香蕉枯萎病菌內(nèi)源報告基因比卡菌素聚酮合酶編碼基因Bik1的鑒定及應(yīng)用

王艷瑋 曾凡云 漆艷香 丁兆建 謝藝賢 張欣 彭軍

摘? 要：香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停?f. sp. ， Foc）引起的香蕉毀滅性土傳病害，其中4號生理小種（Foc4）能感染幾乎所有的香蕉品系，危害最嚴(yán)重。本研究克隆鑒定Foc4比卡菌素聚酮合酶編碼基因（ gene， ），編碼一個由2036個氨基酸組成的多功能酶，具有I型PKS聚酮合酶的保守結(jié)構(gòu)域，包含?；D(zhuǎn)移酶功能域[acyl-carrier protein （ACP） transacylase， SAT]，β-酮脂酰合成酶功能域（β-ketoacyl synthase， KS），丙二酰?；D(zhuǎn)移酶功能域（acyltransferase， AT），脫氫酶（dehydratase， DH）以及硫酯酶（thioesterase， TE）等多個保守蛋白結(jié)構(gòu)域。采用Split-marker同源重組技術(shù)獲得基因敲除突變體，通過比較突變體和野生菌株生長速度、產(chǎn)孢量、致病力等差異，證明突變體僅影響次生代謝產(chǎn)物比卡菌素的生物合成，不影響病原菌的其他生理表型及致病力;其次，突變體搖培后菌液呈白色，與野生型Foc4的暗紅色形成鮮明對比，說明基因符合作為內(nèi)源報告基因的條件。本研究以為內(nèi)源靶標(biāo)基因，利用水稻惡苗病菌（）的基因編輯載體pUC-fFuCas9-HTB-hph，嘗試以質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)Cas9和sgRNA的方式探索Foc4中CRISPR/Cas9編輯的可行性。gRNA序列由在線網(wǎng)站設(shè)計，構(gòu)建的sgRNA162導(dǎo)入質(zhì)粒構(gòu)建靶向的pUC-fFuCas9-HTB-hph-Foc4Bik1基因編輯載體，與供體質(zhì)粒pUC19-Foc4Bik1-HDR一起導(dǎo)入原生質(zhì)體通過同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR）的方式進(jìn)行基因編輯。經(jīng)過潮霉素抗性篩選獲得的（HDR）基因編輯后的敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測和搖培，白色菌液表型與PCR檢測陽性的敲除轉(zhuǎn)化子相互對應(yīng)，證實了Foc4基因編輯的可行性。此外，可作為香蕉枯萎菌Foc4內(nèi)源報告基因并評估探索新的分子生物學(xué)技術(shù)在香蕉枯萎菌上應(yīng)用的可能性。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎菌4號生理小種（Foc4）;比卡菌素聚酮合酶基因;基因敲除;表型分析;CRISPR/Cas9基因編輯中圖分類號：S668.4 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Identification and Feasibility Analysis the Endogenous Reporter Gene of gene （） in f. sp. race 4

WANG Yanwei， ZENG Fanyun， QI Yanxiang， DING ZhaoJian， XIE Yixian， ZHANG Xin， PENG Jun

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests / Haikou， Hainan 571101， China; 2. Department of Biological Science， Qiongtai Normal University， Haikou， Hainan 571127， China

