青光安顆粒劑對兔抗青光眼術(shù)后濾過道Beclin1和LC3B表達(dá)的影響

劉冬華　湯杰　蔣鵬飛　呂怡　苗大亨　彭俊　彭清華

〔摘要〕 目的 觀察青光安顆粒劑對抗青光眼術(shù)后濾過道組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1/微管相關(guān)蛋白輕鏈B（light chain 3B，LC3B）表達(dá)的影響。方法 將30只成功建立慢性高眼壓模型的新西蘭白兔隨機(jī)平均分為5組，除空白組（A組）外，其余各組均行常規(guī)小梁切除術(shù)，陽性對照組（B組）術(shù)中放置絲裂霉素C棉片，單純手術(shù)組（C組）僅行常規(guī)小梁切除術(shù)，青光安組（D組）術(shù)后灌胃青光安顆粒劑混懸液，陰性對照組（E組）術(shù)后灌胃蒸餾水。干預(yù)14 d后，Western blot法檢測濾過道組織Beclin1、LC3B-I、LC3B-II的表達(dá)量，RT-qPCR法檢測Beclin1及LC3B mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果 各手術(shù)組Beclin1蛋白平均表達(dá)量均顯著高于A組（P<0.05），B組Beclin1蛋白平均表達(dá)量顯著高于C組、D組與E組（P<0.05），D組Beclin1蛋白平均表達(dá)量高于C、E組（P<0.05）;各手術(shù)組LC3B-II/LC3B-I均顯著高于A組（P<0.05），B組LC3B-II/LC3B-I顯著高于C、D、E組（P<0.05），D組LC3B-II/LC3B-I高于C、E組（P<0.05）。各手術(shù)組Beclin1 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于A組（P<0.05），B組Beclin1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組與E組（P<0.05），B組Beclin1 mRNA相對表達(dá)量與D組無明顯區(qū)別（P>0.05）;各手術(shù)組LC3B mRNA相對表達(dá)量均顯著高于A組（P<0.05），B組LC3B mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組與E組（P<0.05），B組LC3B mRNA相對表達(dá)量與D組無明顯區(qū)別（P>0.05）。結(jié)論 青光安顆粒劑能通過促進(jìn)濾過道組織Beclin1蛋白及mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)瘢痕組織的自噬，維持濾過道的通暢。

〔關(guān)鍵詞〕 青光眼;青光安顆粒劑;慢性高眼壓兔模型;微管相關(guān)蛋白輕鏈B;Beclin1

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.002

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Qingguang’an Granule on the expression of autophagy-related protein Beclin1/light chain 3B （LC3B） in filtration duct tissue after anti-glaucoma surgery. Methods Thirty New Zealand white rabbits successfully established a chronic high intraocular pressure model were randomly divided into 5 groups. Except for the blank group （group A）， all other groups underwent routine trabeculectomy. The positive control group （group B） was placed mitomycin C cotton tablets during operation， the simple operation group （group C） only underwent conventional trabeculectomy， the Qingguang’an group （group D） was given Qingguang’an Granule suspension after surgery， the negative control group （group E） was given distilled water after operation. After 14 days of intervention， Western blot method was used to detect the expression levels of Beclin1， LC3B-I， and LC3B-II in filtration duct tissue， and the relative expression levels of Beclin1 and LC3B mRNA were detected by RT-qPCR. Results The average expression of Beclin1 protein in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， the average expression of Beclin1 protein in group B was significantly higher than that in group C， group D and group E （P<0.05）， and the average expression of Beclin1 protein in group D was significantly higher than that in group C and group E （P<0.05）; LC3B-II/LC3B-I in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， LC3B-II/LC3B-I in group B was higher than that in group C， group D and group E （P<0.05）， LC3B-II/LC3B-I in group D was higher than that in group C and group E （P<0.05）. The relative expression of Beclin1 mRNA in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， the relative expression of Beclin1 mRNA in group B was significantly higher than that in group C and group E （P<0.05）， the relative expression of Beclin1 mRNA in group B was not significantly different from that in group D （P>0.05）; the relative expression of LC3B mRNA in each operation group was significantly higher than that in group A （P<0.05）， and the relative expression of LC3B mRNA in group B was significantly higher than that in group C and group E （P<0.05）， the relative expression of LC3B mRNA in group B was not significantly different from group D （P>0.05）.? Conclusion Qingguang’an Granule can induce the autophagy of scar tissue by promoting the expression of Beclin1 protein and mRNA in the filtration duct tissue， and maintain the patency of the filtration duct tissue.

