沙米酒液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化及抗氧化活性

徐貴靜，王新本，賈孝榮

蘭州古馳生物科技有限公司（蘭州 730050）

沙米（Agriophyllum squarrosum），為莧科藜亞科沙蓬屬草本植物，一般多指它的種子，種子形狀扁平，近圓形，其別名為沙蓬、東薔等[1-2]。在歐洲中部、部分亞洲地區(qū)和西伯利亞均有分布，在我國華北、西北及東北地區(qū)的沙漠中廣泛分布，而河南、西藏等的部分地區(qū)也有種植，甘肅民勤沙米也廣泛種植[3]。有關(guān)沙米可食用的記載，最高可追溯于1 000多年前的唐朝，其還曾充作軍糧使用。據(jù)《甘肅中草藥資源志》記載，沙米性甘、平，具有健脾消食、發(fā)表解熱、利尿等功能?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，食用沙米可降血脂，促消化，增強免疫力。沙米營養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)約占20%，脂肪10%，粗纖維8%，碳水化合物45%，沙米中的Se、Zn、Ga、Mg、K的含量較高，蛋白質(zhì)和氨基酸的含量高于小麥、大米、高粱等糧谷類，同時含有大量的纖維素[4-7]，另外還含有綠原酸、異黃酮、皂苷、生物堿等生理活性物質(zhì)[8-9]，綜合認定沙米是一種優(yōu)良的減肥食品。目前，關(guān)于沙米食品方面的研究，主要是將沙米脫殼粉碎后，制成涼粉、點心、轉(zhuǎn)刀面等美食[10]。但是沙米發(fā)酵類產(chǎn)品較少，只見關(guān)于酸奶的報道[11-12]，沙米酒的報道較少。因此，試驗以沙米為原料，進行沙米液態(tài)酒釀造工藝的研究，以提高沙米的經(jīng)濟價值，并為今后產(chǎn)品的研發(fā)奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙米，市售；食品級液化酶，酶活力為2 000 U/g（邢臺萬達生物工程有限公司）；食品級糖化酶，酶活力為50 000 U/g（江蘇博立生物制品有限公司）；活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；AUW120D分析天平（西安精大檢測設備有限公司）；搖床（中科院武漢科學儀器廠）；恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設備廠）。

1.2 操作要點

1.2.1 原料準備

沙米去除泥沙石頭等雜質(zhì)后，與大米按照一定的比例混合，粉碎后待用。

1.2.2 液化

將粉碎后的沙米和大米與水按照一定的比例混合，混合后在4 ℃條件下靜置4~8 h，使淀粉充分吸水，然后加熱升溫升至80~90 ℃時，溶液有黏稠感時加入液化酶（添加量15 U/g），液化時間為20 min。

1.2.3 糖化

液化結(jié)束后，待發(fā)酵醪溫度降至60 ℃時，加入糖化酶（添加量150 U/g），糖化時間為40 min，糖化結(jié)束后，將發(fā)酵醪加熱至沸騰，使之加入的液化酶和糖化酶滅活。

1.2.4 酒精發(fā)酵

糖化結(jié)束后，待發(fā)酵醪溫度降至30 ℃左右時，加入活化后的酵母（添加量1%），發(fā)酵溫度為20~38℃，在酒精發(fā)酵初期酵母菌需要在有氧的環(huán)境中大量繁殖，因此需要通入少量的空氣，而在發(fā)酵中后期酵母進行無氧發(fā)酵，將糖轉(zhuǎn)化為酒精，在整個發(fā)酵過程中需要將產(chǎn)生的CO2氣體及時排出[13-14]。

1.2.5 分離與澄清

酒精發(fā)酵結(jié)束后，將上層清液分離出來，然后加入1‰的皂土，將其置于4~10 ℃環(huán)境中15~30 d，分離出上清液，灌裝。皂土使用須活化，其方法為皂土與滅菌水按照料液比1∶5~1∶10（g/mL）混勻，混勻后在4~10 ℃環(huán)境中靜置1~2 d[15-16]。

1.3 指標測定

1.3.1 基本理化指標的測定

酒精度采用GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》方法測定；pH采用pH計直接測定，總酸含量采用GB/T 13662—2018《黃酒》中的酸堿滴定法。

1.3.2 抗氧化活性的測定

清除DPPH自由基活性能力參照Zhou等[17]的方法，清除ABTS自由基活性能力參照Yan等[18]的方法，抗氧化能力采用FRAP法進行測定。

1.4 沙米液態(tài)酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.1 沙米液態(tài)酒發(fā)酵工藝單因素試驗