f. sp. （Foc） causes wilt （Panama disease）， one of the most devastating diseases of banana （ spp.）. Foc race 4 （Foc4） is currently known as a major concern in global banana production. Previous studies reported that gene encoded a polyketide synthase responsible for the biosynthesis of a red pigment bikaverin in ， and the mutant totally lost the ability to produce pigmented mycelia. In this study， the orthologous gene （FOIG_14908） in Foc4 was cloned and identified. The objective of this study was to identify the gene （FOIG_14908） in Foc4 which had potential as an endogenous reporter gene of Foc4， which could serve as a promising target gene for assessing the feasibility of newly developed CRISPR/Cas9 gene editing technique in Foc4. Foc4Bik1 is a typical type I fungal multifunctional polyketide synthase （PKS） composed of 2036 amino acids that contains conserved protein domain. SMART revealed that Foc4Bik1 contained conserved protein structure such as acyl-carrier protein （ACP） transacylase （SAT）， β-ketoacyl synthase （KS）， acyltransferase （AT）， dehydratase （DH） and thioesterase （TE）. The gene-knockout mutants were obtained by the split-marker homologous recombination technique. After two rounds of PCR amplification， the upstream and downstream recombination fragments required for protoplast transformation were successfully amplified by the split-marker approach. The knockout mutant was obtained via PEG-mediated protoplast transformation， the positive transformants were verified with the PCR method. The gene-knockout mutants showed no significant effects on fungal growth， conidial production， and pathogenicity to banana plantlet （Cavendish， AAA）， albeit the gene-knockout mutants totally lost the ability to produce reddish pigmented mycelia， and thus the mycelia turned white when cultured in liquid PDB media. Therefore， could be selected as an endogenous reporter gene to verify whether the feasibility of CRISPR/Cas9 gene editing technology available for the filamentous fungus Foc4 via the plasmid CRISPR/Cas9 system. TheCRISPR/Cas9 vector pUC-fFuCas9-HTB-hph （Addgene， #121092） was used in this study. gRNA sequence was designed via the online software， and the sgRNA162 sequence was introduced into gene editing plasmid resulted the Foc4 CRISPR/Cas9 gene editing vector， pUC-fFuCas9-HTB-hph-Foc4Bik1， associated with donor plasmid pUC19-Foc4Bik1-HDR served as homology directed repair （HDR） template co-transformation into Foc4 protoplasts. Specifically， mutants totally lost the ability to produce pigmented mycelia appeared white mycelia. Using the white mycelia as the judging phenotype， the candidate （HDR） gene replacement mutants with white mycelia when grown in PDB liquid medium were selected for subsequent PCR detection. However， the white phenotypes were coupled with the positive PCR amplification bands. It is important that the positive （HDR） gene replacement mutants could be picked up according to the white phenotype by eyes without PCR procedures. The results proved that CRISPR/Cas9 system is stable and can efficiently disrupt the genes of interest， and Foc4Bik1 gene can serve as the endogenous reporter gene for further Foc4 molecular biology research.

f. sp.; - gene （）; gene knockout; phenotype analysis; CRISPR/Cas9 gene editing

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.005

鐮刀菌屬包括禾谷鐮刀菌（）、串珠鐮刀菌（）、尖孢鐮刀菌（）、擬枝孢鐮刀菌（）等主要的植物病原真菌，能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物。其中，聚酮類化合物的種類最為豐富，它以乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A或其衍生物為底物，經(jīng)聚酮合酶（PKS）催化而成。比卡菌素（bikaverin）是一種紅色的四環(huán)聚酮化合物，具有抗菌、抗腫瘤的活性，擁有巨大的應(yīng)用潛力。比卡菌素的生物合成的基因簇以及生物合成途徑已經(jīng)解析清楚，基因編碼催化抗生性聚酮化合物合成的關(guān)鍵酶。在植物模式病原真菌水稻惡苗病菌（）中證明了I型聚酮合酶pks4參與了紅色次生代謝產(chǎn)物比卡菌素的生物合成，（現(xiàn)更名為）突變體不能產(chǎn)生比卡菌素，bikaverin生物合成基因簇中包含有6個基因都參與比卡菌素的合成，依次命名為。其中全長6270 nt，含有3個內(nèi)含子，編碼2009個氨基酸。編碼I型聚酮合酶，將1個乙酰輔酶A和8個丙二酰輔酶A聚合形成比卡菌素前體物，負(fù)責(zé)紅色色素比卡菌素的生物合成。編碼FAD依賴性單加氧酶（Bik2），編碼o-甲基轉(zhuǎn)移酶（Bik3），編碼A樣家族結(jié)構(gòu)域蛋白，編碼一個真菌特異性的Zn（II）2Cys6轉(zhuǎn)錄因子，編碼一個MFS轉(zhuǎn)運蛋白?；虼刂械拿恳粋€基因的缺失都會導(dǎo)致比卡菌素合成量的全部丟失或顯著減少。敲除突變體中無法合成比卡菌素;和影響比卡菌素的合成量，敲除后僅產(chǎn)生微量的比卡菌素。具有成為內(nèi)源報告基因的特征和潛力。是目前絲狀真菌中鑒定到的最長的編碼基因，此外，參與催化合成的紅色色素比卡菌素的生物合成，敲除突變體不能合成比卡菌素從而喪失了紅色色素合成能力，搖培后的菌液呈白色。在構(gòu)建棉花枯萎菌（ f. sp. ， Fov）的高效CRISPR/Cas9基因編輯體系中，F(xiàn)ovBik1作為內(nèi)源報告基因評估編輯的效率，原核表達(dá)Cas9蛋白后，與體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA體外組裝成核糖體核蛋白復(fù)合體RNP，連同供體DNA一并原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化敲除靶標(biāo)基因，敲除成功的突變體搖培后的菌液呈白色，與野生型的紅色菌液對比明顯，直接通過顏色差異即可判斷基因編輯是否成功。

