不同生長(zhǎng)年份桑黃中活性成分動(dòng)態(tài)分析

宋吉玲，郭莎莎，孫朝國(guó)，舒玉婷，方晨依，李福森，王晶*

（1.長(zhǎng)春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130032；2.中科微針（北京）科技有限公司，北京 102629）

桑黃（Phellinus igniarius）別名桑耳、桑上寄生等，是一種珍貴的大型多年生食藥用真菌，主要生長(zhǎng)于桑樹(shù)、楊樹(shù)、山楂樹(shù)等樹(shù)干或樹(shù)樁上，在我國(guó)的云南、四川、遼寧、吉林、黑龍江等地分布較為廣泛[1-2]。傳統(tǒng)中醫(yī)中桑黃一般以子實(shí)體入藥，其味微苦，性寒，具有活血、化飲、利五臟、排毒等功能，常用于治療血崩、經(jīng)閉、脫肛止血、脾虛泄瀉等癥[3]。桑黃中含有多種活性成分，其中黃酮、多糖、三萜和酚類(lèi)物質(zhì)為主要有效成分[4-6]，而吡喃酮類(lèi)化合物是桑黃中發(fā)現(xiàn)的新骨架化合物。研究表明，桑黃具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抑菌、消炎、保肝護(hù)肝等多種活性作用[7-8]。

由于受生理狀態(tài)的特殊性、復(fù)雜性以及外部環(huán)境的制約，自然界中野生桑黃稀少，且大量開(kāi)采野生桑黃，易導(dǎo)致野生資源急劇下降。近年來(lái)，人工栽培桑黃的產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，許多地區(qū)都在發(fā)展桑黃栽培產(chǎn)業(yè)，但所產(chǎn)桑黃的品質(zhì)卻參差不齊。液體深層發(fā)酵技術(shù)具有無(wú)菌、生產(chǎn)條件可控、短時(shí)間內(nèi)可獲得大量細(xì)胞產(chǎn)物和代謝物，以及可自動(dòng)化控制、規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。然而，深層發(fā)酵的桑黃菌絲體以及人工栽培的桑黃子實(shí)體的質(zhì)量和化學(xué)成分與野生桑黃子實(shí)體存在一定差異，且不同年份人工栽培的桑黃有效活性成分也有較大差異，不同品質(zhì)的桑黃大量充斥著原材料市場(chǎng)，難以保障所產(chǎn)桑黃的品質(zhì)。因此，對(duì)不同條件培養(yǎng)的桑黃進(jìn)行質(zhì)量控制十分必要。通過(guò)桑黃質(zhì)量控制，能夠保證桑黃質(zhì)量，為桑黃的深入研發(fā)提供基本保障[9-10]。藥效物質(zhì)是保障藥品質(zhì)量的前提，因此對(duì)于桑黃中有效成分的研究具有重要意義。目前，我國(guó)對(duì)于桑黃有效成分的研究主要集中在多糖類(lèi)化合物及藥理活性等方面。而對(duì)于桑黃菌絲體、人工種植桑黃以及野生桑黃中的活性成分對(duì)比分析的研究較少。高效液相色譜法廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分析和分離[11-13]，可以實(shí)現(xiàn)分析比對(duì)不同年份桑黃活性成分的種類(lèi)以及含量的差異。

本文以同一桑黃菌種的菌絲體、一年生、兩年生、三年生、四年生子實(shí)體及野生桑黃子實(shí)體為研究對(duì)象，對(duì)不同桑黃提取物中主要活性成分的種類(lèi)及含量進(jìn)行分析及對(duì)比，并應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectroscopy，LC-MS） 技術(shù)進(jìn)一步分析并初步鑒定桑黃提取物中的主要化學(xué)成分，為桑黃藥效物質(zhì)的研究及藥品質(zhì)量控制提供一定理論基礎(chǔ)和支持[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃菌種（菌絲體、一年生桑黃子實(shí)體、兩年生桑黃子實(shí)體、三年生桑黃子實(shí)體、四年生桑黃子實(shí)體）：長(zhǎng)春師范大學(xué)應(yīng)用生態(tài)學(xué)研究所食藥用菌栽培基地；野生桑黃子實(shí)體（五年生）：吉林延邊華廈有限公司。