1.4.1.1 沙米添加量對酒精度的影響

將沙米與大米粉碎后混勻，按照料液比1∶5（g/mL）加入水，經(jīng)液化、糖化，接入酵母菌，于28 ℃發(fā)酵7 d，進行酒精度的測定，其中沙米添加量分別為5%，10%，15%，20%及25%。

1.4.1.2 料液比對酒精度的影響

將沙米與大米粉碎后混勻，分別按照料液比1∶1，1∶3，1∶5，1∶7及1∶9（g/mL）加入水，經(jīng)液化、糖化，接入酵母菌，于28 ℃發(fā)酵7 d，進行酒精度的測定。

1.4.1.3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響

將沙米與大米粉碎后混勻，按照料液比1∶5（g/mL）加入水，經(jīng)液化、糖化，接入酵母菌，分別于20，24，28，32及36 ℃發(fā)酵7 d，進行酒精度的測定。

1.4.1.4 發(fā)酵時間酒精度的影響

將沙米與大米粉碎后混勻，按照料液比1∶5（g/mL）加入水，經(jīng)液化、糖化，接入酵母菌，于28 ℃分別發(fā)酵3，5，7，9及11 d，進行酒精度的測定。

1.4.2 沙米液態(tài)酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

為了確定沙米液態(tài)酒的最佳工藝參數(shù)，運用Box-Behnken進行試驗設計，選取沙米添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）4個重要工藝參數(shù)為因素，以最終發(fā)酵結(jié)束后沙米酒的酒精度為指標評價，優(yōu)化沙米液態(tài)酒發(fā)酵工藝參數(shù)，響應面試驗因素與水平表見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平

1.5 沙米液態(tài)酒抗氧化活性的研究

將按照最優(yōu)工藝制備得沙米酒進行清除DPPH自由基、ABTS自由基活性及抗氧化能力的測定，以純大米釀造的液態(tài)酒為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙米添加量對酒精度的影響

沙米添加量對酒精度的影響見圖1。由圖1可知，隨著沙米添加量的增大，其沙米酒的酒精度呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，當沙米添加量超過15%時，酒精度又會逐漸降低，可能是沙米中含有較高量的抗性淀粉，液化及糖化不徹底[19]。因此，選擇沙米添加量15%進行后續(xù)的研究。

圖1 沙米添加量對酒精度的影響

2.2 料液比對酒精度的影響

不同料液比對酒精度的影響見圖2。由圖2可知，隨著液體比例的增大，沙米酒的酒精度呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，當料液比為1∶5（g/mL）時，所制備液態(tài)酒酒精度最高。由于加水過少，淀粉不可以徹底糊化，黏度偏高，影響液化、糖化過程，最終導致沙米酒的酒精度偏低，而加水量過多，又會導致發(fā)酵液中糖濃度偏低，隨著液體比例的增大，其酒精度又會逐漸減低，其還會導致所釀酒風味寡淡。因此，料液比選擇1∶5（g/mL）。

圖2 料液比對酒精度的影響

2.3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響

不同發(fā)酵溫度對酒精度的影響見圖3。由圖3可知，當發(fā)酵溫度為28 ℃時，所得沙米液態(tài)酒的酒精度最大，當發(fā)酵溫度低于28 ℃時，隨著溫度的升高酒精度也逐漸升高，而當溫度高于28 ℃時，隨著溫度的升高，酒精度又逐漸降低。由于溫度對酵母的繁殖、代謝影響較大，當溫度較低時，酵母代謝能力緩慢，只會將發(fā)酵液中部分糖轉(zhuǎn)化為酒精，而溫度較高時，酵母的發(fā)酵速率較快，但是會導致酵母老化，且殘?zhí)橇扛撸凭a(chǎn)量低[20]。因此，發(fā)酵的最適溫度選擇28 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響

2.4 發(fā)酵時間對酒精度的影響

不同發(fā)酵時間對酒精度的影響見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，其酒精度也呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，如果發(fā)酵時間短，酵母不能把發(fā)酵液中的糖分全部轉(zhuǎn)化為乙醇，會導致酒精度低，而發(fā)酵時間較長時，會導致酵母老化，造成所釀酒的酒精度低[21]。因此，最適發(fā)酵時間選擇7 d。

圖4 發(fā)酵時間對酒精度的影響

2.5 響應面試驗結(jié)果及模型的建立及分析

研究根據(jù)沙米液態(tài)酒發(fā)酵工藝單因素試驗結(jié)果，最后選定沙米添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵溫度（C）及發(fā)酵時間（D）為響應面試驗的四個因素，以最終制得的沙米酒的酒精度為響應值，進行四因素三水平Box-Behnken響應面試驗，其試驗結(jié)果如表2所示。其二次多元回歸模型為：

