淫羊藿苷調(diào)控血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)抑制大鼠深靜脈血栓形成的機(jī)制*

韓丹 符壯 丁輝

(1.三亞市中醫(yī)院中藥房，海南 三亞 572000；2.三亞市中醫(yī)院藥學(xué)部，海南 三亞 572000；3.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199)

深靜脈血栓(Deep venous thrombosis, DVT)是一種靜脈回流障礙性疾病[1]，常見(jiàn)形成于外科手術(shù)后的制動(dòng)狀態(tài)，多發(fā)于下肢髂股靜脈與腘靜脈。DVT并發(fā)肺栓塞所致的靜脈血栓栓塞癥(Venous thromboembolism, VTE)近年來(lái)已成為心血管疾病致死的主要誘因[2-3]。常規(guī)溶栓及抗凝等治療手段受制于DVT臨床表現(xiàn)滯后、發(fā)病迅速、致死率高等特點(diǎn)[4]，并未取得良好的治療效果，因此DVT的預(yù)防和早期診斷是關(guān)鍵，中醫(yī)藥以其“治未病”、高安全性及低副作用等優(yōu)勢(shì)在臨床預(yù)防DVT中得到了越來(lái)越多的關(guān)注[5]。早在《內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)》中就有“痹在于骨則重，在于脈則血凝而不流”等關(guān)于深靜脈血栓的記錄，現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)DVT發(fā)病機(jī)制將其分型為氣虛血瘀型、脾腎陽(yáng)虛型及濕熱下注型[6]，其中“瘀血”始終貫穿于DVT病發(fā)的始末，臨床辨證論治DVT時(shí)采用的中醫(yī)藥內(nèi)治方也常以清熱利濕、活血通脈為主，并輔以針灸、外敷、熏洗等外治及綜合治療手段。淫羊藿苷(Icariin, ICA)是中藥淫羊藿中主要活性成分淫羊藿總黃酮(Total flavone of herba epimediumon, TFE)的重要組成部分，ICA在心血管疾病中發(fā)揮的潛在降黏解聚、阻滯血瘀、預(yù)防血栓作用受到廣泛研究[7-8]，但其藥理作用及治療機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究通過(guò)探究ICA對(duì)DVT模型大鼠的治療作用及相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)變化，旨在闡明ICA治療DVT的機(jī)制，為中醫(yī)臨床預(yù)防及治療DVT提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取10周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠45只，體質(zhì)量(220±15)g，購(gòu)自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分籠飼養(yǎng)，設(shè)置飼養(yǎng)條件為25℃恒溫，50%～60%恒濕，8∶00～20∶00晝夜輪換。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.1.2 主要材料與試劑 淫羊藿苷(上海純優(yōu)生物，批號(hào)：489-32-7)；戊巴比妥鈉注射液(Merck，批號(hào)：P11011)；生理鹽水(石家莊四藥，批號(hào)：20181011)；APTT、PT、TT及FIB檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：Pc200811，Pc201100，Pc201110，Pc200821)；TM、MCP-1、ICAM-1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司(批號(hào)：E-30971、E-44250、E-05953)；TRIzol(Invitrogen，批號(hào)：15596018)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(TAKARA，批號(hào)：RR047Q、RR036Q)；DEPC水(天根，批號(hào)：BL510A)；qRT-PCR所用引物委托生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組、DVT組及ICA組，每組15只。造模方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[9]，造模前24 h大鼠禁食，稱(chēng)重，以30 mg/kg給予大鼠0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后行仰臥位固定大鼠于操作臺(tái)上。剃毛消毒，沿腹中線(xiàn)切2 cm切口，分離并暴露左腎靜脈以下的下腔靜脈分支至髂總靜脈分叉處，用顯微血管夾分別阻斷該段下腔靜脈分支兩端，保持2 h。透壁可見(jiàn)該段血管顏色變?yōu)榘导t色，25 g細(xì)針穿刺后無(wú)血液流出視為造模成功，血栓形成后取下血管夾關(guān)腹消毒，全程無(wú)菌操作。對(duì)照組大鼠采用相同手術(shù)方法但不給予血管夾結(jié)扎，造模結(jié)束后恢復(fù)大鼠至活動(dòng)狀態(tài)分籠飼養(yǎng)。ICA融于DMSO后用生理鹽水調(diào)節(jié)濃度為40 mg/kg舌下靜脈注射治療ICA組大鼠，對(duì)照組及DVT組大鼠給予等量生理鹽水，淫羊藿苷藥物使用劑量參照文獻(xiàn)報(bào)道[10]，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 大鼠凝血指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥8 h后抽取各組大鼠頸總動(dòng)脈血2 mL，3000 rpm低速離心10 min，分離血漿，測(cè)定3組大鼠活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)以及纖維蛋白原(FIB)含量差異，檢測(cè)方法嚴(yán)格參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 HE染色 取血完成后再次開(kāi)腹截取1～2 cm病變段下腔靜脈，生理鹽水漂洗3次，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中固定8 h或至過(guò)夜，常規(guī)脫水石蠟包埋后行冠狀面切片，切片厚度5 μm。將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上，脫蠟、梯度酒精水化后先后使用蘇木紫和伊紅染液染色，無(wú)水乙醇洗凈后采用苯酚二甲苯與二甲苯封片，中性樹(shù)膠固封，將切片置于光學(xué)倒置 顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 血栓重量檢測(cè) 分離下腔靜脈并在結(jié)扎下方2 cm處夾閉管腔，分離下腔靜脈內(nèi)皮與血栓，取出血栓組織塊，吸除多余水分后天平稱(chēng)重并記錄血栓濕重a(mg)，轉(zhuǎn)移血栓至培養(yǎng)皿中放在干燥器中，室溫干燥24 h后稱(chēng)重并記錄血栓干重b(mg)，比較DVT組與ICA組大鼠血栓質(zhì)量差異。