葡萄糖：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、福林酚：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、濃硫酸、苯酚、冰醋酸、碳酸鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：北京精細(xì)化學(xué)品有限公司；甲醇、醋酸（均為色譜純）：加拿大Caledon Laboratories公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LCQ-FLEET液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備二極管陣列檢測(cè)器）：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；YoungLin Istrument超純水儀：韓國(guó)Younglin Istrument公司；FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KH-250 DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)Heidolph公司；Flex Station 3型多功能讀板器：美國(guó)Molecular Devices公司；FA1204A電子分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；HWY-2102C水平搖床：鄭州宏郎儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

桑黃菌絲體制備（PDA培養(yǎng)基）：200 g土豆去皮后置于燒杯中，加1 000 mL超純水加熱并過(guò)濾，液體中加入20 g葡萄糖、5 g蛋白胨制備培養(yǎng)基，滅菌。將桑黃菌種活化后接種到滅菌的培養(yǎng)基中，在溫度27℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下，恒溫?fù)u床培養(yǎng)15 d，制得桑黃菌絲球。過(guò)濾并用超純水洗滌3次，放入45℃烘箱中烘干，稱(chēng)取干重。將人工栽培及野生桑黃子實(shí)體進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩，密封保存。

1.3.2 桑黃中有效成分的提取方法

桑黃中總多糖的提取：分別稱(chēng)取6種桑黃樣品1 g（準(zhǔn)確至 0.001 g），按料液比 1 ∶30（g/mL）加入超純水，溫度45℃，超聲輔助提取1 h，抽濾，濾液加入無(wú)水乙醇醇沉，封閉隔夜，過(guò)濾，濾液減壓回收至無(wú)醇味，濃縮液用水定容至2 mL，濃度為500 mg/mL，放入4℃冰箱保存，待用。

桑黃中總多酚的提?。禾崛】偠嗵呛笫Ｓ嗟?種桑黃樣品粉末殘?jiān)?，繼續(xù)加入30 mL甲醇，溫度55℃，超聲輔助提取1 h，抽濾，濾液減壓回收至干，用甲醇定容至2 mL，得到桑黃醇提物，放入4℃冰箱中保存，待用。桑黃樣品在進(jìn)行LC-MS檢測(cè)前，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.3 桑黃中成分含量的測(cè)定方法

總多糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法測(cè)定桑黃中總多糖。分別取 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 的0.10 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支離心管中，加入超純水至0.10 mL，繼續(xù)加入0.10 mL 5%苯酚、0.50 mL濃H2SO4，振蕩搖勻，靜置 10 min，取 200 μL 溶液于 96 孔板中，30℃下放置20 min，于490 nm測(cè)吸光度A，平行測(cè)定3次。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。于490 nm處測(cè)定樣品溶液吸光度，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出反應(yīng)體系中的葡萄糖濃度?？偠嗵呛?%=樣品中多糖濃度/樣品粗提物濃度×100。

總多酚含量測(cè)定：總多酚含量采用福林酚法。準(zhǔn)確稱(chēng)量焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品1 mg置于10 mL離心管中，加蒸餾水定容至刻度線，制成濃度為0.10 mg/mL的焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)記為母液。分別取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL的 0.10 mg/mL母液于 6支離心管中，補(bǔ)超純水至0.10 mL，依次加入0.50 mL 10%的福林酚混勻后再加入1.40 mL 10%Na2CO3，振蕩搖勻，取200 μL溶液于96孔板中，避光25℃下放置30 min，于760nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度A，平行測(cè)定3次。以焦性沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。總多酚含量/%=樣品中多酚濃度/樣品粗提物濃度×100。1.3.4 LC-MS測(cè)定條件

液相色譜分析條件：流動(dòng)相為色譜甲醇（A）和0.2%醋酸水溶液（B）；色譜柱為T(mén)hermo U3000 C18（250 mm×4.6 mm）；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL。程序梯度：0 min，20%A+80%B；10 min，30%A+70%B；40 min，45%A+55%B；60 min，50%A+50%B；90 min，60%A+40%B。

利用LC-MS技術(shù)分析桑黃提取物中的有效成分，在負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描。鞘氣40 bar；輔助氣10 bar；毛細(xì)管溫度350℃；毛細(xì)管電壓35 kV；透鏡電壓110 V。二極管陣列檢測(cè)器（photo-diode array，PDA）檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用Origin 8軟件和Chewdraw分別進(jìn)行繪圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)式繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同桑黃中總多糖、總多酚含量評(píng)價(jià)

