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    川續(xù)斷皂苷乙對(duì)氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)影響

    2022-03-24 13:35:02李思聰李金良袁定勝李旭廷
    中國獸藥雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:氟苯尼藥動(dòng)學(xué)空腸

    王 斌,李思聰,梁 歌,李金良,張 敏,袁定勝,李旭廷

    (動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川省畜牧科學(xué)研究院,成都 610066)

    氟苯尼考(Florfenicol,F(xiàn)FC)是畜禽專用的新型廣譜抗菌藥,本品通過抑制肽?;D(zhuǎn)移酶活性而產(chǎn)生廣譜抑菌作用,抗菌譜廣,包括各種革蘭氏陽性、陰性菌和支原體等[1]。本品口服吸收迅速,分布廣泛,半衰期長(zhǎng),血藥濃度高,血藥維持時(shí)間長(zhǎng),在畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病防治中應(yīng)用廣泛[2]。川續(xù)斷皂苷乙是一種重要的五環(huán)三萜齊墩果烷類皂苷化合物,具有很好的心血管保護(hù)、抗氧化、保肝、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)和抗骨質(zhì)疏松等多種生物活性[3-4],已從忍冬屬植物山銀花、灰氈毛忍冬、華南忍冬、水銀花等發(fā)現(xiàn)該化合物的存在[5-6]。課題組開展了芍藥苷、白頭翁皂苷、甘草、黃芩苷等中獸藥制劑及單體成分對(duì)氟苯尼考代謝的影響研究[7-9],本文開展川續(xù)斷皂苷乙在大鼠體內(nèi)對(duì)氟苯尼考代謝的影響研究,進(jìn)一步在基因和蛋白水平進(jìn)行確證,探討可能發(fā)生的藥動(dòng)學(xué)相互作用及其機(jī)制,從藥物代謝酶角度為川續(xù)斷皂苷乙的配伍規(guī)律提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為推動(dòng)中西結(jié)合藥動(dòng)學(xué)發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD雄性大鼠,體重(200±20) g,由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(川)2013-24。整個(gè)試驗(yàn)期間,于室溫20~24 ℃下飼養(yǎng),每天供給試驗(yàn)用SD大鼠專用飼料及純化水,采血前12 h限飼。

    1.1.2 主要試驗(yàn)儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀,美國戴安公司產(chǎn)品;ZGDCY-48S水浴氮吹儀,上海梓桂儀器有限公司產(chǎn)品;CQ250超聲洗滌器,上海超聲儀器廠產(chǎn)品;800B臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;WH-3微型旋渦混合儀,上海瀘西分析儀器廠產(chǎn)品;MiniSpin Plus 個(gè)人型高速離心機(jī),德國艾本德公司產(chǎn)品;StepOne型熒光定量PCR儀,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

    1.1.3 藥品與試劑 川續(xù)斷皂苷乙(CAS Number:33289-85-9,含量99.82%),中國食品藥品檢定研究院;氟苯尼考對(duì)照品(編號(hào)K0301703,含量為99.1%),中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品;氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)130555-201704),中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;氟苯尼考原料藥(批號(hào)202012125,純度為98.9%),浙江康牧藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;甲醇、乙腈(色譜純),艾萬拓化工產(chǎn)品貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品;乙酸乙酯等其余試劑均為分析純,成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 分組及給藥方法 24只健康大鼠隨機(jī)分為2組,每組12只。試驗(yàn)組連續(xù)7 d每天灌服川續(xù)斷皂苷乙,根據(jù)《中國藥典》2015年版山銀花人的臨床劑量,計(jì)算實(shí)驗(yàn)大鼠臨床劑量約為1. 35 g/kg,根據(jù)藥典規(guī)定山銀花中川續(xù)斷皂苷乙的含量5%計(jì)算試驗(yàn)大鼠川續(xù)斷皂苷乙的用量約為60 mg/kg, 1 次/d,空白組則給予相應(yīng)體積的生理鹽水,禁食12 h后于第8天,氟苯尼考按劑量30 mg/kg(氟苯尼考原粉溶于10%PEG-400配制成1%溶液)分別灌服2個(gè)組的各6只大鼠,并于給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h斷尾采集血液約0.1 mL,EDTA抗凝,4000 r/min離心5 min,分離血漿,置-20 ℃冰箱中保存待用。兩個(gè)組剩余各6只大鼠于第8天乙醚麻醉后放血處死,分離肝臟和空腸組織用冰生理鹽水漂洗濾干后凍存。