香蕉枯萎病是破壞香蕉維管束導(dǎo)致植株死亡的毀滅性土傳病害，其病原菌為尖孢鐮刀菌古巴轉(zhuǎn)化型（ f. sp.， Foc），其中4號生理小種（Foc4）是致病力最強的小種，其致病機制和防控措施是香蕉產(chǎn)業(yè)的重要問題，也是熱帶地區(qū)植物病理學(xué)研究的熱點和難題之一。利用反向遺傳學(xué)基因功能日趨成熟，通過基因敲除（gene knockout）、RNAi干擾（RNA gene silencing， RNAi）等技術(shù)創(chuàng)造突變體并研究突變體的表型從而闡述基因的生物學(xué)功能。對Foc4而言，這些反向遺傳學(xué)操作都需要一系列的操作，成功率受到很多因素制約?；蚯贸蛇x擇的篩選標(biāo)記有限，而有些特殊的致死基因敲除后無法獲得敲除突變體。利用RNAi基因沉默不能完全消除背景基因的影響，并且RNAi發(fā)夾中同源序列的dsRNA可能干擾其他非靶標(biāo)基因出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9， CRISPR/Cas9）是近年開展的一種方便靈活的基因組編輯技術(shù)，可直接在基因組上進(jìn)行DNA序列的插入、敲除、定點突變以及組合編輯等，尤其是在水稻惡苗病菌（）以及尖孢鐮刀菌棉花專化型（f. sp. ， Fov）上的成功編輯極大地促進(jìn)了鐮刀菌分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究。但是Foc4目前尚無CRISPR/Cas9基因編輯的相關(guān)報道，因此，建立可靠的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)并高效地刪除目的基因是進(jìn)行基因功能分析的重要前提。

尖孢鐮刀菌（）中也有比卡菌素的生物合成途徑。通過生物信息學(xué)功能域分析軟件分析，F(xiàn)oc4菌株含有I型PKS聚酮合酶同源基因（FOIG_14908），開展基因敲除及表型分析，觀察基因敲除缺失突變體是否出現(xiàn)菌液顏色變化并評估作為內(nèi)源報告基因的可行性。其次，香蕉枯萎病目前尚無CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的報道，借鑒水稻惡苗病菌（）的基因編輯載體pUC-fFuCas9-HTB-hph（Addgene， #121092），嘗試構(gòu)建了以為靶標(biāo)基因的基因編輯體系，評估Foc4中構(gòu)建基因編輯的可行性，為后續(xù)的香蕉枯萎菌的分子生物學(xué)研究提供有力的技術(shù)支撐。

材料與方法

? 材料

1.1.1? 試驗菌株及香蕉品種? 香蕉枯萎病菌4號生理小種（ f. sp. race 4， Foc4）由本實驗室鑒定保存。試驗接種的香蕉品種為‘巴西蕉’（Cavendish cv. Brazil， AAA）。

1.1.2? 試劑? 2× Master Mix DNA聚合酶（#P112）、DNase I（#EN401）、Realtime PCR試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（#Q711）、Phata Max Super-fidelity DNA高保真酶（#P505）、ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重組試劑盒（#C112）等購自南京諾唯贊（Vazyme）生物科技股份有限公司;Trizol RNA提取試劑（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Alkali-Cation Yeast Transformation Kit（#112200200）以及其他分析純及試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司;引物由北京華大基因合成（PAGE純化）。

方法

1.2.1? 真菌DNA的制備? 采用CTAB方法提取真菌的基因組DNA。將實驗室保存的Foc4野生型菌株接種到PDA平板上，28℃培養(yǎng)3～5 d后，刮取新鮮的菌絲，按照CTAB方法提取菌絲DNA。其他突變體的DNA提取按照Foc4的操作方法和步驟進(jìn)行。