〔Keywords〕 glaucoma; Qingguang’an Granule; rabbit model of chronic high intraocular pressure; light chain 3B; Beclin1

青光眼是世界排名第二位的致盲性眼病，發(fā)病率僅次于白內(nèi)障，全球約1/2的盲人因青光眼所致[1]。青光眼濾過性手術(shù)（glaucoma filtration surgry， GFS）是常見的抗青光眼手術(shù)方式，有較好的降眼壓作用[2]，但術(shù)后濾過道容易瘢痕化導(dǎo)致手術(shù)失敗。青光安顆粒劑是彭清華教授歷經(jīng)多年研究所研制的中藥復(fù)方制劑，既往研究表明，青光安顆粒劑能顯著降低高眼壓模型兔GFS后濾過道瘢痕化[3-4]，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究通過構(gòu)建慢性高眼壓家兔模型，觀察青光安顆粒劑對GFS后濾過道瘢痕組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈B（light chain 3B， LC3B）表達(dá)的影響，以期能闡明青光安顆粒劑在青光眼濾過手術(shù)中抗瘢痕作用的部分機(jī)制。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級新西蘭白兔，12周齡，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號：43608300000801。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級實(shí)驗(yàn)室。

1.2? 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

青光安顆粒劑，按現(xiàn)代制備工藝制成顆粒劑，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。Tris（貨號：V900483）、APS（貨號：SAB1300902）、SDS（貨號：8.17034）、TEMED（貨號：1.10732）、Tween-20（貨號：P9416）、丙烯酰胺（貨號：A9099）、甘氨酸（貨號：G7126）、甲叉雙丙烯酰胺（貨號146072）、Beclin1（貨號：SAB1306537）、LC3B（貨號：L7543），均購自美國Sigma公司;SuperECL Plus超敏發(fā)光液（美國Thermo pierce公司，貨號：P1052-100）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：11939823001）、UltraSYBR Mixture（貨號：CW2601），均購自中國北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;核酸染料（中國北京普利萊公司，貨號：PB11141）。

1.3? 主要儀器

臺式冷凍離心機(jī)（廣東黑馬生物科技有限公司，型號：TTGL-18R）;電泳儀（美國Bio-rad公司，型號：T164-5050）;電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號：TDYCZ-24EN）;轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號：TDYCZ-40A）;眼科顯微手術(shù)器械（日本新芝公司，型號：TDY89-1）;熒光定量RCP儀（美國Thermo公司，型號：TPIKO REAL 96）;熒光PCR板（美國Thermo公司，型號：TSPL0960）;恒溫水浴箱（河南金博事業(yè)有限公司，型號：THH-S2）;手持裂隙燈（北京六一生物科技有限公司，型號：TDYCP-31DN）;接觸式眼壓筆（美國Reichert公司，型號：Tono-pen AVIA）。

2 方法

2.1? 慢性高眼壓兔模型建立[5]

前房注射2%透明質(zhì)酸鈉0.2 mL，每周1次，連續(xù)兩周以建立高眼壓模型，使用Tono-pen AVIA 接觸式眼壓筆，于早上9：00至12：00間進(jìn)行眼壓測量，眼壓連續(xù)1周高于22 mmHg（2.93 kPa）為造模成功。

2.2? 青光眼濾過手術(shù)動(dòng)物模型建立[6]

縮瞳后以2.0%戊巴比妥麻醉動(dòng)物，充分麻醉后以開瞼器撐開眼球，以鼻上方穹隆部為基底制作結(jié)膜瓣，以角膜緣為基底制作鞏膜瓣，切除小梁及周邊虹膜組織;10-0縫合線縫合鞏膜;調(diào)整鞏膜縫線直至鞏膜瓣濾過通暢。連續(xù)縫合結(jié)膜，涂典必殊眼膏（比利時(shí)愛爾康公司，規(guī)格：3.5 g，每次涂1 cm長的藥膏）。手術(shù)動(dòng)物模型的建立由同一人完成，從手術(shù)后第2天起，每日給術(shù)眼點(diǎn)典必殊滴眼液（比利時(shí)愛爾康公司，規(guī)格：5 mL，每次1滴）4次，復(fù)方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會社，規(guī)格：10 mL，每次1滴）1次。

2.3? 實(shí)驗(yàn)分組

成功建立慢性高眼壓兔模型后，剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)（3只）及死亡的兔子（2只）后，最終隨機(jī)數(shù)字表法選取30只模型兔，分為5組，其中空白組（A組）、陽性對照組（B組）、單純手術(shù)組（C組）、青光安組（D組）和陰性對照組（E組）各6只。