    1.2.2 樣品的處理 精確取血漿0.1 mL于試管中,加入10 μL氯霉素內(nèi)標(biāo)液(500 μg/mL)和400 μL乙酸乙酯,渦動(dòng)混合2 min,4000 r/min離心10 min,吸取上層液于另一離心管中,然后再加入乙酸乙酯400 μL重復(fù)提取1次,合并兩次提取液。在40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)尤?00 μL流動(dòng)相溶解,渦動(dòng)混合2 min,12000 r/min離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶,取20 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

    1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿180 μL,加入20 μL氟苯尼考系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,按1.2.2項(xiàng)下方法處理樣品,以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對(duì)相應(yīng)氟苯尼考濃度作線性回歸,求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

    1.2.4 色譜條件 色譜柱:Agilen HC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(27∶73,V/V);流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)223 nm;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

    1.2.5 分析方法質(zhì)量控制 以血漿樣品高、中、低(0. 1、2. 5、20 μg/mL)3個(gè)濃度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度,每個(gè)樣品做5個(gè)重復(fù)。

    1.2.6 RT-PCR檢測(cè)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1 mRNA表達(dá)量 取100 mg組織用組織破碎儀進(jìn)行破碎,按照說明書用Trizol法提取組織總RNA。測(cè)定樣品OD260 nm/OD280 nm比值,確定RNA濃度和純度,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA,利用premier5.0軟件設(shè)計(jì)大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和看家基因β-actin引物序列(由上海生工生物公司合成)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)上述基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平,PCR反應(yīng)體系20 μL:cDNA 模板2 μL;上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL;SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL;ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,55~61 ℃退火15 s;72 ℃延伸20 s,共45個(gè)循環(huán);60 ℃延伸1 min。結(jié)果采用相對(duì)定量分析,用ΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

    表1 熒光定量PCR引物序列

    1.2.7 大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白表達(dá)的測(cè)定 稱取0.1 g 肝臟組織,加入1 mL組織蛋白抽提試劑,研磨后冰上孵育20 min,于10000×g 離心15 min 提取蛋白,用BCA 法測(cè)定蛋白含量。每組蛋白上樣量為50 μg,120 V 恒壓電泳90 min。采用半干電轉(zhuǎn),450 mA,100 min。用含5%脫脂奶粉和1%BSA的TBST封閉液,4 ℃封閉過夜,加入稀釋后的CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白一抗及GADPH 抗體(1∶500),4 ℃過夜,用TBST 在室溫下脫色搖床洗3 次。洗膜后加入量稀釋的二抗(1∶10000),于室溫孵育50 min,用TBST 室溫脫色搖床洗3 次,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 線性結(jié)果 以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對(duì)相應(yīng)氟苯尼考濃度作線性回歸,得出氟苯尼考在質(zhì)量濃度為0.05~50 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為y=0.0309x+0.0078,相關(guān)系數(shù)R2=0.999。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

    圖1 血漿藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2 方法回收率和精密度 測(cè)得方法回收率分別為(83.2±1.6)%、(84.1±2.3)%和(83.5±2.2)%,測(cè)得日內(nèi)RSD分別為4.6%、2.3%和6.1%,測(cè)定日間RSD分別為4.5%、2.1%和6.2%。按信噪比S/N=3計(jì)算,最低檢測(cè)限為0.02 μg/mL。