1.2.5 ELISA檢測(cè)血液中蛋白含量 抽取各組大鼠頸總動(dòng)脈血10 mL于枸櫞酸鈉抗凝采血管中，37℃恒溫水浴0.5 h，2000 rpm低速離心5 min，分離下層血漿。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)3組大鼠血漿中血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)的含量。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè) 取上述血栓樣本置于液氮中快速研磨成粉末，加入1 mL TRIzol充分勻漿粉末，參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入氯仿、異丙醇抽提組織總RNA。核算定量檢測(cè)總RNA濃度后標(biāo)定加入DEPC水調(diào)節(jié)RNA濃度一致，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)總RNA為cDNA，各取100 ng cDNA經(jīng)qRT-PCR定量擴(kuò)增后比較各組大鼠相關(guān)mRNA表達(dá)差異。設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃ 5 min；擴(kuò)增循環(huán)95℃ 1 min，55℃ 2 min，72℃ 1 min，共40次循環(huán)；溶解曲線(xiàn)95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每組樣品設(shè)置3個(gè)平行副孔，GAPDH為內(nèi)參引物，以采集到的熒光信號(hào)Ct值根據(jù)相對(duì)定量法計(jì)算2-△△Ct用來(lái)表示相關(guān)mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 ICA對(duì)DVT大鼠血栓形成的影響 HE染色觀察3組大鼠下腔靜脈內(nèi)血栓形成情況及血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠下腔靜脈管腔通暢，血管內(nèi)皮組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、排列規(guī)則，無(wú)血栓形成(圖1A)；DVT組大鼠靜脈腔內(nèi)可見(jiàn)完全性血栓，血栓與大部分靜脈內(nèi)皮粘連，內(nèi)皮細(xì)胞消失，血管壁出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見(jiàn)血栓與管腔內(nèi)壁存在裂隙，血栓內(nèi)中央?yún)^(qū)域有毛細(xì)血管形成，血栓機(jī)化明顯(圖1B)；ICA組大鼠下腔靜脈內(nèi)血栓萎縮，多為不完全性血栓，血栓組織僅有少部分與血管壁粘連，管腔裂隙間充斥較多紅細(xì)胞，血管壁內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)較為恢復(fù)(圖1C)。剝離血栓塊后比較DVT組與ICA組大鼠血栓濕重和干重的差異顯示，ICA組大鼠血栓濕重及干重均顯著小于DVT組大鼠血栓(P<0.05)，表明ICA能夠抑制血栓形成及管腔內(nèi)病理變化，見(jiàn)表2。