1.2.2? Bik1蛋白結(jié)構(gòu)域分析及基因敲除片段擴增利用在線蛋白功能域預(yù)測分析軟件SMART（simple modular architecture research tool， http：// smart.embl.de）分析基因的保守功能域。參考的基因序列（FOIG_14908）和已發(fā)布的Foc4野生株基因組序列（JH658279.1），設(shè)計引物L(fēng)BCK和LB-R，RB-F和RBCK（表1）擴增基因的上下游片段;設(shè)計HYG-F和HYG-R引物（表1）擴增驗證潮霉素片段;重組上下游片段則分別通過引物L(fēng)B-F、HYG-R1和HYG-F1、LB-R（表1）來擴增。Outside引物檢測靶標(biāo)基因是否被重組片段替換（敲除），而Inside引物檢測內(nèi)源基因。

1.2.3? 原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化? 香蕉枯萎病菌原生質(zhì)體制備參照王飛燕等的方法進(jìn)行。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照徐齊君等的方法。以培養(yǎng)3?d的Foc4野生株為原始菌株制備濃度為1×10個/mL的原生質(zhì)體，分別取3～5 μg上下游片段回收產(chǎn)物與1?mL原生質(zhì)體混勻，冰上放置30?min;取2?mL 60% PTC分3次緩慢加入到混合液，冰上放置15～20?min;將預(yù)冷的STC溶液加入到混合液至25 mL，4℃，5000 r/min離心15 min棄上清液;加入無抗性的SR液體培養(yǎng)基3 mL，再加入含有100 μg/mL潮霉素和50 μg/mL鏈霉素的SR固體培養(yǎng)基混勻后均勻倒在培養(yǎng)皿上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5?d后得到轉(zhuǎn)化子，并連續(xù)培養(yǎng)3代得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 ?敲除突變體PCR鑒定? 敲除重組DNA片段需要包含靶標(biāo)基因5上游約1 kb的同源序列、抗性基因序列、3下游約1 kb的同源序列。Split-marker重組方法參考WANG等的方法構(gòu)建Split-marker基因敲除重組片段，包含2個重組DNA片段，具體分2步進(jìn)行。第1輪PCR擴增3個片段：HYG-F/HYG-R擴增HYG抗性基因1.4 kb;Foc4基因組DNA為模板，引物Bik1-HYG-LBCK/Bik1-HYG-LB-R擴增左端LB1 1830 bp;Foc4基因組DNA為模板，引物Bik1- HYG-RB-F/Bik1-HYG-RBCK擴增右端RB 2133 bp。第2輪PCR擴增2個重組DNA片段：左端（5上游）重組DNA片段擴增（LB2+HY）：Bik1-HYG- LB-F/HYG-R1為引物，Bik1-LB1+HYG-1.4kb為模板，擴增產(chǎn)物大小2713 bp;右端（3下游）重組DNA片段擴增（YG+RB2）：HYG-F1/Bik1- HYG-RB-R為引物，HYG-1.4kb+Bik1-RB1為模板，擴增產(chǎn)物2386 bp。將5上游重組DNA和3下游重組DNA等體積混合后按照上述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用CTAB方法提取真菌的基因組DNA。配制20?μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：94℃，5 min;95℃，40 s;58℃，45 s;72℃，2 min;72℃，5 min;16℃，5 min，35個循環(huán)擴增驗證敲除體中的目標(biāo)片段，其中引物Outside-F/Outside-R檢測靶標(biāo)基因是否敲除;而引物Inside-F/Inside-R對敲除體內(nèi)源基因進(jìn)行檢測（表1）。

1.2.5? 突變體生長特性分析? （1）生長形態(tài)和生長速率測定。挑選3個培養(yǎng)3～5?d的突變體和Foc4野生株，分別取5?mm菌餅接種到無抗性的PDA平板上，28℃培養(yǎng)，并分別在培養(yǎng)1、3、5、7 d測量菌落直徑并拍表型圖，每次設(shè)置3個重復(fù)。第7天觀察結(jié)束后從PDA平板上取少量菌絲，制成載玻片進(jìn)行顯微觀察形態(tài)。（2）孢子形態(tài)和產(chǎn)孢量分析。取突變體和Foc4野生株的5 mm新鮮菌餅分別加入到無抗性PDB液體培養(yǎng)基中，28℃搖培7?d，觀察菌液顏色;同時，三層濾紙過濾后借助血球計數(shù)板在顯微鏡觀察并統(tǒng)計其孢子數(shù)量。