以葡萄糖（mg/mL）濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：y=2.707 3x-0.002 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，線性范圍0～0.1 mg/mL；以焦性沒(méi)食子酸（mg/mL）濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到回歸方程y=5.95x-0.002 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，線性范圍0～0.1 mg/mL。以上結(jié)果說(shuō)明在不同濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度存在良好的線性關(guān)系，可用于桑黃中總多糖、總多酚類(lèi)化合物的定量分析。

本研究應(yīng)用多功能讀板器進(jìn)行桑黃提取物中總多糖、總多酚含量測(cè)定，該方法的主要優(yōu)點(diǎn)包括樣品用量少、高通量檢測(cè)、速度快、準(zhǔn)確度高等[15]。為保證不同桑黃提取物中在進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)的吸光度（A）能夠處于合理的范圍內(nèi)（0.2～0.8），需要對(duì)提取物溶液濃度調(diào)整，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，選擇桑黃總多糖提取物的濃度范圍為2.0 mg/mL～10.0 mg/mL，總多酚測(cè)定樣品濃度范圍5.0 mg/mL～25.0 mg/mL。將桑黃不同提取物按照上述濃度范圍進(jìn)行稀釋?zhuān)捎帽椒?硫酸法、福林酚法對(duì)不同桑黃提取物中的總多糖、總多酚進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 6種不同桑黃中總多糖、總多酚含量Table 1 Content of polysaccharides and polyphenols in six kinds of Phellinus igniarius

如表1所示，對(duì)比研究6種不同桑黃樣品中總多糖、總多酚含量，發(fā)現(xiàn)不同年份桑黃中有效成分含量存在較大差異。不同桑黃總多糖含量對(duì)比中，不同年份人工栽培的桑黃子實(shí)體和液體發(fā)酵培養(yǎng)的桑黃菌絲體中總多糖含量高于野生桑黃子實(shí)體含量，桑黃子實(shí)體（一年生）總多糖含量最高，達(dá)到0.754 1%，其次為桑黃（兩年生）總多糖含量（0.703 7%），其他樣品總多糖含量有所減少。野生桑黃子實(shí)體總多糖含量最低，為0.329 8%。可能是由于野生桑黃在自然環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)地獲取有限，比人工管理環(huán)境中獲得養(yǎng)分更艱難。此外，桑黃是多年生真菌，而該野生桑黃約五年生，與人工栽培桑黃生長(zhǎng)年份相差不明顯，因此其中總多糖含量偏低。對(duì)于液態(tài)發(fā)酵的桑黃菌絲體，不同碳源、氮源、時(shí)間、溫度等因素都會(huì)對(duì)總多糖含量產(chǎn)生影響，但菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，總多糖含量相對(duì)較高。

如表1所示，野生桑黃子實(shí)體總多酚含量最高，為0.255 2%，而桑黃液體發(fā)酵菌絲體總多酚含量最少，為0.030 8%，其余桑黃中總多酚含量相差不明顯，為0.156 6%、0.167 4%、0.175 3%和0.180 2%。多酚類(lèi)包含化合物種類(lèi)較多，如黃酮類(lèi)、吡喃酮類(lèi)等，皆屬于次生代謝產(chǎn)物，可能隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，該類(lèi)代謝產(chǎn)物會(huì)逐漸累積，而深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)時(shí)間短，所以總多酚類(lèi)含量較低。

通過(guò)對(duì)不同桑黃子實(shí)體提取物中總多酚含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一年生到四年生的桑黃子實(shí)體中總多酚含量相差不明顯。一年生到三年生桑黃子實(shí)體中總多酚含量存在逐年降低趨勢(shì)，四年生桑黃子實(shí)體中總多酚含量相對(duì)較高，可能原因是栽培條件對(duì)桑黃中總多酚等次級(jí)代謝產(chǎn)物含量影響較小。由表1分析可知，四年生桑黃子實(shí)體中總多酚含量較高，而總多糖含量較低，分析可能是在四年時(shí)桑黃處于初級(jí)代謝產(chǎn)物向次級(jí)代謝產(chǎn)物過(guò)渡時(shí)期。而野生桑黃子實(shí)體中總多酚含量最高，推測(cè)桑黃作為一種多年生真菌，當(dāng)達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期后，其子實(shí)體中次生代謝產(chǎn)物的含量會(huì)隨著生長(zhǎng)年份的增長(zhǎng)而累積。

2.2 桑黃醇提物中活性成分分析與比較

由于不同桑黃提取物中總多酚類(lèi)化合物的含量有明顯的變化，同時(shí)為了考察人工栽培桑黃與野生桑黃中主要活性成分是否存在較大差異，采用LS-MS對(duì)不同桑黃醇提物進(jìn)行分離并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同年份桑黃序列液相色譜圖Fig.1 Sequence liquid phase diagram of different years