表2 DVT組與ICA組大鼠血栓重量比較

圖1 各組大鼠下腔靜脈HE染色(100×)

2.2 各組大鼠相關(guān)凝血參數(shù)比較 與對(duì)照組相比，DVT組大鼠造模后血漿FIB含量顯著升高，APTT、PT、TT均顯著降低(P<0.05)，DVT組大鼠凝血時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)；與DVT組相比，ICA組大鼠血漿FIB含量顯著降低，APTT、PT及TT時(shí)間升高(P<0.05)，ICA組大鼠凝血時(shí)間較DVT組減少，見(jiàn)表3。

表3 ICA對(duì)模型大鼠凝血參數(shù)的影響

2.3 各組大鼠血漿蛋白表達(dá)差異 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DVT組大鼠靜脈血血漿中TM、MCP-1、ICAM-1蛋白含量均顯著升高(P<0.05)；給予ICA連續(xù)給藥治療7 d后，ICA組大鼠血漿TM、MCP-1、ICAM-1含量較DVT組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 ICA對(duì)模型大鼠血漿TM、MCP-1、ICAM-1蛋白表達(dá)影響

2.4 各組大鼠血栓組織中相關(guān)mRNA表達(dá)差異 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ICA組大鼠血栓中給予ICA連續(xù)給藥治療7 d后，ICA組大鼠血栓中TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)較DVT組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 討論

ICA在早期的藥理學(xué)研究中被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗腫瘤、抗組織損傷，促進(jìn)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)及性功能恢復(fù)等廣泛作用[11]，同時(shí)近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明ICA對(duì)心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用，其在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌缺血及心力衰竭中的作用及分子機(jī)制被逐一揭示[12]，但其治療DVT的作用機(jī)制仍尚不明確。另一方面，血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)作為DVT發(fā)生發(fā)展中重要的標(biāo)志分子[13]，TM的異常表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和體內(nèi)抗凝水平相關(guān)，現(xiàn)已被證明參與包括PI3K/AKT、FGFR1/FRS2α在內(nèi)的多種信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈慢流等心腦血管疾病的治療作用[14-15]，是近年來(lái)衡量多種疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。歷代中醫(yī)對(duì)DVT的病機(jī)及治療均有精辟的論述，并形成了辨證論治、專(zhuān)病專(zhuān)方、內(nèi)外兼顧的治療方法。ICA作為中藥中成分療效較為明確的一種藥劑，自《神農(nóng)本草經(jīng)》中始載入冊(cè)后，《本經(jīng)》、《別錄》、《日華子本草》及《醫(yī)學(xué)入門(mén)》等書(shū)籍中先后記載了其在生殖、骨關(guān)節(jié)、呼吸系統(tǒng)、抗炎癥和抗腫瘤中的突出作用，近年來(lái)更是在心血管疾病的治療中受到廣泛的重視，逐步完善并形成了ICA的藥理作用機(jī)制及臨床用藥方法。