1.2.6? 突變體致病力分析? 取突變體和Foc4野生株的5?mm新鮮菌餅分別接種到100?mL PDB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床、150?r/min搖培5?d，用三層濾紙將菌絲過濾，收集分生孢子液，用無菌水將分生孢子液濃度調(diào)節(jié)為2×10個/mL。采用盆栽傷根灌淋法測定菌株致病性。其中突變體和野生株分別處理15株香蕉苗，每株苗澆灌15?mL孢子液，以無菌水作為空白對照，3次重復(fù)，60?d后縱向切開香蕉苗球莖，觀察球莖褐變程度，參考MOHAMED等的病情調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)，記錄每株苗的發(fā)病等級并對病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.7? CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系? 借鑒水稻惡苗病菌（）的基因編輯載體pUC-fFuCas9-HTB-hph（Addgene， #121092），探索采用5SrRNA啟動子和HTB核定位信號的質(zhì)粒編輯載體，嘗試構(gòu)建以為靶標(biāo)基因的基因編輯技術(shù)。

sgRNA序列的設(shè)計以及編輯載體構(gòu)建。人工合成263 nt的Ff5SrRNA-Bik1 sgRNA全基因序列，并以此為模板擴增后續(xù)的sgRNA序列后同源重組進(jìn)入基因編輯質(zhì)粒。guide RNA由Eukaryotic Pathogen CRISPR guide RNA/DNA Design Tool網(wǎng)站設(shè)計，綜合分析后確定gRNA的序列，F(xiàn)oc4Bik1-gRNA162：AGAGAGAAAATCGATTCC CGagg。以人工合成的序列為模板，分別用引物對5SrRNA-U-F-EcoRI/BIK1-sgRNA162-R、BIK1- sgRNA162-F/5SrRNA-U-R-EcoRⅠ擴增5SrRNA- Bik1 sgRNA的上、下游兩段序列;pUC-f FuCas9- HTB-hph載體RⅠ酶切后，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit重組克隆試劑盒，將5SrRNA-Bik1 sgRNA的兩端擴增序列同源重組導(dǎo)入質(zhì)粒構(gòu)建成靶向Foc4Bik1的pUC-fFuCas9- HTB-hph-Foc4Bik1基因編輯載體，該載體采用體內(nèi)表達(dá)的Cas9和sgRNA。

同源重組修復(fù)供體質(zhì)粒pUC19-Foc4Bik1- HDR的構(gòu)建。pUC19-BIK1-LB-F/pUC19-BIK1- LB-R、pUC19-BIK1-RB-F/pUC19-BIK1-RB-R分別擴增基因的上游1419 bp同源序列、下游1315?bp同源序列，同源重組導(dǎo)入pUC19構(gòu)成供體質(zhì)粒pUC19-Foc4Bik1-HDR作為同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR）的HDR模板。

基因編輯操作方法。分別取5?μg構(gòu)建的pUC- fFuCas9-HTB-hph-Bik1、pUC1-Bik1-HDR質(zhì)粒原生質(zhì)體共轉(zhuǎn)化后篩選陽性轉(zhuǎn)化子，篩選方法與基因敲除陽性轉(zhuǎn)化子篩選方法一致。

結(jié)果與分析

?進(jìn)化樹分析

基因（FOIG_14908）CDS全長6111?bp，編碼一個由2036個氨基酸組成的氨基酸多功能酶，包含多個保守結(jié)構(gòu)功能域：初始單位?；D(zhuǎn)移酶功能域[starter unit： acyl-carrier protein （ACP） transacylase， SAT]，β-酮脂酰合成酶功能域（β-ketoacyl synthase， KS），丙二酰?；D(zhuǎn)移酶功能域（acyltransferase， AT），脫氫酶（dehydratase， DH）以及硫酯酶（thioesterase， TE）（圖1A）。

經(jīng)BLAST分析、Clustal X比對，F(xiàn)oc4Bik1與水稻惡苗病菌（）的BIK1蛋白（AJ278141）、尖孢鐮刀菌棉花?；虵ov的BIK1（FOTG_08225）蛋白序列高度同源，具有高度保守的功能域結(jié)構(gòu)，同源性達(dá)到99%以上（圖1B）。