2.4? 動(dòng)物給藥

A組動(dòng)物不做特殊處理;B組動(dòng)物行常規(guī)小梁切除術(shù)后，術(shù)中待鞏膜瓣切好后，于鞏膜瓣與結(jié)膜瓣處置入0.4 mg/mL絲裂霉素C棉片，定時(shí)3 min后予以大量生理鹽水充分沖洗;C組動(dòng)物僅行常規(guī)小梁切除術(shù);D組動(dòng)物行常規(guī)小梁切除術(shù)，術(shù)后第1開始予以青光安顆粒劑中藥混懸液灌胃，按10 mL/kg 給藥，2次/d，連續(xù)給藥14 d;E組動(dòng)物行常規(guī)小梁切除術(shù)，術(shù)后第1天開始每日予以青光安顆粒劑同等容量的蒸餾水灌胃，2次/d，連續(xù)14 d。

2.5? 取材方法

術(shù)后第15天處死動(dòng)物，取右眼球?yàn)V過泡處角鞏膜組織約0.025 g，清洗組織，常規(guī)用冰預(yù)冷PBS，然后加入RIPA裂解液（200 μL），再將組織置于勻漿器中反復(fù)研磨，直至組織塊消失;然后經(jīng)過裂解、離心15 min（半徑為95 mm，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min），再取0.5 mL所得上清液分裝轉(zhuǎn)移，置于離心管中，部分剩余者留存?zhèn)溆?，保存?20 ℃左右，待需要時(shí)取出測定蛋白濃度。

2.6? Western blot法檢測Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)

上樣后，將已變性蛋白進(jìn)行電泳。濃縮膠電泳需要80 V電壓，分離膠電泳電壓比濃縮膠電泳高40 V。當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)可停止。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、一抗孵育（稀釋比例為1∶1000）、二抗孵育（稀釋比例為1∶6000）等步驟后，予以顯像曝光，得出最后結(jié)果。

2.7? RT-qPCR檢測Beclin1和LC3B mRNA表達(dá)

取0.02 g組織，加入1 mL Trizol用勻漿器研磨勻漿充分混勻，提取總RNA，以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。引物設(shè)計(jì)與合成：Beclin1上游5’-TGCCCTATGGAAATCACTCGT-3’，下游5’-GTCT?

CGCCCTTTTCAACCTC-3’，基因產(chǎn)物長度168? bp;LC3B上游5’-ACGTCCACCCAATCAGTCC-3’，下游5’-TTACTGGCGACTCAGAATGCAA-3’，基因產(chǎn)物長度172 bp;內(nèi)參基因GAPDH上游5’-TGGAATCCACT?

GGCGTCTTCAC-3’，下游5’-AGGATGCGTTGC?

TGACAATCTTGA-3’，基因產(chǎn)物長度195 bp。制定實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：使用iQ5 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃預(yù)變性3 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后進(jìn)行熔解曲線分析及相對表達(dá)量分析，△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct;-ΔΔCt=（對照組）ΔCt-各樣品ΔCt。

2.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示：兩兩比較采用成組t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn);多組比較采用ANOVA（LDS）檢驗(yàn)。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 術(shù)后第1天濾過泡情況

術(shù)后各組兔子右眼結(jié)膜稍有充血，角膜清，無混濁水腫，前房內(nèi)無積血，右眼濾過泡，扁平彌散，濾過通暢。見圖1。

3.2? 青光安顆粒劑對Beclin1、LC3B-I、LC3B-II蛋白表達(dá)及LC3B-II/LC3B-I的影響

各手術(shù)組Beclin1蛋白平均表達(dá)量均顯著高于A組（P<0.05），B組Beclin1蛋白平均表達(dá)量顯著高于C組、D組與E組（P<0.05），D組Beclin1蛋白平均表達(dá)量高于C、E組（P<0.05）;各手術(shù)組LC3B-I蛋白平均表達(dá)量均顯著低于A組（P<0.01），B組

LC3B-I蛋白平均表達(dá)量低于C組、D組與E組（P<0.05），D組LC3B-I蛋白平均表達(dá)量低于E組（P<0.05）。各手術(shù)組LC3B-II蛋白平均表達(dá)量均顯著高于A組（P<0.05），B組LC3B-II蛋白平均表達(dá)量顯著高于C、D、E組（P<0.05），D組LC3B-II蛋白平均表達(dá)量高于C、E組（P<0.05）;各手術(shù)組LC3B-II/LC3B-I均顯著高于A組（P<0.05），B組LC3B-II/LC3B-I顯著高于C、D、E組（P<0.05），D組LC3B-II/LC3B-I高于C、E組（P<0.05）。見表1、圖2-3。

