diào)控凋亡的主要因子之一，當DNA受損時，P53表達上調(diào)，引起細胞凋亡[3]。因此，如何保護LECs，避免凋亡發(fā)生，對于ARC的發(fā)病具有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator1，SIRT1)屬于組蛋白脫乙酰酶，其能夠感受細胞內(nèi)的能量水平，避免細胞過早凋亡，延長細胞壽命[4]。目前，SIRT1已成為老年性疾病治療的藥物靶點，通過改變SIRT1的表達，延緩老年性疾病的發(fā)生，對于老年性疾病的防治具有重大意義。對于P53與SIRT1表達情況是否參與ARC發(fā)生和發(fā)展的研究較少，本研究擬對ARC患者LECs內(nèi)P53以及SIRT1表達水平進行分析，以期待為臨床干預ARC的發(fā)生和發(fā)展提供新方向?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月—2020年3月本院收治的20例(20眼)ARC患者為實驗組，選擇相同年齡段行透明晶狀體摘除手術(shù)的視網(wǎng)膜脫離患者20例(20眼)為對照組。實驗組：男8例，女12例；年齡60～70(64.89±2.12)歲；病程2～5(3.06±1.01)年。納入標準：(1)裂隙燈檢查確診為ARC；(2)最佳矯正視力低于0.5；(3)有意愿通過手術(shù)提高視力者。排除標準：(1)高血壓、糖尿病、心臟病等慢性疾病者；(2)其他原因?qū)е碌木铙w混濁；(3)合并青光眼、葡萄膜炎患者不在本次研究范圍；(4)依從性差，不愿意配合研究者。對照組：男7例，女13例；年齡60～70(64.93±2.11)歲。納入標準：(1)新發(fā)孔源性視網(wǎng)膜脫離，病程<1個月；(2)晶狀體無明顯混濁，未達到白內(nèi)障診斷標準；(3)需行晶狀體摘除聯(lián)合玻璃體切割手術(shù)者。排除標準：(1)高血壓、糖尿病、心臟病等慢性疾病者；(2)合并葡萄膜炎、青光眼及其他眼部慢性疾病者；(3)依從性差，不愿意配合研究者。2組患者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。全部患者及其家屬均存在知情同意權(quán)，自愿簽署相關(guān)醫(yī)療文書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 LECs前處理 2組患者均在手術(shù)過程中實施前囊膜環(huán)形撕除，直徑5 mm。使用無菌生理鹽水進行充分清洗，放置在EP管內(nèi)，并置于-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 免疫組織化學SP法檢測LECs內(nèi)P53表達 (1)防脫片；(2)制作常規(guī)石蠟切片；(3)HE染色，并使用中性樹膠進行封片，放置在顯微鏡下觀察和拍照。使用SP免疫組化檢測試劑盒(采購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)對標本內(nèi)P53表達情況進行檢測，全部操作均嚴格依據(jù)試劑盒使用說明進行。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測LECs內(nèi)SIRT1表達情況 選擇LECs組織，使用總RNA提取試劑盒(Trizol法，采購自無錫百泰克生物技術(shù)有限公司)對組織標本內(nèi)總RNA進行提取，使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(采購自美國GeneCopoeia)依據(jù)步驟將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后依據(jù)試劑使用說明配反應體系，加樣。實時熒光定量PCR反應體系共包含20 μL，配制完成后將其放置在熒光定量PCR儀(采購自廈門安普利生物工程有限公司)中實施反應，將操作程序設(shè)置成：95 ℃ 5 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，以上述模式一共開展41次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。并在反應完成后整理所得數(shù)據(jù)，計算SIRT1mRNA相對表達量。

1.2.4 檢測氧化應激因子水平 選擇LECs標本，要求范圍是3 mm×3 mm，添加pH值是7.3的磷酸緩沖液，使用渦旋振蕩，并置于-4 ℃環(huán)境中冷凍離心，使用酶聯(lián)免疫吸附法開展定量檢測，主要指標有GSH-Px、GSH、MDA以及SOD。

1.3 觀察指標 (1)比較2組患者P53以及SIRT1的表達水平。P53蛋白表達陽性的細胞中，細胞核表現(xiàn)為棕黃色，使用高倍鏡(×40)進行觀察，并在此基礎(chǔ)下每張切片隨機選擇5個高倍視野用于表達情況統(tǒng)計，開展灰度值掃描。(2)比較2組患者氧化應激指標水平。

2 結(jié)果

2.1 2組患者P53及SIRT1的表達水平比較 實驗組患者P53以及SIRT1表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者P53以及SIRT1的表達水平比較

2.2 2組患者氧化應激指標水平 比較實驗組患者GSH-Px、GSH以及SOD、MDA水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者氧化應激指標水平比較

2.3 影響ARC發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 為減少自變量之間的混雜干擾，將上述因素分析中與ARC發(fā)生有關(guān)的P53、SIRT1表達水平及GSH-Px、GSH、SOD、MDA水平進行多因素逐步Logistic回歸分析，ARC為因變量(有=1，無=0)，其他因素為自變量，均以實際值賦值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIRT1表達水平為ARC發(fā)生的保護因素，P53以及GSH、SOD、MDA水平為ARC發(fā)生的獨立危險因素(P均<0.05)。見表3。