2.2? 基因敲除及檢測

采用Split-marker重組技術(shù)原理，進(jìn)行二輪PCR擴增重組DNA片段，左端（5上游）重組DNA片段（LB2+HY）擴增（LB2+HY）2713 bp;右端（3下游）重組DNA片段（YG+RB2）擴增2386?bp（圖2A）。將5上游重組DNA和3下游重組DNA等體積混合后按照上述原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)過潮霉素抗性篩選和再生培養(yǎng)，獲得敲除轉(zhuǎn)化子。分別提取Foc4野生型菌株基因組DNA和敲除轉(zhuǎn)化子基因組DNA，并以此為模版，分別用Outside、Inside和HYG引物進(jìn)行PCR擴增，鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。結(jié)果顯示，Outside引物對從Foc4中擴增到6832?bp，而敲除突變體中擴增到1800?bp;Inside引物對僅從Foc4中擴增到746 bp，而敲除突變體中無擴增條帶;HYG檢測顯示僅敲除突變體中擴增到1376 bp條帶，F(xiàn)oc4中無擴增條帶，這些結(jié)果表明，這3個轉(zhuǎn)化子中的基因已成功敲除（圖2B）。

2.3? 生長特性和產(chǎn)孢量分析

將Foc4和分別接種于PDA培養(yǎng)基上，每天測量菌落直徑大小，生長速度略慢于野生株Foc4，其菌落直徑為4.18?cm，野生株Foc4菌落直徑5.65 cm，但是二者差異不顯著（圖3A，圖3D）。顯微觀察結(jié)果顯示，與野生株對比，菌絲生長和菌絲頂端形態(tài)無明顯差異，菌絲生長正常（圖3A，圖3B）。產(chǎn)孢量統(tǒng)計顯示，產(chǎn)孢量為（5.1± 0.16）×10個/mL，野生株Foc4產(chǎn)孢量為（8.1± 0.3）×10個/mL，產(chǎn)孢量明顯降低但是差異不明顯（圖3C，圖3E）。分生孢子形態(tài)和大小發(fā)生改變，野生菌株Foc4小型分生孢子卵圓形或腎型，無色，單胞或雙胞，而分生孢子長度不變，稍微變寬，卵圓形或近球形（圖3C）。分生孢子平均大小為（7.88± 1.96）μm × （3.32 ± 0.78）μm，F(xiàn)oc4分生孢子平均大小為（7.56±1.93）μm × （2.84±0.36）μm（圖3F）。

2.4? 搖培表型分析

取突變體和Foc4野生株的5?mm新鮮菌餅分別加入到無抗性PDB、PSB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床搖培7 d，觀察菌液顏色;同時，觀察三層濾紙過濾后的濾液分生孢子顏色。結(jié)果顯示，在PDB（pH 4.0）液體培養(yǎng)基中，F(xiàn)oc4野生株搖培3?d后的菌液顏色為紅色，而突變體搖培3?d后的菌液顏色為白色，差異明顯（圖4A）。結(jié)果說明，在Foc4中基因負(fù)責(zé)紅色次生代謝產(chǎn)物比卡菌素的生物合成，與水稻惡苗病菌（）的研究結(jié)果一致。

RODRíGUEZ-ORTIZ等的研究表明，在高氮培養(yǎng)基（ICI medium）中加入蔗糖能顯著提高水稻惡苗病菌（）中比卡菌素的生物產(chǎn)量。因此，將PDB培養(yǎng)基中的葡萄糖用蔗糖替代的PSB培養(yǎng)基搖培，觀察蔗糖是否能夠顯著提高Foc4中比卡菌素的生物產(chǎn)量。PSB（pH 4.0）液體培養(yǎng)基中，突變體搖培顏色偏淡粉色，與Foc4野生株搖培3 d后的顏色差異不明顯（圖4B）。研究結(jié)果證實PDB培養(yǎng)基中的紅色表型比PSB的更加明顯，推測產(chǎn)生差異的原因可能是由于菌株差異以及培養(yǎng)基組分差異。

2.5? 致病力分析

將Foc4野生型菌株和突變體菌株的菌絲分別接種‘巴西蕉’幼苗。30?d后觀察香蕉苗外部癥狀和內(nèi)部癥狀。以HO作為空白對照的‘巴西蕉’苗葉片嫩綠，葉片未出現(xiàn)癥狀，球莖無褐化現(xiàn)象。接種野生株Foc4的‘巴西蕉’苗下部葉片出現(xiàn)黃化枯萎現(xiàn)象，植株下部葉片褪綠變黃，并且縱向切開球莖后球莖褐化明顯，出現(xiàn)典型的壞死斑;而接種突變株的‘巴西蕉’苗均與接種野生株的癥狀相似，葉片黃化現(xiàn)象，球莖褐化明顯（圖5A）。病情指數(shù)統(tǒng)計顯示，接種突變株平均病情指數(shù)（54.17）與Foc4接種的平均病情指數(shù)（57.08）并無顯著差異（圖5B），結(jié)果證實基因敲除后對致病力并無明顯影響，基因并不參與調(diào)控病原菌的致病力。