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

R=9.42+0.13A+0.083B+0.67C+0.19D+0.025AB-0.025AC+0.075AD-0.075BC-0.8A2-0.86B2-1.36C2-1.22D2

由表3可知：模型方程差異極顯著（p＜0.000 1），說明此模型有顯著意義；失擬項差異不顯著（p=0.058 0，p＞0.050 0），說明此回歸模型可以充分反映沙米添加量、料液比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間四個因素對沙米酒酒精度的影響；決定系數(shù)（R2）為0.984 7，校正系數(shù)（AdjR2）為0.969 5，說明模型擬合度較好，所得結(jié)論可信度高，可以較好地反映沙米添加量、料液比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間和沙米酒酒精度的關(guān)系，還可以用于推測和分析沙米液態(tài)酒的酒精度，該模型可以涵蓋該模型91.65%響應值的變化，試驗誤差小。

表3 回歸模型方差分析表

該回歸模型的一次項、二次項中的A、C、D、A2、B2、C2、D2均表現(xiàn)出顯著水平，其中C、D、A2、B2、C2、D2表現(xiàn)極顯著（p＜0.01）；各因素對沙米液態(tài)酒的酒精度影響依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞沙米添加量＞料液比。

沙米添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）之間的交互作用對沙米液態(tài)酒酒精度的影響見圖5。由圖5可知，沙米添加量一定時，料液比為1∶3~1∶5（g/mL）時，所釀酒的酒精度隨料液比的增大而增大，達到最大值后，所釀酒的酒精度隨料液比的增大又逐漸減??；而料液比一定時，所釀酒的酒精度隨沙米添加量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而隨著發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的增加，其對所釀酒的酒精度也呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，其中沙米添加量和發(fā)酵溫度的交互作用相對顯著一些。

圖5 沙米添加量、料液比、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間交互作用對酒精度影響的響應面及等高線

2.6 響應面工藝的驗證

試驗優(yōu)化得到的沙米液態(tài)酒的最佳工藝參數(shù)為沙米添加量15.5%、料液比為1∶5.14（g/mL）、發(fā)酵溫度28.6 ℃、發(fā)酵時間7.1 d，所產(chǎn)沙米液態(tài)酒的酒精度為9.5%vol。為了更好地控制沙米液態(tài)酒的工藝參數(shù)，將沙米液態(tài)酒釀造工藝參數(shù)修正為沙米添加量15.5%、料液比為1∶5（g/mL）、發(fā)酵溫度29 ℃、發(fā)酵時間7 d。在此條件下進行3次平行驗證試驗，沙米液態(tài)酒的酒精度為9.6%vol±0.2%vol，與預測值之間的相對誤差為0.11%，證明此模型擬合準確、可行。

2.7 沙米抗氧化活性的研究

以純大米液態(tài)酒為對照，測定DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和抗氧化能力，結(jié)果見表4。由表4可知，沙米液態(tài)酒對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力顯著高于對照組，分別為對照組的8.7倍和12倍，而FRAP抗氧化能力為對照組的8.3倍。由于沙米中含有8種酚類化合物，分別為原兒茶酸、兒茶素、雙羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷和阿魏酸，其中原兒茶酸含量最高，而大米中只檢測到羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、阿魏酸和槲皮素5種酚類化合物，沙米中總多酚含量約為大米的12倍[22-25]，這造成沙米液態(tài)酒對自由基的清除能力和抗氧化能力明顯高于對照組。

表4 沙米液態(tài)酒和純大米液態(tài)酒抗氧化活性

3 結(jié)論

對沙米液態(tài)酒的發(fā)酵工藝進行響應面試驗優(yōu)化，確定的最佳工藝條件為沙米添加量15.5%、料液比1∶5（g/mL）、發(fā)酵溫度29 ℃、發(fā)酵時間7 d，在此條件下沙米液態(tài)酒的酒精度為9.6%vol，與預測值之間的相對誤差為0.11%。各因素對沙米液態(tài)酒的影響依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞沙米添加量＞料液比，通過對回歸模型進行方差分析和交互作用分析，得知該回歸模型極顯著，試驗擬合較好，沙米液態(tài)酒對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和抗氧化能力顯著高于對照組。因此，采用響應面法分析優(yōu)化得到的參數(shù)具有一定的實用價值。