    2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠均按單劑量(30 mg/kg)給予氟苯尼考后,測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的氟苯尼考血藥濃度,其血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2所示,藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2,結(jié)果表明,試驗(yàn)組AUC(0-∞)為34.468±3.346 mg/L·h,與對(duì)照組25.764±3.967 mg/L·h相比顯著增加(P<0.05),平均駐留時(shí)間MRT0-∞為4.308±1.206 h,與對(duì)照組3.019±0.550相比顯著增加(P<0.05);半衰期T1/2為3.208±0.860 h,與對(duì)照組1.824±0.266 h相比顯著增加(P<0.05),達(dá)峰濃度(Cmax)為10.144±1.538 mg/L,與對(duì)照組7.358±1.158 mg/L相比顯著增加(P<0.05),對(duì)照組清除率CL為0.759±0.192 L/h·kg,與對(duì)照組1.190±0.199 L/h·kg相比顯著降低(P<0.05)。達(dá)峰時(shí)間Tmax和表觀分布容積(Vd),試驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異不顯著。

    圖2 試驗(yàn)組和對(duì)照組在大鼠體內(nèi)的氟苯尼考(30 mg/kg)的血藥濃度-時(shí)間曲線

    表2 試驗(yàn)組和對(duì)照組在大鼠體內(nèi)的氟苯尼考(30 mg/kg)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

    2.4 川續(xù)斷皂苷乙對(duì)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空腸CYP3A1、MDR1 的mRNA表達(dá)影響 如圖3(A)可知,試驗(yàn)組肝臟CYP1A2和CYP2C11 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比,分別降低68.8%和55.0%(P<0.05),CYP3A1和MDR1 與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。由圖3(B)可知,試驗(yàn)組空腸MDR1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比,降低43.2%(P<0.05),CYP3A1與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

    圖3 大鼠口服川續(xù)斷皂苷乙對(duì)肝臟(A)中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空腸(B)中CYP3A1、MDR1 mRNA表達(dá)的影響 (n=6)

    2.5 川續(xù)斷皂苷乙對(duì)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp和空腸CYP3A1、P-gp蛋白表達(dá)的影響 由圖4(A)和圖4(B)可知,試驗(yàn)組肝臟中CYP1A2和CYP2C11蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比分別降低38.71%和26.64%(P<0. 05),CYP3A1、P-gp差異不顯著;由圖5(A)和圖5(B)可知,空腸中P-gp表達(dá)量與對(duì)照組相比下降50.93%(P<0.05),CYP3A1也降低,但差異不顯著(P>0.05)。

    圖4 川續(xù)斷皂苷乙對(duì)肝臟中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp蛋白表達(dá)的影響 (n=6)

    圖5 大鼠口服川續(xù)斷皂苷乙對(duì)空腸中CYP3A1和P-gp蛋白表達(dá)的影響 (n=6)

    3 討 論

    藥物的相互作用(drug-drug interaction, DDI)指在一定時(shí)間內(nèi)先后服用兩種或兩種以上藥物后所產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng),其中,代謝性藥物的藥物相互作用發(fā)生率最高,約占藥代動(dòng)力學(xué)相互作用的40%,可引起療效增強(qiáng)甚至產(chǎn)生不良反應(yīng),或療效減弱甚至治療失敗[10]。本試驗(yàn)采用川續(xù)斷皂苷乙(60 mg/kg)連續(xù)大鼠灌胃7 d,給予氟苯尼考,試驗(yàn)組的聯(lián)用后Cmax值與對(duì)照組相比顯著增加(P<0.05),Tmax與對(duì)照組之間差異不顯著,表明川續(xù)斷皂苷乙增加了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的吸收程度,但對(duì)吸收速度無明顯影響。同時(shí),藥物代謝過程中也發(fā)生了相互作用,川續(xù)斷皂苷乙與氟苯尼考聯(lián)用后,MRT0-∞和T1/2與對(duì)照組相比顯著增加,CL與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05),表明川續(xù)斷皂苷乙延緩了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的代謝速度,降低了氟苯尼考的清除速率,AUC0-∞顯著增加,是由于氟苯尼考的吸收程度增加,代謝減慢共同導(dǎo)致。