? Foc4Bik1為靶標(biāo)評估基因編輯可行性

采用Pol III型啟動子5S rRNA啟動sgRNA體內(nèi)表達(dá)，選用HTB作為核定位信號，以水稻惡苗病菌（）的基因編輯載體pUC- fFuCas9-HTB-hph（Addgene， #121092）構(gòu)建以為靶標(biāo)基因的CRISPR/Cas9基因編輯體系，編輯載體見圖6A。在線軟件Eukaryotic Pathogen CRISPR guide RNA/DNA Design Tool（http：//grna.ctegd.uga.edu/）設(shè)計gRNA序列- gRNA162： AGAGAGAAAATCGATTCCCG agg，gRNA在基因上的作用位點以及供體質(zhì)粒pUC19-Foc4Bik1-HDR見圖6B，構(gòu)建好的編輯載體pUC-fFuCas9-HTB-hph-Foc4Bik1與供體質(zhì)粒pUC19-Foc4Bik1-HDR共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。

CRISPR/Cas9基因編輯載體pUC-fFuCas9- HTB-hph-Foc4Bik1與供體質(zhì)粒pUC19-Foc4Bik1- HDR共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，獲得基因編輯后的（HDR）敲除轉(zhuǎn)化子，在PDB（pH 4.0）液體培養(yǎng)基搖培3 d后，基因編輯轉(zhuǎn)化子菌液顏色為白色，差異明顯（圖6C）。分別提取Foc4野生型菌株基因組DNA和（HDR）基因編輯敲除轉(zhuǎn)化子基因組DNA，分別進(jìn)行PCR檢測以鑒定陽性基因編輯敲除轉(zhuǎn)化子。結(jié)果顯示，

Outside引物對從Foc4中擴增到6832?bp，而（HDR）基因編輯敲除轉(zhuǎn)化子中擴增到450 bp;Inside引物對僅從Foc4中擴增到746 bp，而（HDR）基因編輯敲除轉(zhuǎn)化子中無擴增條帶;此外，以及基因也僅從（HDR）基因編輯敲除轉(zhuǎn)化子中擴增獲得。這些結(jié)果表明，基因編輯后成功敲除了轉(zhuǎn)化子（HDR）中的內(nèi)源報告基因（圖6D）。

討論

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)借助特異性DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks， DSBs）激活細(xì)胞天然的修復(fù)機制，包括同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR）和非同源末端連接（non-homologous DNA end joining， NHEJ）2條途徑。同源重組是將外源基因靶向?qū)胧荏w細(xì)胞染色體上的方法，借助在該位點有與導(dǎo)入基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換原基因片段。這是一種具有相對高保真度的修復(fù)過程。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在代謝工程以及分子遺傳育種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。鐮刀菌中水稻惡苗病菌（）以及尖孢鐮刀菌棉花?；停?f. sp. ）都有基因編輯的相關(guān)報道，目前，F(xiàn)oc4尚無基因編輯技術(shù)的報道，因此，鑒定并篩選表型容易分辨的內(nèi)源報告基因評估基因編輯技術(shù)在枯萎菌上應(yīng)用的可行性具有重要意義。

報告基因（reporter gene）是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，非常容易鑒定其表達(dá)產(chǎn)物。報告基因的種類很多，根據(jù)報告基因的來源及分析方法的不同，可將其分為外源報告基因和內(nèi)源報告基因。植物中最常用的外源報告基因如β-葡糖醛酸酶（GUS）報告基因，綠色熒光蛋白（GFP）基因、螢火蟲熒光素酶（luciferase）基因等;內(nèi)源報告基因是自身編碼的基因，植物中應(yīng)用最廣泛的是八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase， PDS），基因沉默會出現(xiàn)典型的白化表型。目前，香蕉枯萎菌應(yīng)用最廣泛的是GFP外源報告基因。熒光蛋白GFP標(biāo)記枯萎菌后有利于觀察枯萎菌侵染、定殖過程、評估不同生理小種之間的毒力差異以及不同香蕉品種中的抗性差異，目前尚無香蕉枯萎病菌內(nèi)源報告基因的相關(guān)報道。