3.3? 青光安顆粒劑對Beclin1、LC3B mRNA相對表達(dá)量的影響

各手術(shù)組Beclin1 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于A組（P<0.05），B組Beclin1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組與E組（P<0.05），B組Beclin1 mRNA相對表達(dá)量與D組無明顯區(qū)別（P>0.05）;各手術(shù)組LC3B mRNA相對表達(dá)量均顯著高于A組（P<0.05），B組LC3B mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組與E組（P<0.05），B組LC3B mRNA相對表達(dá)量與D組無明顯區(qū)別（P>0.05）。見表2。

4 討論

目前，GFS是臨床常用的抗青光眼手術(shù)方式之一，其原理是通過人為的建立濾過通道來到達(dá)控制眼壓的目的，但是需要手術(shù)區(qū)的切口不完全愈合才能長久的維持有效濾過，濾過手術(shù)后濾過道瘢痕的增生常常導(dǎo)致濾過手術(shù)的失敗[7]。為此，國內(nèi)外眼科學(xué)者積極致力于青光眼濾過手術(shù)后抗瘢痕藥物的研制。目前，用于青光眼濾過手術(shù)后抗瘢痕的藥物有抗代謝藥、抗凝血類藥物、拮抗生長因子藥物、類固醇與非甾體類抗炎藥和中藥等。中藥相對其他幾種藥物而言，毒副作用相對較小，因此成為了當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

彭清華教授團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)多年研究探索，認(rèn)為青光眼的中醫(yī)核心病機(jī)為“氣陰兩虛，脈絡(luò)瘀滯，玄府閉塞，神水瘀積”[8-10]，“益氣養(yǎng)陰、活血利水”是青光眼的中醫(yī)治療基本大法，并據(jù)此法研制出青光安顆粒劑[11]。該顆粒劑由黃芪、白術(shù)、茯苓、生地黃、地龍、紅花、赤芍及車前子等藥物組成。前期臨床研究表明，青光安顆粒劑可明顯降低眼壓[12-13]，對青光眼術(shù)后濾過功能的長遠(yuǎn)維持有明顯幫助[14]，其4種有效組分均能在小梁切除術(shù)后通過抑制Tenon嚢成纖維細(xì)胞的表達(dá)減少濾過泡瘢痕形成[15]，且未發(fā)現(xiàn)青光安顆粒劑4種有效組分對眼部組織的毒副作用，說明其安全性優(yōu)于傳統(tǒng)藥物，可能成為提高GFS成功率的一個(gè)安全有效的全新藥物。

目前，青光安顆粒劑減少濾過泡瘢痕形成的分子機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)以自噬為切入點(diǎn)，通過檢測自噬相關(guān)靶點(diǎn)蛋白Beclin1、LC3B及其mRNA的表達(dá)，探討了青光安顆粒劑對在自噬水平上對GFS后的抗濾過道瘢痕作用。Western blot檢測顯示：B組與D組瘢痕組織中Beclin1蛋白含量和LC3B-II/LC3B-I明顯升高;RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：B組與D組瘢痕組織中Beclin1 mRNA明顯升高，D組LC3B mRNA相對表達(dá)量雖然高于C組和E組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與LC3B不能靈敏地評價(jià)自噬的發(fā)生有關(guān)。從Beclin1及LC3B-II/LC3B-I表達(dá)結(jié)果來看，青光安顆粒劑與絲裂霉素C均能提高濾過道自噬，從而阻止濾過道瘢痕化。

濾過道的自噬可減少瘢痕組織的形成，而Beclin1、LC3B-I及LC3B-II是瘢痕組織自噬的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，Beclin1可明顯促進(jìn)自噬體膜的形成，是自噬啟動(dòng)的核心分子，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，Beclin1缺乏會導(dǎo)致自噬活性受到明顯抑制[16]。在Beclin1介導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡過程中，LC3B可以為自噬泡膜的延長貢獻(xiàn)作用，最終促使自噬體成熟，LC3B在細(xì)胞內(nèi)分別以LC3B-I和LC3B-II兩種形式存在，LC3B-I是LC3B-II的前體蛋白，活化后即為LC3B-II，因LC3B-II定位于前自噬體和自噬體，其含量與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)，隨自噬體系膜的增加而增加，為了消除測量絕對數(shù)值對結(jié)果的影響，目前，多以LC3B-II/LC3B-I來作為評價(jià)自噬是否正常發(fā)生的指標(biāo)，LC3B-II/LC3B-I在一定程度上代表了細(xì)胞的自噬活性。

綜上，青光安顆粒劑能通過促進(jìn)濾過道組織Beclin1的表達(dá)，提高LC3B-II/LC3B-I比值，誘導(dǎo)瘢痕組織的自噬，從而減少濾過泡瘢痕形成，維持濾過道的通暢。

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