如圖1所示，不同桑黃提取物中主要化學(xué)成分均能得到較好分離，但桑黃菌絲體色譜圖較其它桑黃樣品差異較大，樣品中色譜峰數(shù)量較少，可能與其多酚類(lèi)化合物含量較低有關(guān)。對(duì)比不同桑黃提取物的色譜圖，選擇分離較好的6種化合物作為目標(biāo)成分進(jìn)行分析。不同桑黃樣品中，6種目標(biāo)化合物的峰高（峰面積）存在明顯差異，說(shuō)明提取物中主要成分的含量變化較大。野生桑黃子實(shí)體提取物的色譜圖與4種不同年份人工栽培桑黃子實(shí)體色譜圖對(duì)比發(fā)現(xiàn)，6種目標(biāo)化合物的保留時(shí)間基本一致。結(jié)果表明，不同桑黃提取物中大部分峰為共有峰，這說(shuō)明人工栽培桑黃與野生桑黃提取物中含有主要化學(xué)成分的種類(lèi)較為相似。由圖1可知，野生桑黃提取物中目標(biāo)化合物色譜峰明顯，分布均勻，而人工種植桑黃子實(shí)體中有效成分與其相比，目標(biāo)化合物的出峰情況有明顯變化。對(duì)比不同桑黃色譜圖，發(fā)現(xiàn)其主要活性成分的含量存在差異，例如化合物1隨著種植年限的增加含量也逐漸增大，四年生桑黃子實(shí)中其含量與野生桑黃含量基本一致，推測(cè)四年為目標(biāo)化合物1在桑黃中含量積累最佳時(shí)間。但它的含量是否會(huì)隨著時(shí)間繼續(xù)增加，有待進(jìn)一步分析。在一年生桑黃中目標(biāo)化合物4和5的含量高于其他年份種植桑黃，甚至高于野生桑黃，但其在二年生桑黃和三年生桑黃中含量明顯減少，推測(cè)該化合物在短時(shí)間內(nèi)累積較快，但達(dá)到一定量后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，可能向其他成分發(fā)生轉(zhuǎn)變。

為了進(jìn)一步分析桑黃醇提物中的活性成分，利用LC-MS技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)化合物的快速結(jié)構(gòu)鑒定，通過(guò)與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)比[16-19]，根據(jù)化合物的色譜數(shù)據(jù)以及分子量、碎片離子等質(zhì)譜信息（見(jiàn)表2），初步對(duì)桑黃醇提物中6種主要化合物進(jìn)行了定性分析，可能結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

表2 桑黃醇提物的LC-MS數(shù)據(jù)Table 2 LC-EIS-MS data of alcohol extract from Phellinus igniarius

圖2 6種化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula of 6 compounds

3 結(jié)論

近年來(lái)，由于野生桑黃的大量開(kāi)采，導(dǎo)致其數(shù)量急劇下降甚至成為稀缺產(chǎn)品。而一些品質(zhì)不好的人工種植桑黃產(chǎn)品在市場(chǎng)中普遍存在，無(wú)法保證桑黃的藥效性。本試驗(yàn)采用液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)桑黃菌絲體，并選取基地同一菌種（一年生桑黃子實(shí)體、二年生桑黃子實(shí)體、三年生桑黃子實(shí)體、四年生桑黃子實(shí)體）進(jìn)行培養(yǎng)，評(píng)價(jià)其中總多糖、總多酚含量，并與野生桑黃中的活性成分含量進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)進(jìn)一步利用LCMS分析了桑黃醇提物中6種目標(biāo)化合物的差別。結(jié)果表明，如果做好人工桑黃的種植管理，桑黃總多糖含量并不一定會(huì)低于野生桑黃，有的甚至更優(yōu)；根據(jù)桑黃中總多酚含量結(jié)果，推測(cè)隨著年份的生長(zhǎng)有利于總多酚含量的累積。LC-MS結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)年份桑黃提取物中大部分峰為共有峰，而人工栽培桑黃與野生桑黃提取物中的主要化學(xué)成分的種類(lèi)較為相似，并且人工栽培桑黃中個(gè)別成分高于野生桑黃。因此，對(duì)于野生桑黃資源稀缺的現(xiàn)狀，人工栽培桑黃可能會(huì)彌補(bǔ)該缺口。該研究為人工栽培桑黃的質(zhì)量控制以及相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供一定支持。