本文鑒定的基因可以作為內(nèi)源報告基因探索和評估基因編輯在Foc4上的可行性。基因符合作為內(nèi)源報告基因的幾大特征條件：（1）表型容易分辨。突變株搖培后的菌液顏色呈白色，與野生株的紅色菌液顏色差異明顯。（2）突變體不影響病原菌的其他生理表型和致病力，僅影響代謝產(chǎn)物中比卡菌素的生物合成。（3）其表達(dá)產(chǎn)物能夠定量測定。負(fù)責(zé)比卡菌素（bikaverin）的生物合成，含量可以量化測定。（4）表達(dá)可調(diào)控。的表達(dá)可以受培養(yǎng)基和外界因素的調(diào)控表達(dá)，比卡菌素的合成主要受4個方面的影響：AreA的正調(diào)節(jié)、PacC的抑制、時間的調(diào)節(jié)和內(nèi)部基因的相互調(diào)節(jié)?；虼刂腥魏我粋€相關(guān)基因突變，其他基因的表達(dá)均有明顯的下降。此外，比卡菌素產(chǎn)量還受培養(yǎng)條件的調(diào)控。研究表明，培養(yǎng)基中的N源缺乏以及高C/N比有利于比卡菌素的生物合成。蔗糖顯著提高比卡菌素的生物產(chǎn)量。培養(yǎng)基中添加鈣提高其產(chǎn)量，而添加磷酸鹽和硫酸鹽負(fù)調(diào)控產(chǎn)量，培養(yǎng)過程中的通氣量以及水分活度（water activity， a）也影響比卡菌素生物產(chǎn)量。

絲狀真菌的基因編輯有2種主要的操作方式，一種方式是基于質(zhì)粒的體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)，質(zhì)粒上攜帶Cas9和sgRNA表達(dá)系統(tǒng)。sgRNA由Pol II型啟動子，比如U6等啟動表達(dá);而Cas9由真菌組成型啟動子表達(dá)。另外一種是體外表達(dá)Cas9，與體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA結(jié)合形成RNP核糖核蛋白復(fù)合體后轉(zhuǎn)化。Cas9單獨轉(zhuǎn)化到Foc4后并不影響其致病力（結(jié)果未顯示），與稻瘟菌的結(jié)果不一致，為后續(xù)采用質(zhì)粒型編輯載體提供了前期保證。此外，同源重組修復(fù)是將外源基因靶向?qū)胧荏w細(xì)胞染色體上的方法，本文構(gòu)建的CRISPR/ Cas9基因組編輯技術(shù)依賴同源重組修復(fù)完成靶標(biāo)基因敲除，需要外源供體DNA模板導(dǎo)入，借助在該位點有與導(dǎo)入基因同源的序列，通過單一或雙交換，供體DNA序列可替換原基因片段。這是一種具有相對高保真度的修復(fù)過程。因此，本文采用質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)的方式探索Foc4基因編輯的可行性。以為靶標(biāo)基因，在線網(wǎng)站設(shè)計gRNA構(gòu)建pUC-fFuCas9-HTB-hph-Foc4Bik1后，與供體質(zhì)粒pUC19-Bik1-HDR一起導(dǎo)入到原生質(zhì)體，潮霉素篩選的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過表型分析和PCR鑒定。陽性轉(zhuǎn)化子PDB搖培后的菌液呈白色，與野生型Foc4差異明顯;DNA測序結(jié)果也證實通過基因編輯的方式敲除了基因，結(jié)果說明了Foc4中基因編輯的可行性，可以通過顏色差異直接篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

綜上，基因編碼聚酮合酶在代謝產(chǎn)物比卡菌素的生物形成中發(fā)揮重要作用，敲除突變體菌液顏色發(fā)生改變外，不影響病原菌的生長發(fā)育、產(chǎn)孢及致病力，是Foc4良好的內(nèi)源報告基因。以為靶標(biāo)基因，初步構(gòu)建了Foc4的基因編輯技術(shù)，后續(xù)將繼續(xù)優(yōu)化Cas9序列，NLS核定位信號，完善香蕉枯萎病的基因編輯技術(shù)，為病原菌的功能基因組學(xué)提供有力的技術(shù)支撐。

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