本研究通過(guò)觀察ICA治療DVT模型大鼠過(guò)程中TM的表達(dá)變化，進(jìn)一步解釋了ICA治療DVT的分子機(jī)制。首先通過(guò)解剖分離局部血栓及對(duì)內(nèi)皮和血栓組織切片的染色觀察，結(jié)果顯示造模7 d后DVT組大鼠血栓內(nèi)部出現(xiàn)顯著機(jī)化，中央?yún)^(qū)域形成新生血管再通，下腔靜脈血栓內(nèi)形成完全性血栓，表明大鼠DVT模型建立有效，而給予ICA治療能夠顯著緩解血栓形成及血栓栓塞局部大小和質(zhì)量，表明ICA能夠抑制大鼠深靜脈血栓的形成。那么ICA對(duì)DVT治療的作用機(jī)制又是什么呢？現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為血栓形成是由血流緩慢、血管壁損傷及血液的高凝狀態(tài)三種治病因素綜合作用而形成的，其中尤以凝血異常最為關(guān)鍵，由此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了ICA對(duì)模型大鼠凝血參數(shù)的影響，結(jié)果顯示ICA能夠有效延長(zhǎng)DVT大鼠APTT和TT，查閱以往文獻(xiàn)我們猜測(cè)ICA可能是通過(guò)抑制內(nèi)源性凝血因子的活性抑制纖維蛋白生成進(jìn)而發(fā)揮其內(nèi)源性抗凝作用[16]，此外ICA能夠延長(zhǎng)大鼠的PT，PT的大小常反應(yīng)外源性凝血因子的活性[17]，提示ICA能夠通過(guò)抑制外源因子活性干擾纖維蛋白原(FIB)向纖維蛋白的轉(zhuǎn)化，這一結(jié)果也在進(jìn)一步對(duì)靜脈血中FIB含量的檢測(cè)中得到印證，給予ICA治療7 d后大鼠體內(nèi)FIB含量較DVT組顯著降低，體內(nèi)FIB存在向纖維蛋白的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化，F(xiàn)IB含量降低說(shuō)明ICA能促進(jìn)纖維蛋白轉(zhuǎn)化增加，血漿中凝血因子含量增加近一步增強(qiáng)大鼠抗凝能力。此外，HE染色結(jié)果顯示DVT組大鼠血管內(nèi)皮組織出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量研究表明由凝血異常等動(dòng)態(tài)因素造成的深靜脈血栓臨床常見(jiàn)的腫脹、疼痛的發(fā)生與組織內(nèi)部炎性損傷相關(guān)，同時(shí)炎性損傷與凝血異常間也存在著緊密聯(lián)系，這里我們首先檢測(cè)了TM的含量變化?；谏鲜鯥CA可能的對(duì)內(nèi)外源凝血反應(yīng)的抑制作用，TM作為凝血酶-TM-蛋白C(PC)復(fù)合物中重要的組成部分[18]，ICA對(duì)TM的表達(dá)調(diào)控進(jìn)一步解釋了ICA的體內(nèi)抗凝機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，ICA能夠顯著降低DVT大鼠血漿TM的含量，TM的減少促進(jìn)了凝血酶活化FIB的能力，由此提高血漿中纖維蛋白的含量，與上述結(jié)果一致，提示ICA可能通過(guò)調(diào)控TM促進(jìn)抗凝因子的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮治療DVT的作用。另一方面，證據(jù)表明血漿中MCP-1、ICAM-1等炎性因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與TM的異常表達(dá)相關(guān)，MCP-1、ICAM-1作為炎癥細(xì)胞激活和游走趨化過(guò)程的重要分子，ICA能夠顯著降低二者的表達(dá)并抑制血栓組織中TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA的合成，結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)ICA能夠在多種疾病模型中發(fā)揮促進(jìn)SIRT6表達(dá)、抑制TM及NF-κB信號(hào)通路下游靶基因活化的作用[19-20]，而ICAM-1、MCP-1又是NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，提示我們ICA可能通過(guò)調(diào)控TM在DVT發(fā)病過(guò)程中介導(dǎo)NF-κB相關(guān)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄抑制，從而發(fā)揮對(duì)DVT模型大鼠抑炎、抗凝的綜合治療作用。

4 結(jié)論

淫羊藿苷能夠抑制深靜脈血栓大鼠深靜脈血栓的形成，其作用機(jī)制與調(diào)控血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，抑制下游凝血及炎性因子的活化有關(guān)，為闡明淫羊藿苷治療深靜脈血栓的作用機(jī)制提供了有力的證據(jù)。