表3 影響ARC發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

3 討論

ARC是世界范圍內(nèi)主要致盲眼病，其發(fā)病機制復雜，氧化損傷是其主要致病原因[5]。正常人晶狀體內(nèi)有功能良好的抗氧化系統(tǒng)，能夠有效阻擋外部因素所造成的氧化應激傷害，隨著年齡增長，自身晶狀體抗氧化功能逐漸下降，導致白內(nèi)障出現(xiàn)。SH-Px、GSH以及SOD、MDA等是反應組織氧化損傷程度的重要指標，氧化應激時會有上述細胞因子表達的升高。而ARC的發(fā)生、發(fā)展與LECs的狀態(tài)密切相關(guān)，LECs的凋亡是ARC發(fā)病的細胞學基礎(chǔ)。高水平的氧自由基造成LECs代謝異常，使LECs凋亡及晶狀體蛋白變性[6]。ARC患者LECs存在大量凋亡細胞，未患白內(nèi)障同齡人LECs僅有少量凋亡細胞，而LECs的凋亡、脫落，Ca2+的穩(wěn)態(tài)失衡，造成細胞膜通透性增加，導致晶狀體混濁[7]。凋亡是細胞在應激條件下，由基因調(diào)控的有序且主動的程序性細胞死亡過程，是人體正常生長發(fā)育的組成部分，細胞凋亡的不平衡則會導致細胞的生長或者死亡。凋亡由多種途徑介導，同時受多種凋亡因子調(diào)控，其中P53是調(diào)控凋亡的主要因子之一，P53是當前發(fā)現(xiàn)的同人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，編碼的蛋白處于細胞核內(nèi)，對細胞生長發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，能夠促進細胞凋亡。當氧化應激損傷發(fā)生時，機體通過上調(diào)P53，降低Bcl-2/Bax比例，激活半胱氨酸水解酶(caspase)通路[8]，使處于線粒體內(nèi)的細胞色素C以及處于胞質(zhì)內(nèi)的ATP被大量釋放，當上述2種物質(zhì)同凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合后能夠?qū)aspase9產(chǎn)生激活效應，處于激活狀態(tài)的caspase9能夠?qū)ο掠涡鞍譪aspase3產(chǎn)生裂解，進而引起細胞凋亡，同時P53還可促使氧化應激有關(guān)基因形成，表達產(chǎn)物形成活性氧等，進一步增加細胞色素C釋放量，激活caspase而促進細胞凋亡；另一方面，P53可誘導死亡配體Fas/Apol以及KILLER/DR5形成三聚體，并結(jié)合至相應配基，引起下游效應caspase裂解，進而導致細胞凋亡[9-11]，同時P53促進細胞周期停滯為細胞損傷修復創(chuàng)造條件，對于損傷后不能修復的細胞，誘導細胞衰老和凋亡來清除。在此基礎(chǔ)上，尋找降低LECs凋亡的保護途徑或者增強LECs抵抗凋亡的保護體系，無疑對于ARC的發(fā)病進程產(chǎn)生積極的影響。

近年來，SIRT1逐漸走進人們視線，并越來越多地受到人們的重視。SIRT1是一種細胞代謝輔酶NAD+依賴地Ⅲ類組蛋白去乙?；?，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝以及細胞衰老過程的調(diào)節(jié)，具有延長生物壽命，延緩各種年齡相關(guān)性疾病進展的作用，因此，在抗衰老領(lǐng)域備受關(guān)注。SIRT1可以通過調(diào)節(jié)叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O,FOXOs)、P53等的活性，通過組蛋白脫乙酰基作用，發(fā)揮抗凋亡的作用[12]，從而延緩年齡相關(guān)性疾病的進展。P53是SIRT1的重要底物，在正常情況下，P53呈現(xiàn)休眠狀態(tài)，但是當細胞發(fā)生DNA損傷等刺激后，在P53 C末端的多個賴氨酸位點出現(xiàn)乙酰化，從而呈現(xiàn)激活狀態(tài)，刺激下游多種靶基因轉(zhuǎn)錄，誘導細胞凋亡[13]。而SIRT1能夠利用去乙?；疨53后降低P53介導的轉(zhuǎn)錄激活，進而發(fā)揮維護細胞避免出現(xiàn)凋亡的效果[14]。SIRT1作為機體自身防御體系的重要組成成分，當氧化應激發(fā)生時可出現(xiàn)反應性表達上調(diào)，既往報道[15]顯示，在角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜等組織中均觀察到SIRT1的表達。同其他細胞相同，在氧化損傷環(huán)境中出現(xiàn)反應性上調(diào)，也是SIRT1對人LECs發(fā)揮保護作用的關(guān)鍵措施，從而降低細胞凋亡水平，延緩ARC疾病進展。

本次研究中，在GSH-Px、GSH以及SOD、MDA水平方面，實驗組均高于對照組，實驗組P53、SIRT1表達水平高于對照組，該結(jié)果與文獻報道[6]結(jié)果一致。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，ARC發(fā)病過程中伴有氧化應激的發(fā)生，在氧化損傷的過程中伴有P53的表達上調(diào)促進細胞凋亡，SIRT1的表達上調(diào)，是LECs保護自身，避免凋亡的重要因素之一。目前，對于ARC的研究多針對其致病原因行相關(guān)細胞因子檢測，而對于如何抑制凋亡、延緩ARC病程進展研究較少。本研究不但從致病因素，同時從如何延緩ARC病程進展、抑制凋亡兩方面同時入手。但因樣本量及細胞因子較少等因素影響，本研究也存在一定不足，P53如何促進凋亡、SIRT1如何在ARC的發(fā)病過程中對LECs起著保護作用以及如何調(diào)控P53表達水平影響LECs凋亡等分子機制還需在增加樣本量以及更多細胞因子、更多調(diào)控途徑的基礎(chǔ)上，進行進一步深入研究。

綜上所述，ARC患者LECs內(nèi)，P53、SIRT1呈高表達，在ARC的發(fā)病中起著潛在的作用。通過SIRT1的表達調(diào)節(jié)，延緩ARC的病程進展，可作為ARC藥物治療的靶點，為ARC的預防和治療提供新的理論依據(jù)。