    P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和細(xì)胞色素P450酶系介導(dǎo)的藥物相互作用,是中西藥聯(lián)用發(fā)生藥動(dòng)學(xué)相互作用最主要的因素,也是最常見的原因。P-糖蛋白可把其底物藥物從腸上皮細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)回腸腔,使藥物吸收減少,生物利用度降低[11]。細(xì)胞色素P450酶系受到誘導(dǎo)或抑制,會(huì)影響藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝,造成藥效學(xué)的改變[10]。川續(xù)斷皂苷乙是一種重要的五環(huán)三萜齊墩果烷類皂苷化合物,已有研究表明,類似三萜結(jié)構(gòu)的中藥單體對(duì)人和動(dòng)物的藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)酶有不同程度的影響。如薩礎(chǔ)拉等[12]采用大鼠外翻腸囊模型研究了三七皂苷有效組分中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1,發(fā)現(xiàn)其具有明顯的P-gp底物轉(zhuǎn)運(yùn)特性并可競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp底物外排。Liu R[13]等研究發(fā)現(xiàn),三七總皂苷可下調(diào)CYP1A2蛋白的表達(dá),柴胡皂苷處理后的肝細(xì)胞,能夠明顯誘導(dǎo)CYP1A2的mRNA表達(dá)和增強(qiáng)CYP1A2的活性[14],人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1可以誘導(dǎo)CYP1A1 mRNA與蛋白水平的表達(dá)[15]。本研究中發(fā)現(xiàn),川續(xù)斷皂苷乙連續(xù)大鼠灌胃7 d,可抑制空腸中MDR1的mRNA表達(dá)量和P-糖蛋白的表達(dá)量,這可能是造成氟苯尼考藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax增加,引起氟苯尼考在腸道內(nèi)的吸收程度增大的主要原因。同時(shí),肝臟中CYP1A2和CYP2C11的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)和相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平降低,可能是造成了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的代謝減慢,引起藥動(dòng)學(xué)參數(shù)MRT0-∞和T1/2增加的主要原因。

    綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙是山銀花的主要成分,綠原酸對(duì)CYP450酶活性和P-gp活性影響的研究已有報(bào)道[16-17],灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙對(duì)CYP450酶及P-gp活性影響未見研究報(bào)道。山銀花和金銀花俗稱銀花,生產(chǎn)實(shí)踐中兩者常常并用、混用,很多獸用成方制劑,如銀黃口服液、雙黃連口服液、銀翹散等,都含有銀花成分,在獸醫(yī)臨床上配合氟苯尼考等抗菌藥物治療畜禽感染性疾病,取得較好的治療效果。本試驗(yàn)開展川續(xù)斷皂苷乙對(duì)氟苯尼考代謝的影響研究,對(duì)拓展川續(xù)斷皂苷乙及山銀花在畜牧健康養(yǎng)殖中應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義。

    綜上所述,川續(xù)斷皂苷乙連續(xù)灌胃一周對(duì)氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的吸收和代謝有一定的影響,加快了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的吸收程度和減緩了代謝,提示臨床上兩者合用有潛在增效作用,但獸醫(yī)臨床兩者藥物同時(shí)使用的藥效學(xué)結(jié)果有待進(jìn)一步加以確證。氟苯尼考藥代學(xué)的改變可能與川續(xù)斷皂苷乙抑制了大鼠肝臟中CYP1A2和CYP2C11的表達(dá)以及空腸中P-gp的表達(dá)有關(guān)。本研究為川續(xù)斷皂苷乙的臨床應(yīng)用及川產(chǎn)道地藥材山銀花的進(jìn)一步開發(fā)提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

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